Summary
Murine linksventrikulären Papillarmuskeln können verwendet werden, um Herzkontraktilität in vitro untersucht werden. Dieser Artikel beschreibt im Detail die Isolierung und experimentelle Protokolle, um die Herzkontraktionseigenschaften zu studieren.
Abstract
Papillarmuskel aus adulten Mäuseherzen isoliert verwendet werden, um Herzkontraktilität während verschiedene physiologische / pathologische Zustände zu untersuchen. Die kontraktilen Eigenschaften unabhängig von äußeren Einflüssen wie Gefäßtonus oder neurohumoral Status ausgewertet. Es zeigt einen wissenschaftlichen Ansatz zwischen Einzelzellmessungen mit isolierten Herzmuskelzellen und in vivo Studien wie Echokardiographie. So Papillarmuskel Präparate dienen als ein hervorragendes Modell, um Herzphysiologie / Pathophysiologie zu studieren und kann für Untersuchungen wie die Modulation durch pharmakologische Mittel oder die Erforschung der transgene Tiermodelle verwendet werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung des murinen linken vorderen Papillarmuskel zu Herzkontraktilität in einem Organbad Setup zu untersuchen. Im Gegensatz zu einer Muskelstreifen Zubereitung aus der Herzkammerwand getrennt, kann der Papillarmuskel in toto, ohne die Muskel tissu vorbereitet werdenE streng. Das Organbad Setup besteht aus mehreren temperaturgesteuerten, vergast und Elektroden ausgestattete Organbad Kammern. Isoliertes Papillarmuskel wird im Organbad Kammer befestigt und elektrisch stimuliert. Die hervorgerufene Zuckungskraftmessungen wird mit einem Druckaufnehmer und Parameter wie Zuckungskraftmessungen Amplitude und twitch Kinetik analysiert werden aufgezeichnet. Verschiedenen Versuchsprotokollen durchgeführt werden kann, um die Calcium- und frequenzabhängige Kontraktions sowie Dosis-Wirkungskurven von kontraktilen Mittel wie Katecholaminen oder anderen Arzneimitteln zu untersuchen. Zusätzlich können pathologische Zustände wie akute Ischämie simuliert werden.
Introduction
Die Untersuchung von Proteinen, wie Ionenkanäle beziehen ihre Rolle für die Kontraktilität des Herzens ist wichtig, verschiedene Pathomechanismen zu entdecken und neue therapeutische Strategien für Herzerkrankungen wie Ischämie und Herzversagen etablieren.
Kontraktile Funktion Säugerkardiomyocyten ist bekannt, durch verschiedene Ionenkanäle, Transporter und andere Proteine moduliert werden. Aktionspotential ausgelöst Aktivierung der spannungsabhängige sarkolemmalen L-Typ-Ca 2+ Kanälen führt zu Ca 2+ Einstrom von extrazellulären Raum und anschließend an Ca 2+ -induzierte Ca 2+ Freisetzung (CICR) 1, die zelluläre Kontraktions 2 auslöst. Ca 2+ -signaling eine zentrale Rolle bei der kardialen Kontraktilität und Anpassung an physiologische oder pathologische Stress spielt. Katecholamine aktivieren kardialen β-adrenergen Rezeptoren, so anregend Adenylylcyclase (AC), die cAMP synthetisiert. Aktiviert, protein Kinase A (PKA) phosphoryliert verschiedene intrazelluläre und membranassoziierten Proteinen, wie L-Typ-Ca 2+ -Kanälen, Phospholamban und Ryanodinrezeptoren was Modifikation Ca 2+ Transienten und Herzkontraktilität 1,3,4. cAMP wird von Phosphodiesterase (PDE) abgebaut wird. Aktivierung anderer als β-Adrenozeptoren Gs-gekoppelter Rezeptoren führt auch zu einer Akkumulation von cAMP.
