Abstract
Effektiv immunsvaret är beroende av en snabb mobilisering av blodleukocyter till platsen av infektion eller skada. Undersöka leukocytmigration in vivo är avgörande för att förstå den molekylära grunden för leukocyter transendotelial migration och interaktion med kärlendotelet. En kraftfull metod innebär intravital mikroskopi på transgena möss som uttrycker fluorescerande proteiner i celler av intresse.
Här presenterar vi ett protokoll för avbildning monocyter och neutrofiler i CX 3 CR1 gfp / vikt mus iv injiceras med orange färgämnesmärkta neutrofiler med ett inverterat konfokalmikroskop. Time-lapse filmer som samlats in från 30 minuter till flera timmar av imaging tillåter analys av leukocyt beteende mesenteriska ådror under både stationära och inflammatoriska tillstånd. Vi beskriver också stegen att lokalt framkalla inflammation i blodkärlen med TLR2 / TLR1 agonist Pam3SK4 och övervaka subsequent rekrytering av neutrofiler och monocyter.
De presenterade tekniken kan också användas för att övervaka andra populationer av leukocyter och undersöka molekyler inblandade i leukocytrekrytering eller handel med hjälp av andra stimuli eller transgena möss.
Introduction
Neutrofiler och monocyter är celler av det medfödda immunförsvaret som kontinuerligt cirkulerar i blodet. Vid skada eller infektion, inflammatoriska signaler inducerar leukocyt diapedes i skadade och infekterade vävnader, häri initiera ett cellulärt immunsvar 1-3. Den snabba leukocyter mobilisering bestämmer det positiva resultatet av de immunsvar. Dessa intrikata processer är beroende av specifika molekyler (t.ex. selektiner, endotel bundna kemokiner) som finns på den inflammerade endotel som hjälper för att fastställa självhäftande kontakter mellan cirkulerande leukocyter och endotel 1-3 .För få insikter om molekylerna inblandade i leukocyter rekrytering kaskad, är det viktigt att visualisera kinetiken hos cellrekrytering och för att spåra beteendet hos varje cell / populationen. En effektiv metod innebär intravital mikroskopi på transgena möss som uttrycker fluorescerande proteiner i celler av intresse.
innehåll "> Hittills har flera metoder med hjälp av intravital mikroskopi utvecklats för att avbilda kärl 4,5. Till exempel var avbildning av öron dermis kärl eller mesenteriska vener genom intravital konfokalmikroskopi används för att identifiera patruller beteende mus Ly6C låga monocyter och mänsklig CD14 dim CD16 + monocyter på luminala sidan av blodkärl under stationära betingelser 6-8. Musen cremaster kärlmodellen används ofta för att övervaka beteendet hos neutrofiler eller inflammatorisk Ly6C höga monocyter enligt inflammatoriska eller ischemiska tillstånd i transgena möss. I detta fall cremaster stimuleras via intrascrotal injektion av IL1β, CCL2, TNFP eller fMLP. Efter 2-4 h, vävnader sedan kirurgiskt exteriorized och analyserades med intravital konfokalmikroskopi 9-11.Följande protokoll beskriver en metod för att övervaka monocyter och neutrofiler samtidigt med någoninverterat fluorescens konfokalmikroskop. Dessutom, vår metod beskriver hur bilden samma fartyg före (stabilt tillstånd) och efter inflammation och hur man följer kinetik leukocytrekrytering. För detta ändamål använder vi CX 3 CR1 gfp / vikt mus, vars monocyter uttrycker EGFP, iv injiceras med en orange färgämnesmärkta murina neutrofiler. Med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop, är det möjligt (1) för att spåra och analysera patrullera Ly6C låga monocyter under stationära betingelser och (2) att följa rekryteringen av både monocyter och neutrofiler i samma kärl efter lokal inflammation. Här skapar vi inflammatoriska tillstånd med hjälp av TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12. Dessutom kan en sådan avbildning hjälpa till att avgöra vilken roll specifika molekyler av intresse i de olika stegen i leukocytrekrytering kaskad om det utförs på specifika knock-out-möss eller i närvaro av blockerande antikroppar 6,9,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: djurförsök har utförts i enlighet med institutionella etiska kommitté Animal Care i Genève, Schweiz och Cantonal veterinärfrågor. Godkännandenummer GE / 63/14.
1. Framställning av en enkelcellsuspension från benmärg
- Offer-mus (8-12 veckor gamla) genom cervikal dislokation. Sterilisera bakbenen med 70% etanol. Ta bort huden från bakbenen.
- Dissekera ut mus lårben och skenben och ta bort vävnad från ben med en skalpell. Skölj benen med 90% etanol och plats i en odlingsskål fylld med PBS.
- Under odling huva, ren vävnad från lårben och skenben med en skalpell och separat vid knäleden. Skär av varje ände av benen.
- Spola benmärg från varje ben med användning av en 23G nål och en 1 ml spruta fylld med preparatet medium (fenolröttfritt DMEM / F12, 1% råttserum), i en 50 ml skruv rör. Störa cellaggregat med fint passage genom 23G needle och en 1 ml spruta. Bring totala volymen till 25 ml med prepareringsmedium.
- Centrifugera 250 xg, 5 min, 4 ° C. Släng supernatanten. Resuspendera pelleten i 1 ml röda blodkroppar Lysis RBLC buffert (8,3 g NH4CI, 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), komplett med ett L med destillerat vatten, filtrera 0,22 pm) i en 15 ml skruv rör. Inkubera 30 sekunder på is.
- Tillsätt 10 ml av förberedelser medium och centrifugera 250 xg, 5 min, 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera i 2 ml förberedelse medium.
2. Neutrofil berikning genom negativ selektion
- Tillsätt 150 pl av Mouse neutrofila anrikningscocktail (cellisolering plattform kit som EasySep). Blanda och inkubera på is under 10 minuter.
- Tillsätt 10 ml fenolrött fritt DMEM. Vänd en gång och centrifugera 250 xg, 3 min, 4 ° C.
- Släng supernatanten. Resuspendera pelleten i 1,75 ml beredning medium i 5 ml polystyren med rund botten rör. Lägg 250 pl Bioti Val Cocktail. Blanda och inkubera på is under 10 minuter.
- Vortex de magnetiska partiklarna (från cellisolering plattformen kit) under 30 sekunder för att resuspendera partiklar. Tillsätt 500 pl magnetiska partiklar till cellsuspensionen. Blanda och inkubera på is under 10 minuter.
- Placera röret i magneten. Vänta 3 minuter.
- Vänd magneten på en ny 5 ml polystyren med rund botten rör för att samla de önskade omärkta celler. Ta inte den sista droppen hängande i röret. Oönskade celler kommer att förbli i röret inuti magneten. Kasta detta rör i en biologiskt avfall.
- Placera den nya röret i magneten. Vänta 3 minuter.
- Vänd magneten på en ny 15 ml skruv röret för att samla de önskade omärkta celler. Ta inte den sista droppen hängande i röret.
- Komplett volym på 5 ml med fenolrött fritt DMEM.
3. Märkning av neutrofiler
- Tillsätt 0,5 pl av en orange färg, såsom Cell Tracker orange (arbetskoncentration1 pM, CMRA - klormetyl-rodol-acetat-, lager 10 mM i DMSO). Inkubera 2 min vid 37 ° C.
- Tillsätt 2,5 ml prepareringsmedium. Centrifugera 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Släng supernatanten. Resuspendera pelleten i 1 ml prepareringsmedium i en 1,5 ml rör.
- Ta en delmängd att räkna med hematocytometer.
- Inkubera 5 minuter vid 37 ° C. Centrifugera 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Släng supernatanten. Resuspendera pelleten i 1 ml PBS. Centrifugera 250 xg, 5 min, 4 ° C för att tvätta.
- Släng supernatanten. Resuspendera pellet som 10x10 6 celler per 100 ul PBS. Håll på is tills intravenös injektion. OBS: celler måste vara iv injicerat så snabbt som möjligt. 6-12x10 6 neutrofiler / mus erhålls vanligtvis.
4. Mus Förberedelser för Intravital mikroskopi
OBS:.. Steg 4.1) och 4.2) ska utföras vid början av experimentet för att undvika förlängd väntetid på märkta neutrofiler på ICe.
- Väg CX 3 CR1 gfp mus (8-12 veckor gamla).
- Bered 800 pl av anestetika (ketamin 60 mg / kg, xylazin 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg i PBS).
- Söva musen. Injektion ip med 200 ul / 20 g mus. Kontroll anestesi genom tå klämmande och genom att kontrollera andningsfrekvens.
- Injicera neutrofiler (10x10 6 celler i 100 pl PBS) intravenöst med hjälp av sido venerna svans eller retro orbitalsinus, när det passar försöks.
- Placera musen på värmedyna och skydda ögonen med ögon gel.
- En glastäckglas (35 mm i diameter) placeras i en 10 cm vävnadskulturskål, som har ett hål 30 mm i diameter. Använd olja är att bibehålla vävnadsodlingsplatta i kontakt med täckglas.
- Incisionsfilm bukhuden med sax för att exponera bukhinnan. Incise bukhinnan med sax för att exponera tarmen.
- Lägg 200 pl PBS (förvärmd vid 37 ° C) i peritoneal kaviteten. Ta musen i handen och vrid den nedåt, så att tarmen kommer ut ur bukhålan med ett lätt tryck. Placera musen i vävnadsodlingsskål.
- Deroll försiktigt tarmen med steriliserade bomullspinnar på täck för att exponera mesenteriska fartyg.
- Skär pappersnäsdukar i band och fukta dem med 37 ° C uppvärmd PBS. Immobilisera tarmen med bitar av pappersnäsdukar att minska rörelser till följd av peristaltiken.
- Sätt vävnadsodling skålen och musen inne i 37 ° C termostatkammare på skräddarsydd fack skede av inverterat mikroskop. Införa en spruta innehållande bedövningsmedel fm i bakbenet. OBS: Dessutom kan musen mottaga syre (0,5 liter / min) med en mask.
- Musstyrning för anestesi genom tå nypa och kontrollera andningsfrekvens var 30 min. Om det behövs, ge ett uppsving av bedövningsmedel (20 l) för att underhålla anestesi. INTEE: Torkning av vaskulaturen bör undvikas. Därför är dess fuktighet upprätthålls genom att regelbundet väta pappersnäsdukar som används för att immobilisera tarmen med 37 ° C-uppvärmd PBS.
5. Mätning neutrofiler och monocyt Beteende i inflammerade Fartyg In Vivo använder Intravital mikroskopi
- Ställ laser för att 488- och 561- på lägsta effekt som krävs för att undvika laserinducerad fototoxicitet. I våra experiment, är det lägre än 0,5%. Intensitet av GFP i monocyter och orange färg i neutrofiler är så ljus som vanligtvis 0,3% räcker. OBS: Detta är en lasereffekt av 0,15-0,25 mW med vårt system.
- Förvärva bilder av 512 x 512 pixlar (dvs 635 pm) i 2,2 sekunder med en öppen hål med hjälp av 20X torr syftet med inverterat mikroskop. Använd en z-djup mellan tio till 20 | im, som säkerställer tillräcklig signal med de låga lasereffekter.
OBS: Vi utför vanligtvis experiment med en z-djup mellan 12-1656; m. När det gäller presenterade siffrorna och filmer, är z-djup 20 pm. Faskontrast möjliggör identifiering av endotelceller väggar och bildbehandling utförs på mesenteriska ådror. Sedan patrullerar celler rör sig ganska långsamt med en hastighet av 5-10 pm / min 6, inspelning av en intresseområde var 20 sekund är tillfredsställande. Med de beskrivna inställningarna, tillåter den motoriserade stadiet registrering av upp till 7 områden av intresse på samma gång. - Placera musen och mesenteriala fartyg i termostatkammaren mikroskopets är möjligt för dem att återhämta sig från förberedelserna inför 30 minuter före förvärvet av den första filmen. Under denna tid, välj flera intresseområden. Fokus på den luminala ytan av kärlet närmast målet. Om det behövs, dra nytta av den lilla auto-fluorescens av endotel att ställa in fokus.
OBS: Kirurgi under framställningen musen betonar endotel något. Följaktligen, rullande av neutrofiler och/ eller monocyter kan observeras i den första 15 minuter efter mus beredning. - Spela in ett första filmen för 30 minuter under stationära betingelser, en bild varje 20 sek.
OBS: Programvaran förvärvar varje fält av intresse för 2,2 sek och den motoriserade scenen flyttas automatiskt från ett fält till ett annat. Det går tillbaka till det första läget inom 20 sekunder under 30 minuter av inspelnings filmen. - För att initiera inflammation i blodkärlen, tillsätt en droppe 20 il PBS innehållande 100 pg TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 direkt på de avbildade fartygen.
- Styr fokus för varje intresseområde.
OBS: Under förvärvet, det finns alltid små förändringar i fokus på z-axeln. Trots 10-20 pm z-djup, kan detta resultera i en minskning av fluorescensintensitet. Därför fokusera manuellt varje intresseområde i slutet av varje film, om det behövs. Spela in filmer i 30 min-perioder och upp till 3 timmar tilltal efter initiering av inflammation. - Vid slutet av experimentet, offra sövda musen genom cervikal dislokation.
6. Framställning av filmfiler och spårning av leukocyter
OBS: Nikon förvärv programvara genererar .nd2 filer men följande förfarande skulle vara liknande med annan programvara och varumärken.
- Exportera filer som TIFF-serien.
- Gå till ImageJ programvara (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importera tiff-serien. Varje kanal som en annan fil.
- Applicera ett medianfilter med en radie på 2,0 pixel för de gröna och röda kanaler för att minska bakgrundsljud (Process> Filter> Median ...).
- Konvertera filer till binär (Process> Binary> Gör Binary). Aktivera programvaran för att beräkna tröskelvärdet för varje bild.
- Merge kanaler i en bildserie (Bild> Färga> Merge kanaler ...). Välj monocytema i green-kanal, neutrofilerna i den röda kanalen och det utsända ljuset i den grå kanalen.
- Konvertera staplade bilder till RGB-färger (Bild> Färga> Stack till RGB).
- Spara filen som .avi
- Data importeras och sammanställs i Imaris programvara (Bitplane). Förflyttning av monocyter och neutrofiler sedan spåras med hjälp av Tracking Wizard Spot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manuskriptet beskriver ett optimerat protokoll för att enkelt övervaka beteende monocyter och neutrofiler i mesenteriala venerna i nedsövda möss i realtid. Användningen av en 37 ° C-termostaterad kammare är obligatoriskt att bibehålla temperaturen hos musen och även på grund av den temperaturberoende rörelse av leukocyter. Framställning av musen visas i figur 1. Figur 2 visar alla området ses under mikroskop. Fallande ljus möjliggör identifiering av mesenteriala vener (röd pil) och artärer (blå pil).
Behandling av förvärvade bilder med ImageJ programvara genererade filmfiler, till exempel film 1 och film 2. Figur 3 visar de olika stegen i bildbehandling för första gången punkten Movie 1. Film 1 visar patrullerar i Ly6C låga monocyter under stationära betingelser , såsom tidigare frånritsas 6,8,14 medan alla neutrofiler cirkulerar i blodet. Ingen neutrofila är patrullerar endothelial väggen. Movie 2 visar samma intresseområde 90 minuter efter tillsatsen av TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 att lokalt initiera inflammation. I detta fall är neutrofiler och monocyter massivt rekryteras till den endoteliala väggen, som de skanna minutiöst. Det är viktigt att notera att tillsats av en TLR-agonist inducerar förändringar i endotelet bredd och följaktligen ändrar fokus för z-axeln. Därför bör fokus kontrolleras noggrant efter tillsats av agonist. Sammanställning av data i Imaris programvara (Bitplane) gör det möjligt att spåra enskilda leukocyter med hjälp av Tracking guiden Spot. Figur 4 visar de exakta spårvägar monocyter (grön) och neutrofiler (röd) patrullerar längs endotelet. Uppgifterna hämtas från analysen av Movie 2, det vill säga 90 minuter efter initiering av inflammation. Spårning av leukocyter vägar kan exporteras som TIFF-filer eller xls-filer för att få olika statistik som banlängd, förskjutning, varaktighet eller hastighet.
Denna teknik erbjuder ett trevligt sätt att övervaka beteendet hos monocyter och neutrofiler samtidigt före och efter inflammation. Det är möjligt att spåra rekrytering av dessa celler på den endoteliala väggen övertid. Förlust av fokus på z-axeln eller x / y förskjutning kan uppstå som en följd av tarmrörelser som förstör experimentet. Movie 3 visar en sådan misslyckade förberedelser och förvärv.
Figur 1. Mouse beredning.
Svarta pilar indikerar PBS vätta vävnad som används för att immobilisera tarmen. Vit pilspets indikerar 10cm vävnadsodlingsskål. T anger aluminium skräddarsydda fack skede som passar in i mikroskopet. Mesenteriska blodkärl är snyggt exponeras i mitten på täck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Grenar av mesenteriala vener och artärer.
Bilder (20 x 10) som tagits med en 10X mål syddes utgöra en stor bild av det tillgängliga området. Flera områden av intresse sedan valt att följa leukocyt rörelse med en 20X mål. