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Immunology and Infection

रीयल टाइम में anaesthetized चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा Mesenteric रगों में न्यूट्रोफिल और monocytes इमेजिंग

Published: November 16, 2015 doi: 10.3791/53314
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology and Immunology, University of Geneva

Abstract

कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संक्रमण या चोट की साइट के लिए रक्त ल्यूकोसाइट्स का तेजी से लामबंदी पर निर्भर है। Vivo में ल्युकोसैट प्रवास की जांच कर संवहनी अन्तःचूचुक साथ ल्युकोसैट transendothelial प्रवास और बातचीत के आणविक आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। एक शक्तिशाली दृष्टिकोण ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी शामिल है।

यहाँ हम एक औंधा confocal खुर्दबीन के साथ नारंगी डाई लेबल न्यूट्रोफिल इंजेक्शन के साथ CX 3 CR1 GFP / गुम्मट माउस चतुर्थ में इमेजिंग monocytes और जीवाणुओं के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। समय चूक फिल्मों दोनों स्थिर राज्य और भड़काऊ शर्तों के तहत mesenteric रगों में ल्युकोसैट व्यवहार के विश्लेषण की अनुमति इमेजिंग के कई घंटे के लिए 30 मिनट से एकत्र हुए। स्थानीय स्तर पर TLR2 / TLR1 एगोनिस्ट Pam3SK4 साथ रक्त वाहिनियों की सूजन पैदा और subseque नजर रखने के लिए हम भी कदम का वर्णनन्यूट्रोफिल और monocytes के NT भर्ती।

प्रस्तुत तकनीक भी ल्यूकोसाइट्स की अन्य आबादी की निगरानी और अन्य उत्तेजनाओं या ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग ल्युकोसैट भर्ती या तस्करी में फंसा अणुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

न्यूट्रोफिल और monocytes लगातार रक्त में प्रसारित कि सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं रहे हैं। चोट या संक्रमण होने पर भड़काऊ संकेतों के साथ साथ एक सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1-3 की शुरुआत, क्षतिग्रस्त और संक्रमित ऊतकों में ल्युकोसैट diapedesis प्रेरित। ल्युकोसैट लामबंदी की तेज़ी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के सकारात्मक परिणाम को निर्धारित करता है। ये जटिल प्रक्रियाओं ल्युकोसैट में फंसा अणुओं पर अंतर्दृष्टि प्राप्त .To घूम ल्यूकोसाइट्स और अन्तःचूचुक 1-3 के बीच चिपकने वाला संपर्कों की स्थापना के लिए है कि मदद सूजन अन्तःचूचुक पर उपस्थित विशिष्ट अणु (जैसे, selectins, अन्तःचूचुक बाध्य chemokines) पर भरोसा भर्ती झरना, यह सेल भर्ती के कैनेटीक्स कल्पना करने के लिए और प्रत्येक कोशिका / आबादी के व्यवहार पर नज़र रखने के लिए महत्वपूर्ण है। एक प्रभावी तरीका ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी शामिल है।

तिथि करने के लिए सामग्री ">, intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कई दृष्टिकोण छवि के लिए विकसित किए गए वाहिका 4,5। उदाहरण के लिए, कान डर्मिस वाहिका या intravital confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा mesenteric नसों की इमेजिंग murine Ly6C कम monocytes और मानव की गश्त व्यवहार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था CD14 स्थिर राज्य की स्थिति को 6-8 के तहत रक्त वाहिकाओं के ल्यूमिनल तरफ CD16 + monocytes मंद। माउस cremaster वाहिका मॉडल अक्सर ट्रांसजेनिक चूहों में सूजन या इस्कीमिक की शर्तों के तहत न्यूट्रोफिल या भड़काऊ Ly6C उच्च monocytes के व्यवहार पर नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है। उस में मामले, cremaster IL1β, CCL2, TNFβ या FMLP की intrascrotal इंजेक्शन के माध्यम से प्रेरित है। 2-4 घंटे के बाद, ऊतकों तो शल्य चिकित्सा exteriorized कर रहे हैं और intravital confocal माइक्रोस्कोपी 9-11 से विश्लेषण किया।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल किसी के साथ एक ही समय में monocytes और जीवाणुओं की निगरानी के लिए एक विधि का वर्णनउल्टे प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन। इसके अलावा, हमारे विधि ल्युकोसैट भर्ती के कैनेटीक्स का पालन करने के लिए कैसे से पहले छवि एक ही पोत (स्थिर अवस्था हालत) के लिए और सूजन के बाद और विवरण कैसे। इस उद्देश्य के लिए, हम जिसका monocytes EGFP व्यक्त करते हैं, चतुर्थ एक नारंगी डाई लेबल murine न्यूट्रोफिल इंजेक्शन के साथ CX 3 CR1 GFP / गुम्मट माउस का उपयोग करें। एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग करना, यह (1) को ट्रैक और स्थिर राज्य की स्थिति और (2) स्थानीय सूजन के बाद एक ही बर्तन में दोनों monocytes और जीवाणुओं की भर्ती का पालन करने के तहत गश्त Ly6C कम monocytes का विश्लेषण करने के लिए संभव है। यहाँ हम TLR2 / TLR1 एगोनिस्ट Pam3CSK4 12 का उपयोग करके भड़काऊ शर्तों पैदा करते हैं। इसके अलावा, ऐसे इमेजिंग विशिष्ट नाक आउट चूहों पर या अवरुद्ध एंटीबॉडी 6,9,13 की उपस्थिति में प्रदर्शन करता है, तो ल्युकोसैट भर्ती झरना के विभिन्न चरणों में हित के विशिष्ट अणुओं की भूमिका निर्धारित करने के लिए मदद मिल सकती है।