Die Technik der Kontraktilität Messungen in isolierten ventrikulären Muskel-Streifen ist gut für größere Säugetierarten 5-8 etabliert. Bezogen auf die Möglichkeit, das Gen-Targeting in Mäusen ist es wichtig, Methoden zu ermitteln und murine Herzphysiologie analysieren. Unterscheiden sich jedoch vorhandenen Daten über die physiologischen Eigenschaften isolierter Muskelpräparate Mäuse auf experimentellen Bedingungen 9-12 variiert.
Das beschriebene Verfahren wird verwendet, um die Herzkontraktionsfähigkeit des linken Ventrikels Papillarmuskel pre analysierenPräparate in vitro. Untersuchung der Herzkontraktilität in Abwesenheit von Einflüssen Modifizieren Herzkontraktilität in vivo, wie Blutdruck, neurohumoral Stimulation und physikalischen oder metabolischen Stress durchgeführt. Die Schlagfrequenz des öffentlichen Muskel-Präparat kann streng definiert und beliebig verändert werden. Zuckungskraftmessungen kann im Kontext von spezifischen Stimuli wie Calciumkonzentration, Schlagfrequenz oder Temperatur analysiert werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet, um verschiedene Signalweg Komponenten zu untersuchen und die Herzleistung von genetisch veränderten Mausmodellen durch Steuern oben erwähnten Versuchsbedingungen zu vergleichen.
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Protocol
HINWEIS: Die Grundschritte des Isolationsverfahren sind in Abbildung 1 dargestellt Alle Schritte werden ausführlich in dem folgenden Protokoll beschrieben.. Papillarmuskel Isolation, Montage im Organbad Kammer, Erfassung und Auswertung wird in einer fortlaufenden und obligatorische Zeitskala durchgeführt.
Alle Tierversuche wurden nach den deutschen Rechtsvorschriften über den Schutz von Tieren durchgeführt und wurden von der Ethikprüfung Board of Universität Heidelberg genehmigt.
1. Vorbereitung der Besetzung
- Für Kontraktionsmessungen verwenden eine Mehrkammer Organbad Setup. Komponenten einer ex vivo Kontraktilität Organbad Einrichtung sind in Abbildung 2 dargestellt.
HINWEIS: Um die Zeitspanne zwischen der Herstellung der Papillarmuskel und dem Beginn der Versuchsprotokoll, einzurichten Geräte minimieren und vor vorzubereiten Puffer, um das Sammeln experimenteller tissue.This provides die größte Menge an Zeit, die das Gewebe lebensfähig bleibt, um Experimente durchzuführen. - Starten Sie Computer und Datenerfassungsgeräte. Schalten Sie Organbad Wärme (Werkseinstellung auf 32 ° C) und lassen Einheiten voreingestellte Temperatur.
- Bereiten Sie den Erfassungsgeräten. Starten Sie die Aufnahme-Daten als im Softwarehandbuch erwähnt.
- Prüfen und Durchführung der Kalibrierung (falls erforderlich) auf jedem Kanal und Null alle Kanäle, die von den jeweiligen Kraftwandler (mit dem Kanal zugeordneten) zugeführte elektrische Signal zu einem von einem zertifizierten Gewichts versorgt 2-g-Kraft zu standardisieren.
- Schalten Sie Gasversorgung (95% O 2/5% CO 2) um Organbad Kammern. Kontinuierlich Gas alle Kammern während der gesamten Protokoll-Messungen.
2. Herstellung von Puffern und physiologischen Lösungen
- Vorbereitung einer Krebs-Henseleit-Pufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 119 mM NaCl zu erreichen; 25 mM NaHCO 3; 4,6 mM KCl; 11 mM Glucose; 1 mM Na-pyruvate; 1,5 mM CaCl 2; 1,64 mM MgSO4; 1,18 mM KH 2 PO 4 und pH-Wert auf 7,4 (siehe Tabelle 1 Physiologische Lösung).
- Bereiten separaten Krebs-Henseleit-Pufferlösung, um während der Isolierung zu verwenden, wie in Schritt 2.1 mit zusätzlichen 30 mM 2,3-Butan Monoxim (BDM) und 50 IE Heparin / ml beschrieben. Coole Lösung auf 4 ° C (siehe Tabelle 1: Herstellung Lösung). Ischämie Simulation vorbereitet Ischämie-Lösung, wie in Tabelle 1 beschrieben.
- Für das Protokoll des Ca 2 + - abhängigen Kontraktilität, fügen Ca 2+ zu der Krebs-Henseleit-Pufferlösung zu angeforderten Endkonzentration.
HINWEIS: bereiten diese Lösungen direkt vor seiner Verwendung und Gass mit Carbogen um die Ausfällung von Calciumcarbonat zu vermeiden. Vorwärmen Lösung auf 32 ° C vor dem Gebrauch.
3. Herstellung der Begasungsrohr und Dissection Dish während des Papilläre Excision Procedure verwendet
- Schließen Sie einen weichen Gassingen Rohr (Außendurchmesser 2-4 mm) auf den Gasanschluss (100% Sauerstoff, Carbogen alternativ) mit Expertenarbeits.
- Erstellen Sie einen geschlossenen Ring der Begasung Rohrverbindung innerhalb der Dissektion Gericht. Punktion der Vergasungsrohr mehrmals, dass ein kontinuierlicher Blasenbildung gewährleistet ist. Diese Begasungsrohr kann mehrmals verwendet werden.
- Vorbereitung Dissektion Schale mit einem Silikonelastomer an der Unterseite (0,5 cm dick), so dass die Stifte in sie gesteckt werden. Dieses Gericht kann mehrmals verwendet werden.
4. Isolierung des linken vorderen Papillarmuskel von Mäusen
HINWEIS: Vor dem Start der Isolierung der Papillarmuskel, überprüfen, dass die Gasleitungen frei von Blockaden.
- Bereiten Organbad Setup wie im Protokoll Abschnitt 3.1 erwähnt, bevor die Vorbereitung der Papillarmuskeln. Bereiten alle Lösungen am Tag des Experiments.
- Opfern Sie die Maus (ungefähr 8-12 Wochen alt) durch Genickbruch according Expertenarbeits und institutionellen Richtlinien.
- Befestigen Sie das Tier in Rückenlage durch Fixierung Vorderpfoten und Hinterpfoten auf einer Dissektion Bord, öffnen Sie die Thoraxseiten auf beiden Seiten durch Schneiden durch die Rippen mit scharfen Knochen Schere, schneiden Sie dann die Membran mit einem Querschnitt. Entfernen Sie den Herzbeutel. Nun das Herz und die Aorta sind zugänglich.
- Befestigen Sie das Herz mit stumpfen Pinzette auf das Gefäß truncus der Nähe des Herzens und trennen Sie die Herzen schnell mit einer Schere aus der Lunge und dem umgebenden Gewebe.
- Übertragen Sie das schlagende Herz in eine Petrischale mit gekühlten Präparationslösung mit Sauerstoff (Schritt 2.2) vergast gefüllt. Lassen Sie das Herz zu schlagen und zu stimulieren Herzkontraktionen sanft über Berührung der Herzspitze mit einer Pinzette.
- Sobald das Herz ist völlig exsanguinous, überträgt es auf die Dissektion Gericht mit gekühlten Präparationslösung (Schritt 2.2) gefüllt und mit O 2 begast. Von diesem Schritt auf den Einsatz ein Stereomikroskop.
- Befestigen Sie das heaRT mit einem kleinen Stift durch die rechte Herzkammer, so dass das Herz von dorsal gesehen (rechte Ventrikel auf der rechten Seite aus Sicht des Bedieners befindet).
- Mit Hilfe mikrochirurgischen Schere trennen die beiden Atrien auf der AV-Ebene, schneiden Bindegewebe von den Ventrikeln und entsorgen. Führen einen Schnitt durch die Kammerwand von der AV-Ventil-Pegel auf den Apex des Herzens Vermeidung jeglicher mechanischen Druck.
- Öffnen Sie die Herzkammer und befestigen Sie den linksseitigen freien Wand mit einer Pinzette, damit er einen Blick auf beide linksventrikulären Papillarmuskeln.
- Die ventrikuläre Gewebe lateral auf beiden Seiten der linken vorderen Papillarmuskel Erhaltung eines Teils der Klappensegel am Papillarmuskel Vorbereitung etwas weggeschnitten und berühren oder Dehnen der Papillarmuskel so viel wie möglich. Präparieren Sie die restlichen Ventrikelwand Gewebe aus dem Papillarmuskel.
- Bringen Seidenfaden (7/0, metrisch 0,5) auf beiden Seiten der Papillarmuskel preptung, eine auf der Klappensegel und eine auf der Muskelteil. Befestigen Sie die Zubereitung in das Organbad Kammer mit Organbad Lösung gefüllt und mit Carbogen begast, wie Temperatur 32 ° C empfohlen.
5. Equilibrierung und Stimulation der Papillarmuskel
- Stimulieren die Papillarmuskel Zubereitung mit Rechteckimpulsen (Dauer 2 ms und einem Strom von 100 mA) bei Anregungsfrequenz von 1 Hz sofort nach der Fixierung im Organbad.
- Stellen Sie sicher, einen häufigen Wechsel der Organbad Lösung, entweder durch kontinuierliche Veränderung oder durch häufige manuelle Wechsel (alle 5 min) nach dem Aufbau der Organbad-Typ verwendet.
- Schrittweise Erhöhung der Vorspannung bis zum maximalen Zuckungskraft in erreicht. Maximalen Zuckungskraft ist erreicht, wenn die Erhöhung der Vorspannung wird von einer weiteren Steigerung in der Zuckungskraftmessungen gefolgt.
- Nach 45-60 min Äquilibrierungspuffer, starten Sie den Versuchsprotokoll.
HINWEIS: Das Versuchsprotokoll unten beschrieben umfasst Standardmanöver, um Herzkontraktilität unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu charakterisieren. In der repräsentativen Abschnitt beschreiben wir diese Protokolle im Detail zeigt auch repräsentative Ergebnisse (siehe auch Tabelle 2).
- Erfassung und Auswertung der Versuchsprotokolle
- Für die Aufnahme sollten Sie eine geeignete Software mit ausreichender zeitlicher Auflösung (Erfassungsrate ≥ 1 kHz).
- Analysieren Parameter einschließlich Zuckungskraftmessungen Amplitude (Höhe), Zeit, Spannung (TTP) und halbe maximale Relaxationszeit (R 50 / tfall, respectively), wie in der Software-Programm erwähnt (als Beispiel Abbildung 5.5 ADInstruments, siehe Abbildung 4) ihren Höhepunkt erreichen.
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Representative Results
Das Protokoll des Manuskripts für die Kontraktilität Messungen von isolierten Maus-Papillarmuskel Zubereitungen wird, um optimale Bedingungen abgestimmt, um reproduzierbare Versuchsergebnisse unter physiologischen Bedingungen zu erreichen. Um eine optimale Versuchsbedingungen definieren wir geführt Pilotversuche unterschiedlicher Organbad Temperatur und extrazellulären Calcium-Konzentration (siehe auch 12). Das hier beschriebene Protokoll wurde mit einer extrazellulären Calciumkonzentration von 1,5 mm und einer Temperatur von 32 ° C durchgeführt.
Basalen Kontraktionseigenschaften
Um basalen Kontraktilität Eigenschaften, Parameter für Zuckungskraftmessungen Amplitude zu charakterisieren, zucken Frequenz, Zeit bis zum Peak (definiert als die Zeit, die zum ausgehend von 5% basalen maximale Kontraktionskraft zu erreichen) und Entspannung 50 Zeit (halbe maximale Relaxationszeit; definiert als Zeit erforderlich erreicht die Hälfte der Entspannung Kraft) werden in diesem Protokoll verwendet. Eine repräsentative Spur von twJucken und die Analyse dieser Parameter werden in Figur 3A-B dargestellt ist.
Calcium-abhängigen Kontraktilität
Extrazelluläre Calciumkonzentration entscheidend bestimmt kardialen elektromechanischen Kopplung und durch Variieren dieser Parameter kann die Calciumempfindlichkeit des kontraktilen Apparates in Kardiomyozyten ausgewertet werden. Wie in 3C die Vermehrung der extrazellulären Calciumkonzentration resultiert in veränderten Calciumtransienten und danach in veränderter Zuckungskraftmessungen Generation gezeigt. Das Calcium-Konzentration des extrazellulären Lösung erhöht Schritt-für-Schritt (dh zwischen 1,5 bis 7 mm). Durch die Anwendung dieses Protokolls kann die Calcium-Homöostase bezüglich der Calcium-abhängigen Kontraktilität des kontraktilen Apparates ausgewertet werden. In dem Organbad Setup in dieser Handschrift verwendet wurde, wurde die Veränderung der extrazellulären Kalziumkonzentration durch Änderung der Organbad solut durchgeführtIonen manuell auf eine kurze Unterbrechung der Stimulation zu einer künstlichen postrest Potenzierung führen und in der Folge (siehe Waffen Potenzierung nach nicht-Stimulationsintervall).
Kraft Potenzierung nach nicht-Stimulationsintervall (PRP)
Am Ende eines Kontraktionszyklus Calcium in sarko Retikulum (SR), das hauptsächlich durch eine ATP-abhängige Calciumpumpe (SERCA, sarco-endoplasmatischen Retikulum calcium ATPase) maskiert, wodurch eine Senkung der cytosolischen Calciumkonzentration während der Diastole. Wenn das Zeitintervall zwischen zwei Kontraktionen vergrößert ist, können mehr Calcium in die SR gepumpt werden und in der Folge mehr Kalzium kann während des nächsten Erregungs freigegeben. Die postrest-Potenzierung Protokoll (PRP) beschreibt Veränderungen des zuckenden Kraftamplitude nach einer vorherigen Stimulation mit Ruhezeit von einer definierten Laufzeit. In Mensch, Ratte als auch in murinen Herzgewebe, eine Vermehrung des Zuckungskraftmessungen wurde gezeigt, 10,12-14,16 (
Frequenzabhängige Kontraktilität (FFR)
Kraft-Frequenz-Beziehung beschreibt die Korrelation zwischen Schlagfrequenz und Kontraktions Zuckungskraftmessungen (Bowditch-Effekt) 18. Die Kraft- Frequenzbeziehung deutlich unterscheidet zwischen Säugetierarten und experimentellen Bedingungen 19. Bei Mäusen wurde eine bestimmte Korrelation zwischen der Schlagfrequenz und Kontraktionsstärke gezeigt. Bei 32 ° C wurde eine erste Negativ FFR zwischen Stimulationsraten von 0,1-1 Hz dargestellt, wohingegen die FFR wurde gezeigt, positive im Bereich von 1-4 Hz Stimulation 9-12 (3E) zu sein.
In Ermangelung myocardium eine negative Korrelation zwischen Schlagfrequenz und Kontraktilität beschrieben 20,21. In diesem Manuskript wird die Standardschrittmacherfrequenz (1 Hz) und 0,1 Hz verringert wird und von dort ausgehend wird die Schrittmacherfrequenz inkrementell bis 5 Hz erhöht (0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5 Hz).
& bgr; -adrenerge Stimulation
Katecholamine wie Adrenalin und Noradrenalin sind Hormone, die während (patho-) physiologischen Stressbedingungen Modulation der Herzkontraktionskraft durch die Aktivierung der β-Adrenozeptoren freigesetzt werden. Iatrogene Anwendung der Katecholamine spielt eine herausragende Rolle in der klinischen Behandlung von Patienten mit akuter Herzinsuffizienz Herz Inotropie vorübergehend zu erhöhen. Dieser Effekt ist auch zu erkennen, und in in vitro-Studien untersucht werden. Als ein Agonist des β-Adrenozeptoren, erhöht Isoprenaline Kontraktions Zuckungskraftmessungen. In vivo, eine Erhöhung der Schlagfrequenz tritt auch (positiv inotrope Wirkung), diezusätzlich moduliert die Kontraktionsreaktion (Bowditch Sinne auch oben beschrieben FFR-Protokoll). Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren kann die inotrope Wirkung von Isoprenalin zu einem festen Schlagfrequenz, ohne dass chronotrope Wirkung (3F) untersucht werden. Die Stimulation der β-Adrenorezeptoren kann auch von anderen Hormonen, wie Histamin erreicht werden. In Maus-ventrikuläre Gewebe, Anwendung von Histamin Ergebnisse in einem Zweiphasenreaktion, die eine anfängliche positive inotrope Wirkung enthalten, aber mit einem vorübergehenden Rückgang der Zuckungskraftmessungen wie in 3G gezeigt. Aus diesem Grund scheint eine Interpretation der Daten, die durch Anwendung von Histamin gemessen schwierig zu sein; besonders die zugrundeliegende Rezeptoraktivierung in Mäusen, nicht vollständig gelöst.
Ischämischen Bedingungen
Akuter Herzischämie als kritische Beschränkung des Blutflusses, was zu Unterversorgung des Herzgewebes mit Sauerstoff definiert ist undNährstoffe was zum Verlust der Kontraktionsfähigkeit, der Entwicklung der ischämischen Kontraktur und Zelltod. Ischämie in vitro zu simulieren, werden die Muskeln für 30 min ausgesetzt, um Glucose- und Pyruvat freier extrazellulärer Lösung geleitet und mit 95% N 2/5% CO 2. Bei diesem Ansatz eine Abreicherung von ATP in den Kardiomyozyten ausgelöst werden soll. Innerhalb von wenigen Minuten nach dem Beginn der Ischämie-Simulation, ein Rückgang der Zuckungskraftmessungen tritt bei Auftreten eines ischämischen Kontraktur als spontane Erhöhung der Vorspannspannung (Abbildung 3H) abgebildet.
Tabelle 1: Die Komponenten und die Konzentrationen der verwendeten Pufferlösungen.
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Tabelle 2: Liste der vorgeschlagenen experimentellen Protokolle Herzkontraktilität in isolierten Papillarmuskel Präparate zu untersuchen.
Abbildung 1. Die wichtigsten Schritte der Papillarmuskel Vorbereitung. (A) Dissection der beiden Vorhöfe. (B) Auf der linksventrikulären vorderen Papillarmuskels. (C) Präparation der Papillarmuskel von der Kammerwand. (D) Die Befestigung der beiden Seidenfäden vor der Fixierung im Organbad Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. Organbad Setup. (A) Schematische Einstellung des Organbad Setup. Wassermantel Organbad Kammern mit Belüftung Glasfritten ausgestattet stabile Temperaturregelung. Um Rechteckimpulse zu generieren Feldelektroden mit dem Gewebe Träger gebunden ist. Kraftsensor erfasst die Kontraktion des Muskels, wodurch das erzeugte Signal zu verstärken. Dieses Signal wird gefiltert und durch einen A / D-Wandler zurück zu dem Computer übertragen werden. Das Signal wird dann digitalisiert und für eine spätere Analyse gespeichert werden. (B) Bild von einem einzigen Papillarmuskel Vorbereitung in das Organbad Kammer von dem Organbad Setup (C) festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse der Kontraktionsmessungen von murinen linken vorderen Papillarmuskeln. (A) Repräsentative Analyse Zuckungskraftmessungen Amplitude, Zeit, um die Spannung (TTP) und halbe maximale Relaxationszeit (R 50) aus einem einzigen zucken ihren Höhepunkt erreichen. Repräsentative Aufnahmen stimuliert Zuckungen von murinen Papillarmuskel Präparate unter basalen Stimulation mit einer Schlagfrequenz von 1 Hz (B), während der zunehmende extrazellulären Calciumkonzentrationen (C), während der definierten Ruheintervalle (post Rest Potenzierung, PRP) (D), oder verschiedene Stimulationsraten (Kraft-Frequenz-Relation, FFR) (E) und nach der Anwendung steigender Konzentrationen von Isoprenaline- (F) oder Histamin-Applikation (G). Repräsentative Aufzeichnung stimuliert Zuckungen und Vorspannung während der Ischämie-Stimulation (H).s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Analyse der Kontraktionsparameter. Zur Charakterisierung Kontraktionsfunktion, Parameter einschließlich Zuckungskraftmessungen Amplitude (Höhe), Zeit, Spannung (TTP) ihren Höhepunkt erreichen und die Hälfte der maximalen Relaxationszeit (R 50 / tfall, beziehungsweise) sind in diesem Protokoll mit Hilfe der Software analysiert Programmtabelle 5.5 (ADInstruments). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir ein Verfahren, um die Kontraktilität von murinen Papillarmuskel in vitro, die verwendet werden können, um mehrere wissenschaftliche Fragen zu Herz Physiologie und Pathologie in Mäusen zu beantworten und um die Analyse der transgenen Linien und die Entdeckung von neuen pharmazeutischen Ansätze unterstützen untersuchen Herzfunktionsstörungen zu behandeln. Wir veranschaulichen die Anwendung dieser Methode auf physiologische, pathologischen und pharmakologischen Eigenschaften von Herzmuskelkontraktionsfähigkeit zu bewerten (siehe 3). Zusätzliche Anwendungen hier nicht dargestellt sind: Bewertung der intrazellulären Signalwege mit unterschiedlichen pharmakologischen Mitteln (siehe auch 12).
Herzerkrankungen wie koronare Herzkrankheit und Herzinsuffizienz zeigen eine bedeutende klinische Problem und bleibt die führende Ursache für Morbidität und Mortalität weltweit 22. Für viele Proteine im Herz, ist ihre Rolle bei der Herzkontraktilität Still schlecht verstanden oder nicht, bis jetzt untersucht. Die Kontraktionsmessung an isolierten Papillarmuskeln zeigt eine sinnvolle und gültige Ansatz zur Herzkontraktilität in vitro in Mausmodellen zu studieren.
Obwohl das Verfahren technisch möglich und zeigt eine gute Reproduzierbarkeit, gibt es mehrere wichtige Schritte erforderlich sind, um den Erfolg zu gewährleisten: Erstens, nach der Isolierung des Herzens, sorgen für eine Blutfreie Lösung bei der Herstellung vor, um der Lage, richtig (Visualisierung) zu arbeiten. Ein weiterer wichtiger Schritt ist, dass Gewebepräparation wird sorgfältig durchgeführt, um die Lebensfähigkeit durch Vermeidung jeder Berührung oder Dehnung der Papillarmuskel zu gewährleisten. Wie im Methodenteil beschrieben versuchen, die Herzklappensegel an den Papillarmuskel verbunden zu halten, um einen störungsfreien Befestigung der Seidenfaden zu gewährleisten. Nach der Fixierung der Zubereitung in das Organbad Kammer, mehrmals zu ändern Organbad-Lösung während der ersten Minuten zu spülen, die BDM. Increase die Vorspannung der Vorbereitung leicht und nach und nach, bis keine weitere Zunahme der Zuckungskraftmessungen auftritt. Es gibt einige Ausschlusskriterien für die Bewertung der einzelnen Protokolle wie arrhythmischen Schläge und spontaner Anstieg der Vorspannung als Zeichen für ischämische Zustände. Mehreren experimentellen Protokollen wie postrest Potenzierung und kraftFrequenzBeziehung mit dem gleichen Präparat Probe durchgeführt werden, während ein neues Präparat Probe soll für die Analyse von Drogen-vermittelte Wirkungen auf die Kontraktilität verwendet werden. Die Vorschrift ist optimiert, um den linken vorderen Papillarmuskel zu isolieren. Anpassung des Protokolls, kann auch die hintere Muskel für diese Methode der Kontraktionsmessungen eingesetzt werden.
Diese Methode der isolierten Papillarmuskel Messung liefert verschiedene Informationen über die Calcium-, temperatur- und frequenzabhängig Kontraktilität sowie über die Kontraktionsreaktion nach der Anwendung pharmakologische Wirkstoffe oder die SIM-lation von pathologischen Zuständen. Die Interpretation und Hochrechnung dieser Ergebnisse muss jedoch mit wissenschaftlicher Sorgfalt behandelt werden. Das beschriebene Verfahren ist ein in vitro Modell des Herzmuskels aus ihrer normalen Umgebung und neuronale Innervation getrennt. Daher sind die experimentellen Bedingungen nicht physiologisch und die in diesem Protokoll empfangen Ergebnisse nicht ohne vertiefte Interpretation der Situation in vivo übertragen werden kann. Zum Beispiel erfordert das Verfahren nicht berücksichtigt Veränderungen im Blutdruck, Hormone oder extrinsischen neuronalen Kontrolle zu übernehmen. Die Zufuhr von Sauerstoff und metabolische Ergänzungsmittel für die Herstellung in dem Organbad durch Diffusion begrenzt. Eine unzureichende Versorgung mit Sauerstoff und Stoffwechselergänzungsmittel würde ischämischen Bedingungen und anschließend ungültig experimentellen Ergebnissen führen. Um dies zu vermeiden, sollten die Versuchsbedingungen optimal, insbesondere hinsichtlich Oxygenierung Calciumkonzentration und der Temperatur des Organs Badlösung.Mit den Versuchsbedingungen des hier beschriebene Protokoll kann gültige Ergebnisse gewährt werden.
In diesem Manuskript ein Verfahren zum Simulieren von Ischämie-ähnlichen Bedingungen beschrieben. Zusätzlich zur Simulation von Hypoxie wurden alle energetische Ergänzungen der Organbad Lösung verbraucht, um die Ischämie-Zustand in vivo so gut wie möglich zu imitieren. Im Gegensatz zu Hypoxie wurde gezeigt, dass die gleichzeitige Sauerstoffmangel und der Energieversorgung führt zu Veränderungen in Calciumtransienten vergleichbare Veränderungen in vivo 23 zu sehen.
Die für die Isolierung von Maus-Papillarmuskel beschriebene Verfahren kann auf andere Spezies, zB Ratten angepaßt werden. Allerdings sind die optimalen Bedingungen des Organbad Setup konnte zwischen verschiedenen Tiermodellen variieren und können angepasst werden. Parameter, die angepasst werden müssen kann, sind die Temperatur und die Calciumkonzentration der physiologischen Lösung.
In summary, bietet diese Kontraktionsmethode ein sehr leistungsfähiges Konzept für Herz Physiologie, Pathophysiologie und Pharmakologie zu bewerten. Wenn sie richtig eingesetzt, bietet es die Möglichkeit, Herzkontraktilität in einem isolierten, aber gut kontrollierten Umgebung zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (KFO 196 "Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Remodelling-Prozessen", FR 1638 / 1-2) und vom DZHK (Deutsches Zentrum für Kreislaufforschung, einem Teil der German Centres of Health Research , die eine BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung) Initiative) ist.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P 5655 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Hazard statement H 302, solve in DMSO |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Hazard statement H 315-H319-H335 |
| Sodium Heparine 250.000 IE/10 ml | ratiopharm | PZN 3874685 | |
| Histamine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | H7250 | Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335 |
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