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Protocol

नोट: पशु प्रक्रियाओं जिनेवा, स्विट्जरलैंड में जानवरों की देखभाल के संस्थागत नैतिक समिति और केंटन पशु चिकित्सा कार्यालय के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे। प्राधिकरण संख्या जीई / 63/14।

अस्थि मज्जा से एक एकल कक्ष निलंबन की 1. तैयारी

  1. ग्रीवा अव्यवस्था से बलिदान माउस (पुराने 8-12 सप्ताह)। 70% इथेनॉल के साथ पिछले पैरों जीवाणुरहित। पिछले पैरों से त्वचा निकालें।
  2. माउस femurs और tibias काटना और एक छुरी के साथ पैरों से ऊतक को हटा दें। पीबीएस के साथ भरा एक संस्कृति डिश में 90% इथेनॉल और जगह के साथ पैरों कुल्ला।
  3. संयुक्त घुटने पर एक छुरी और अलग से femurs और tibias से संस्कृति हुड, साफ ऊतक के तहत। हड्डियों के प्रत्येक के अंत काट दिया।
  4. एक 50 मिलीलीटर में एक 23g सुई और तैयारी मध्यम (फिनोल लाल मुक्त DMEM / F12, 1% चूहे सीरम) से भरा एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करते हुए प्रत्येक हड्डी से फ्लश अस्थि मज्जा ट्यूब पेंच। नाजुक 23G पूर्वोत्तर के माध्यम से passaging द्वारा सेल समुच्चय को बाधितEDLE और 1 मिलीलीटर सिरिंज। तैयारी के माध्यम से 25 मिलीलीटर की कुल मात्रा लाओ।
  5. अपकेंद्रित्र 250 XG, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 1 मिलीलीटर में resuspend गोली लाल रक्त सेल RBLC बफर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब पेंच (8.3 छ एनएच 4 सीएल, आसुत जल से 1 एल को पूरा 1 ग्राम NaHCO 3, 1 मिलीलीटर EDTA (100 मिमी), 0.22 माइक्रोन फिल्टर)। बर्फ पर 30 सेकंड सेते हैं।
  6. तैयारी मध्यम और सेंट्रीफ्यूज 250 XG के 10 मिलीलीटर, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। 2 मिलीलीटर तैयारी माध्यम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें।

नकारात्मक चयन द्वारा 2. न्युट्रोफिल संवर्धन

  1. माउस न्यूट्रोफिल संवर्धन कॉकटेल (सेल अलगाव मंच किट ऐसे EasySep के रूप में) के 150 μl जोड़ें। मिक्स और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  2. फिनोल लाल मुक्त DMEM के 10 मिलीलीटर जोड़ें। एक बार पलटना और सेंट्रीफ्यूज 250 XG, 3 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस।
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। नीचे ट्यूब दौर 5 मिलीलीटर polystyrene में 1.75 मिलीलीटर तैयारी माध्यम में resuspend गोली। 250 μl Biot जोड़ेंचयन कॉकटेल में। मिक्स और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  4. कणों resuspend करने के लिए 30 सेकंड के लिए (सेल अलगाव मंच किट से) चुंबकीय कणों भंवर। सेल निलंबन के लिए 500 μl चुंबकीय कणों जोड़ें। मिक्स और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  5. चुंबक में ट्यूब रखें। 3 मिनट रुको।
  6. वांछित लेबल हटाया कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए नीचे ट्यूब दौर एक नया 5 मिलीलीटर polystyrene पर चुंबक उलटें। ट्यूब में फांसी पिछले ड्रॉप मत लो। अवांछित कोशिकाओं चुंबक अंदर ट्यूब में रहेगा। एक biohazard कचरे में इस ट्यूब त्यागें।
  7. चुंबक में नया ट्यूब रखें। 3 मिनट रुको।
  8. एक नया 15 मिलीलीटर वांछित लेबल हटाया कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ट्यूब पेंच पर चुंबक उलटें। ट्यूब में फांसी पिछले ड्रॉप मत लो।
  9. फिनोल लाल मुक्त DMEM के साथ 5 मिलीलीटर को पूरी मात्रा।

न्यूट्रोफिल 3. लेबलिंग

  1. इस तरह के सेल ट्रैकर ऑरेंज के रूप में एक नारंगी डाई के 0.5 μl जोड़ें (काम एकाग्रता1 माइक्रोन, CMRA - chloromethyl-rodol-एसीटेट, शेयर DMSO में 10 मिमी)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट सेते हैं।
  2. तैयारी माध्यम की 2.5 मिलीलीटर जोड़ें। अपकेंद्रित्र 250 XG, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस।
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 1 मिलीलीटर तैयारी माध्यम में resuspend गोली।
  4. Hematocytometer साथ गिनती करने के लिए एक विभाज्य ले लो।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट सेते हैं। अपकेंद्रित्र 250 XG, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस।
  6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 1 मिलीलीटर पीबीएस में resuspend गोली। अपकेंद्रित्र 250 XG, 5 मिनट, धोने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  7. सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 100 μl पीबीएस प्रति 10x10 6 कोशिकाओं के रूप में resuspend गोली। चतुर्थ इंजेक्शन तक बर्फ पर रखें। नोट: कोशिकाओं चतुर्थ जितनी जल्दी संभव हो इंजेक्ट किया जाना है। 6-12x10 6 न्यूट्रोफिल / माउस आमतौर पर प्राप्त कर रहे हैं।

Intravital माइक्रोस्कोपी के लिए 4. माउस तैयारी

नोट:।। चरण 4.1) और 4.2) आईसी पर लेबल न्यूट्रोफिल की विस्तारित समय के इंतजार से बचने के लिए प्रयोग की शुरुआत में प्रदर्शन किया जाना चाहिएई।

  1. CX 3 CR1 GFP माउस (पुराने 8-12 सप्ताह) वजन।
  2. (पीबीएस में 1.75 मिलीग्राम / किग्रा acepromazone ketamine 60 मिलीग्राम / किग्रा, xylazine 4.5 मिलीग्राम / किग्रा), निश्चेतक के 800 μl तैयार करें।
  3. माउस anesthetize। माउस के 200 μl / 20 ग्राम के साथ इंजेक्शन आईपी। बन्द रखो पैर के अंगूठे से और श्वसन दर की जाँच करके नियंत्रण संज्ञाहरण।
  4. न्यूट्रोफिल (100 μl पीबीएस में 10x10 6 कोशिकाओं) नसों के प्रयोगकर्ता की सुविधा के अनुसार, पार्श्व पूंछ नसों या रेट्रो कक्षीय साइनस का उपयोग कर इंजेक्षन।
  5. हीटिंग पैड पर माउस रखो और नेत्र जेल के साथ आंखों की रक्षा।
  6. एक गिलास coverslip (35 मिमी व्यास) एक 30 मिमी व्यास छेद है, जो एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान में डाल दिया है। उपयोग तेल coverslip के साथ संपर्क में टिशू कल्चर पकवान बनाए रखना है।
  7. पेरिटोनियम बेनकाब करने के लिए कैंची से पेट की त्वचा काटकर अलग कर देना। आंत का पर्दाफाश करने के लिए कैंची के साथ पेरिटोनियम काटकर अलग कर देना।
  8. 200 μl पीबीएस पी में (37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म) जोड़ेंeritoneal गुहा। अपने हाथ में माउस ले लो और आंत एक सौम्य दबाव के साथ पेरिटोनियल गुहा से बाहर हो जाता है, तो यह नीचे चेहरे बदल जाते हैं। टिशू कल्चर पकवान में माउस रखें।
  9. धीरे mesenteric वाहिकाओं को बेनकाब करने के क्रम में coverslip पर निष्फल रुई से आंत deroll।
  10. बैंड में कागज ऊतकों में कटौती और 37 डिग्री सेल्सियस गर्म किया पीबीएस के साथ उन्हें गीला। क्रमाकुंचन से उत्पन्न आंदोलनों को कम करने के लिए कागज के ऊतकों के टुकड़े के साथ आंत स्थिर करना।
  11. उलटा माइक्रोस्कोप के कस्टम बनाया ट्रे मंच पर 37 डिग्री सेल्सियस thermostated कक्ष के अंदर टिशू कल्चर पकवान और माउस रखो। हिंद पैर में निश्चेतक सुप्रीम कोर्ट से युक्त एक सिरिंज का परिचय। नोट: इसके अतिरिक्त, माउस एक मुखौटा के साथ ऑक्सीजन (0.5 एल / मिनट) प्राप्त कर सकते हैं।
  12. पैर की अंगुली बन्द रखो और सांस की दर हर 30 मिनट की जाँच करके संज्ञाहरण के लिए नियंत्रण माउस। यदि आवश्यक हो, ठीक से संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए निश्चेतक का एक बढ़ावा देने के (20 μl) देने के लिए। नहींई: वाहिका के सूखने से बचा जाना चाहिए। इसलिए, इसकी नमी का नियमित रूप से 37 डिग्री सेल्सियस गर्म पीबीएस के साथ आंत स्थिर करने के लिए इस्तेमाल कागज के ऊतकों को गीला करके बनाए रखा है।

Intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग vivo में सूजन वेसल्स में 5. मापने न्युट्रोफिल और Monocyte व्यवहार

  1. सेट लेज़रों 488- और लेजर प्रेरित phototoxicity से बचने के लिए आवश्यक सबसे कम बिजली पर 561- करने के लिए। हमारे प्रयोगों में, यह 0.5% से कम है। न्यूट्रोफिल में monocytes में GFP और नारंगी डाई की तीव्रता आमतौर पर 0.3% के लिए पर्याप्त है कि बहुत उज्ज्वल है। नोट: यह हमारे सिस्टम के साथ 0.15 मेगावाट 0.25 के लेजर शक्ति का प्रतिनिधित्व करता है।
  2. उलटा माइक्रोस्कोप के 20X सूखी उद्देश्य का उपयोग कर एक खुला पिनहोल के साथ 2.2 सेकंड में 512 x 512 पिक्सल (यानी, 635 माइक्रोन) की छवियों मोल। कम लेजर शक्तियों के साथ पर्याप्त संकेत सुनिश्चित करता है कि 20 माइक्रोन के बीच 10 A से Z गहराई, का प्रयोग करें।
    नोट: हम आम तौर पर 12 से 16 के बीच एक z गहराई के साथ प्रयोगों प्रदर्शन56 मी। प्रस्तुत आंकड़े और फिल्मों के मामले में, Z गहराई 20 माइक्रोन है। चरण विपरीत एन्दोथेलिअल दीवारों की पहचान के लिए अनुमति देता है और इमेजिंग mesenteric नसों पर किया जाता है। गश्त कोशिकाओं ब्याज की एक क्षेत्र रिकॉर्डिंग, 5-10 माइक्रोन / मिनट 6 की रफ्तार के साथ काफी धीरे धीरे कदम के बाद से हर 20 सेकंड संतोषजनक है। वर्णित सेटिंग्स के साथ, मोटरयुक्त चरण एक ही समय में ब्याज की 7 क्षेत्रों की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है।
  3. उन्हें पहली फिल्म के अधिग्रहण से पहले 30 मिनट के लिए तैयारी से उबरने के लिए अनुमति देते हैं माउस और माइक्रोस्कोप के थर्मोस्टैट कक्ष में mesenteric वाहिकाओं रखें। इस समय के दौरान, ब्याज के कई क्षेत्रों का चयन करें। उद्देश्य के लिए निकटतम पोत के ल्यूमिनल सतह पर ध्यान दें। यदि आवश्यक हो, ध्यान सेट करने के लिए अन्तःचूचुक की मामूली ऑटो प्रतिदीप्ति का लाभ ले।
    नोट: माउस की तैयारी के दौरान सर्जरी थोड़ा अन्तःचूचुक जोर दिया है। नतीजतन, न्यूट्रोफिल की रोलिंग और/ या monocytes पहले 15 मिनट के बाद माउस तैयारी में मनाया जा सकता है।
  4. स्थिर राज्य की शर्तों के तहत 30 मिनट, एक छवि हर 20 सेकंड के लिए पहली बार एक फिल्म रिकॉर्ड।
    नोट: सॉफ्टवेयर 2.2 सेकंड में ब्याज की प्रत्येक क्षेत्र का अधिग्रहण और motorized मंच स्वचालित रूप से एक दूसरे के क्षेत्र से चलता है। यह रिकॉर्डिंग फिल्म के 30 मिनट के दौरान वापस 20 सेकंड के भीतर पहले की स्थिति को जाता है।
  5. रक्त वाहिका सूजन आरंभ करने के लिए, TLR2 के 100 माइक्रोग्राम युक्त पीबीएस के 20 μl की एक बूंद को जोड़ने / TLR1 एगोनिस्ट Pam3CSK4 12 सीधे imaged जहाजों पर।
  6. ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए ध्यान केंद्रित नियंत्रण।
    नोट: अधिग्रहण के दौरान, वहाँ हमेशा जेड अक्ष पर ध्यान केंद्रित करने की मामूली परिवर्तन। 10-20 माइक्रोन Z गहराई के बावजूद, इस प्रतिदीप्ति तीव्रता की कमी हो सकती है। अगर जरूरत इसलिए, मैन्युअल, प्रत्येक फिल्म के अंत में ब्याज की प्रत्येक क्षेत्र refocus। 30 मिनट-अवधि के लिए और करने के लिए 3 घंटा के लिए रिकॉर्ड फिल्मेंताल सूजन की दीक्षा के बाद।
  7. प्रयोग के अंत में, ग्रीवा अव्यवस्था से anesthetized माउस बलिदान।

मूवी फ़ाइलें और leukocytes की ट्रैकिंग के 6. पीढ़ी

नोट: Nikon के अधिग्रहण सॉफ्टवेयर फ़ाइलों .nd2 उत्पन्न करता है, लेकिन निम्न प्रक्रिया अन्य सॉफ्टवेयर और ब्रांडों के साथ इसी तरह की होगी।

  1. झगड़ा श्रृंखला के रूप में निर्यात फ़ाइलें।
  2. ImageJ सॉफ्टवेयर (करने के लिए जाओ http://rsb.info.nih.gov/ij/ )। झगड़ा श्रृंखला आयात करें। एक अलग फ़ाइल के रूप में प्रत्येक चैनल।
  3. पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए हरे और लाल चैनल (प्रक्रिया> फ़िल्टर> माध्य ...) के लिए 2.0 पिक्सेल का एक त्रिज्या के साथ एक मंझला फिल्टर लागू करें।
  4. (बाइनरी बनाओ> प्रक्रिया> बाइनरी) बाइनरी में फ़ाइलों को परिवर्तित। प्रत्येक छवि के लिए सीमा की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर सक्षम करें।
  5. एक छवि श्रृंखला (छवि> रंग> ... चैनल मर्ज) में चैनल मिलाएं। Gree में monocytes का चयन करेंएन चैनल, लाल चैनल और ग्रे चैनल में प्रेषित प्रकाश में न्यूट्रोफिल।
  6. आरजीबी रंग में खड़ी छवियों कन्वर्ट (छवि> रंग> आरजीबी को ढेर)।
  7. .avi फ़ाइल के रूप में सहेजें
  8. डेटा आयात और Imaris सॉफ्टवेयर (Bitplane) में संकलित कर रहे हैं। Monocytes और जीवाणुओं के आंदोलनों तो स्पॉट ट्रैकिंग जादूगर का उपयोग कर लगाया जाता है।

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Representative Results

पांडुलिपि आसानी से वास्तविक समय में anaesthetized चूहों के mesenteric रगों में monocytes और जीवाणुओं के व्यवहार पर नजर रखने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन है। एक 37 डिग्री सेल्सियस-thermostated कक्ष के उपयोग माउस का तापमान बनाए रखने के लिए अनिवार्य है और यह भी कारण ल्यूकोसाइट्स के तापमान पर निर्भर आंदोलन करने के लिए है। माउस की तैयारी चित्रा में प्रदर्शित किया जाता है 1. चित्रा 2 माइक्रोस्कोप के नीचे देखा सभी क्षेत्र से पता चलता है। प्रेषित प्रकाश mesenteric नसों (लाल तीर) और धमनियों (नीले तीर) की पहचान की अनुमति देता।

ऐसी मूवी 1 और 2 मूवी के रूप में ImageJ सॉफ्टवेयर उत्पन्न फिल्म फ़ाइलों के साथ अधिग्रहीत छवियों का उपचार। 3 दिखाता फिल्म के पहले समय बिंदु के लिए छवि प्रसंस्करण के विभिन्न चरणों चित्रा 1। 1 मूवी स्थिर राज्य की शर्तों के तहत Ly6C कम monocytes की गश्त से पता चलता है , पहले से डे के रूप मेंसभी न्यूट्रोफिल खून में घूम रहे हैं, जबकि 6,8,14 मानते। कोई न्यूट्रोफिल एन्दोथेलिअल दीवार गश्त कर रहा है। फिल्म 2 स्थानीय स्तर पर सूजन को आरंभ करने के TLR2 / TLR1 एगोनिस्ट Pam3CSK4 के बाद इसके अलावा ब्याज 90 मिनट के एक ही क्षेत्र से पता चलता है। इस मामले में, न्यूट्रोफिल और monocytes बड़े पैमाने पर वे कुशलता से स्कैन जो एन्दोथेलिअल दीवार, के लिए भर्ती कर रहे हैं। यह एक TLR एगोनिस्ट की है कि इसके अलावा अन्तःचूचुक चौड़ाई में परिवर्तन लाती है और फलस्वरूप जेड अक्ष का फोकस बदल, नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, ध्यान ध्यान एगोनिस्ट के अलावा के बाद नियंत्रित किया जाना चाहिए। Imaris सॉफ्टवेयर (Bitplane) में डेटा का संकलन स्पॉट ट्रैकिंग विज़ार्ड का उपयोग व्यक्तिगत ल्यूकोसाइट्स की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। 4 चित्रा अन्तःचूचुक साथ गश्त monocytes (हरा) और जीवाणुओं (लाल) की सटीक ट्रैक रास्तों से पता चलता है। डेटा यानी, 90 मिनट संसाधनों की दीक्षा के बाद, फिल्म 2 के विश्लेषण से प्राप्त कर रहे हैंlammation। ल्युकोसैट रास्तों की ट्रैकिंग ऐसे ट्रैक की लंबाई, विस्थापन, अवधि या गति के रूप में विभिन्न आँकड़े प्राप्त करने के लिए झगड़ा फाइल या xls फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया जा सकता है।

इस तकनीक से पहले और सूजन के बाद एक ही समय में monocytes और जीवाणुओं के व्यवहार पर नजर रखने के लिए एक अच्छा तरीका प्रदान करता है। यह endothelial दीवार ओवरटाइम पर इन कोशिकाओं की भर्ती को ट्रैक करने के लिए संभव है। जेड अक्ष या यहां तक कि एक्स / y विस्थापन पर ध्यान केंद्रित करने की हानि प्रयोग को बर्बाद कि आंतों आंदोलनों का एक परिणाम के रूप में हो सकता है। मूवी 3 में इस तरह विफल रहा है तैयारी और अधिग्रहण को दिखाता है।

चित्र 1
1. माउस तैयारी चित्रा।
काला तीर आंत स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया पीबीएस गीला ऊतक संकेत मिलता है। व्हाइट नोक 10cm टिशू कल्चर पकवान इंगित करता है। टी माइक्रोस्कोप में फिट बैठता है कि एल्यूमीनियम कस्टम बनाया ट्रे चरण इंगित करता है। Mesenteric रक्त वाहिकाओं को अच्छी तरह से coverslip पर केंद्र में सामने आ रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Mesenteric नसों और धमनियों की 2. शाखाओं चित्रा।
एक 10x उद्देश्य के साथ लिया छवियों (20 x 10) उपलब्ध क्षेत्र की एक बड़ी छवि का गठन करने के सिले थे। ब्याज के कई क्षेत्रों तो एक 20x उद्देश्य के साथ ल्युकोसैट आवाजाही पर नजर रखने के लिए चुना जाता है। लाल तीर एक mesenteric नस इंगित करता है। नीले तीर एक mesenteric धमनी इंगित करता है। हरी तीर वाहिकाओं के आसपास वसा ऊतकों को इंगित करता है। गीला ऊतक की उपस्थिति से छवि परिणाम के पक्षों पर अंधेरे क्षेत्र आंत स्थिर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सफेद पैमाने बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है।कश्मीर "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
ImageJ के साथ 3. छवि प्रसंस्करण चित्रा।
छवि प्रसंस्करण के विभिन्न चरणों को अलग से कार्रवाई कर रहे हैं मूवी 1. ग्रीन (monocytes) और लाल (न्यूट्रोफिल) चैनलों की पहली छवि के लिए सचित्र हैं। मूल कच्चे डेटा (ए) के लिए, एक मंझला फिल्टर (बी) लागू किया जाता है और फिर एक द्विआधारी छवि (सी) के लिए बदल दिया। (डी) चैनलों के लिए एक अंतिम छवि में विलय कर रहे हैं। कच्चे डेटा में मनाया हरे या लाल लाइनों माइक्रोस्कोप पूर्ण उन्हें प्राप्त करने में सक्षम नहीं है कि इतनी तेजी से आगे बढ़ रहे हैं कि कोशिकाओं रहे हैं। सफेद पैमाने बार 40 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. व्यक्तिगतल्युकोसैट पटरियों।
Monocytes (ए) और अन्तःचूचुक गश्त न्यूट्रोफिल (बी) की पटरियों Imaris सॉफ्टवेयर (Bitplane) के साथ कार्रवाई कर रहे हैं। सफेद पैमाने बार 40 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1
मूवी स्थिर अवस्था में एन्दोथेलिअल दीवार स्कैनिंग 1. Leukocytes। स्थिर अवस्था में, Ly6C कम monocytes अन्तःचूचुक गश्ती। न्यूट्रोफिल रक्त के प्रवाह के अनुसार घूम रहे हैं। न्यूट्रोफिल लाल रंग में हैं और monocytes हरे रंग में हैं। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। 20X उद्देश्य के साथ उत्पन्न। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जीई = "हमेशा"> फिल्म 2
2:। Leukocytes TLR2 की मध्यस्थता सूजन के बाद एन्दोथेलिअल दीवार स्कैनिंग हित के एक ही क्षेत्र मूवी 1. के रूप में मूवी 90 मिनट सीधे पोत पर Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 एगोनिस्ट) के 100 माइक्रोग्राम युक्त पीबीएस के 20 μl के अलावा के बाद शुरू होता है। भर्ती की monocytes और न्यूट्रोफिल सावधानी एन्दोथेलिअल दीवार स्कैनिंग कर रहे हैं। न्यूट्रोफिल लाल रंग में हैं और monocytes हरे रंग में हैं। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 3
मूवी 3: गलत माउस तैयारी से प्राप्त परिणामों संज्ञाहरण या आंत के स्थिरीकरण गलत कर रहे हैं जब प्राप्त वाहिकाओं के आंदोलनों।। स्केल बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है।च = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" लक्ष्य = "_blank"> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पांडुलिपि में वर्णित तरीके कुशलता से स्थिर राज्य और भड़काऊ शर्तों के तहत mesenteric रगों में एककेंद्रकश्वेतकोशिका और न्युट्रोफिल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक सुसंगत दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।

तैयारी के महत्वपूर्ण कदम पीबीएस गीला ऊतकों के साथ आंत के स्थिरीकरण है। ठीक से प्रदर्शन करते हैं, तो mesenteric वाहिकाओं अच्छी तरह से छवि अधिग्रहण के लिए coverslip पर सामने आ रहे हैं। इस mesenteric रगों में ल्युकोसैट व्यवहार पर नजर रखने के लिए ब्याज के कई क्षेत्रों का चयन सक्षम बनाता है।

हमारी प्रोटोकॉल (1) सीधे निगरानी जहाजों पर सूजन प्रेरित करने के लिए, और (2) उत्तेजना के बाद जल्दी समय बिंदुओं को रिकॉर्ड करने के लिए और (3) के कैनेटीक्स पालन करने के लिए सक्षम करने, प्रयोगों की शुरुआत से पहले mesenteric जहाजों की बाह्यीकरण शामिल ल्यूकोसाइट्स की भर्ती और पहले और सूजन के शामिल होने के बाद एक ही बर्तन में उनके व्यवहार।

हम transfअधिक कोशिकाओं (0.5-2x10 6 / माउस बनाम 6-12x10 6) पशु प्रति प्राप्त किया जा सकता है के रूप एर न्यूट्रोफिल ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि के murine अस्थि मज्जा से शुद्ध नहीं है और खून से। रक्त न्यूट्रोफिल का उपयोग पसंद किया जाता है, तो एक ही प्रोटोकॉल सेल शुद्धि के लिए किया जा सकता है।

Intravital इमेजिंग में, वाहिका के दृश्य mesenteric वाहिकाओं के मामले में प्रेषित प्रकाश से सक्षम है। वैकल्पिक रूप से, PECAM1 के खिलाफ फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (क्लोन 390) या फ्लोरोसेंट उच्च आणविक भार dextran (70kDa या 2 एमडीए) 6,14 वाहिका का पता लगाने के लिए इंजेक्शन चतुर्थ हो सकता है। उदाहरण के लिए, 3 ग्राम विरोधी PECAM1 (क्लोन 390) का इंट्रा-अंडकोषीय इंजेक्शन कम पृष्ठभूमि के साथ वाहिका का पता लगाने के लिए सक्षम करने और cremaster मॉडल 9 में ल्युकोसैट गतिविधि को प्रभावित करने के लिए नहीं बताया गया था। प्रेषित प्रकाश की तुलना में, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी या रंगों के उपयोग विशेष रूप से vascu के 3D पुनर्निर्माण की संभावना का परिचयlature, लेकिन एक चैनल अपने लेबलिंग के लिए बलिदान है और अधिग्रहण के समय बढ़ जाती है। यहाँ वर्णित के रूप में प्रेषित प्रकाश, वाहिका की पारदर्शिता को mesenter मॉडल धन्यवाद में पर्याप्त है। इसके विपरीत, वाहिका के फ्लोरोसेंट लेबलिंग कान डर्मिस या अपारदर्शी अंगों में अनिवार्य है।

ल्यूकोसाइट्स की आबादी का पता लगाने के लिए विशेष प्रकार की कोशिकाओं में अंतर्जात प्रतिदीप्ति दिखा रहे हैं जो ट्रांसजेनिक जानवरों (; monocytes और न्यूट्रोफिल लिस EGFP 9; और प्लेटलेट्स cd41 YFP 17 monocytes CX 3 CR1 EGFP / गुम्मट 6 या cd115 सीएफपी 15 या cd68 GFP 16) का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । CX3CR1, CX 3 सब monocytes और एन.के. और टी कोशिकाओं में से कुछ सबसेट में CR1 EGFP / गुम्मट माउस व्यक्त किया है हालांकि भड़काऊ Ly6C <के बीच भेद करने के लिए दिलचस्प हैसमर्थन> निवासी Ly6C कम monocytes 6 से कम GFP प्रतिदीप्ति दिखा रहे हैं जो उच्च monocytes। CD115 monocytic लाइन के विशिष्ट है, MacBlue माउस cd115 सीएफपी एक दिलचस्प मॉडल है। हालांकि यह Ly6C उच्च और Ly6C कम monocytes भेद करने के लिए संभव नहीं है।

ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट चूहों के लिए एक वैकल्पिक वास्तविक समय में ल्यूकोसाइट्स की आबादी लेबल फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के चतुर्थ इंजेक्शन है। उदाहरण के लिए, monocytes विरोधी CD115 (क्लोन AFS98), विरोधी CD49b (क्लोन HMα2) के साथ विरोधी Ly6G (क्लोन 1A8) के साथ न्यूट्रोफिल और प्लेटलेट्स के साथ लेबल किया जा सकता। सामान्य में, इन सभी एंटीबॉडी उच्च खुराक में घट रहे हैं। इसलिए, वे समय की छोटी अवधि के लिए और कम स्तर पर सावधानी से किया जाना चाहिए। यह भी कम खुराक पर, सेल समारोह पर एक प्रभाव की संभावना से इनकार नहीं किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। कम मात्रा में (1-2 ग्राम) के साथ व्यक्तिगत अनुभव CD115 + सोम की लेबलिंग में सक्षम बनाता हैकमी के बिना ocytes और Ly6G + न्यूट्रोफिल (डेटा प्रकाशित नहीं)।

कान अछूता है के रूप में कान डर्मिस वाहिका की मॉडल गैर-आक्रामक है, कान डर्मिस की गहराई यह बनाता है, जो एक चिंता का विषय है 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी 13 के लिए अधिक उपयुक्त एक मॉडल। इसके अलावा, यह सीधे शारीरिक रूप से तैयार करने के बिना परेशान कान मॉडल में पोत को प्रोत्साहित करने के लिए संभव नहीं है।

हमारी प्रोटोकॉल किसी भी औंधा confocal खुर्दबीन के साथ लागू किया जा सकता है। स्कैनिंग गति और लेजर पावर मशीन पर निर्भर कर रहे हैं, के बाद से एक एकल z विमान में एक फ्रेम (512 x 512 पिक्सल, यानी, 635 माइक्रोन) के अधिग्रहण के Nikon A1R की GALVANO स्कैनर के लिए हमारी सेटिंग के साथ लगभग 2.2 सेकंड की आवश्यकता है। दुर्भाग्य से, यह कम गति गुणवत्ता की हानि के बिना mesenteric नसों के चार आयामी फिल्में रिकॉर्डिंग की संभावना को सीमित करता है। A1R के गुंजयमान स्कैनर हालांकि, एक उच्च अधिग्रहण की गति प्रदान करता हैछवियों की गुणवत्ता जोरदार CX 3 CR1 GFP / गुम्मट माउस के साथ अपने प्रयोगों के लिए (विशिष्ट संकेत बनाम पृष्ठभूमि) कम हो जाता है। यह लेज़रों phototoxicity और विरंजन से बचने के लिए कम से कम 0.5% (<0.25 मेगावाट) में स्थापित कर रहे हैं कि ध्यान में रखा जाना चाहिए।

Woodfin एट अल एक Leica टीसीएस SP5 9 का उपयोग cremaster venules की (40 सेकंड में 60 जेड ढेर छवियों) 4D में फिल्में हासिल करने में कामयाब रहे। व्यास में 20-40 माइक्रोन के लेखकों की छवि मूल्यों के रूप में, वे शायद हमारे मॉडल में (200-400 माइक्रोन की mesenteric नसों की निगरानी) से ध्यान में परिवर्तन करने के लिए कम संवेदनशील होते हैं। जीवित ऊतक जब इमेजिंग, ध्यान के नियंत्रण के लिए कई घंटे तक चलने वाले एक अनोखी फिल्म को रिकॉर्ड करने की संभावना को प्रतिबंधित करता है जो सबसे महत्वपूर्ण चिंता का विषय है। हम 30 मिनट (या 45 मिनट) तक चलने फिल्मों की रिकॉर्डिंग mesenteric मॉडल में सबसे अधिक व्यावहारिक है कि विचार करें।

TLR agonists के अलावा पोत चौड़ाई और इसलिए फोकस बदल। नतीजतन,जहाजों को स्थिर जब तक यह उत्तेजना के बाद ठीक से छवि पहले 10-15 मिनट के लिए बहुत मुश्किल है।

एक और सीमा प्रयोग की अवधि है। समय की एक लंबी अवधि में ठीक anesthetized माउस बनाए रखने के लिए कठिनाई की वजह से, यह सूजन के बाद 4 घंटा से ज्यादा छवि के लिए मुश्किल है। (हमारे द्वारा परीक्षण नहीं किया है) इस तरह के निरंतर isoflurane साँस लेना के रूप में अन्य निश्चेतक, का उपयोग करते हैं, एक विकल्प हो सकता है।

पुराने चूहों में (उम्र के 16 सप्ताह से अधिक), जहाजों के आसपास चर्बी जमा की वृद्धि हुई राशि mesenteric वाहिकाओं के दृश्य की गुणवत्ता में कमी। इसलिए, यह 8-12 सप्ताह पुरानी चूहों के साथ प्रयोगों को चलाने के लिए बेहतर है।

इस तकनीक को ब्याज के अणुओं को ब्लॉक या ल्युकोसैट भर्ती या व्यवहार में फंसा अणुओं के महत्व को निर्धारित किया जा सकता है, ताकि दिया ल्युकोसैट आबादी व्यय करना एंटीबॉडी के चतुर्थ इंजेक्शन के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अतिरिक्त,अन्य ल्युकोसैट सबसेट ब्याज की सेल आबादी में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त अन्य ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग कर लगाया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 ml polystyrene round bottom tubes  Beckton Dickinson 352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm  Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm  Nikon
Cell Tracker Orange CMRA Dye Life Technologies C34551
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit Stem Cell Technologies 19762
EDTA Sigma Aldrich E6758
FCS PAA A15-042
Immersion Oil Type A Nikon any viscous oil 
Life Box Temperature Control System Life Imaging
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NH4Cl Sigma Aldrich A9434
Nikon A1R confocal microscope Nikon A1R inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBS Life Technologies D8537
phenol red free DMEM/F12 Life Technologies 21041-025 any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4 Invivogen tlrl-pms reconstitute in PBS
Rat serum Stem Cell Technologies included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100 TPP 93100

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 105 अन्तःचूचुक सूजन intravital माइक्रोस्कोपी लाइव इमेजिंग mesenteric नस एककेंद्रकश्वेतकोशिका न्यूट्रोफिल टोल की तरह रिसेप्टर
रीयल टाइम में anaesthetized चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा Mesenteric रगों में न्यूट्रोफिल और monocytes इमेजिंग
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Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A.… More

Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. J. Vis. Exp. (105), e53314, doi:10.3791/53314 (2015).

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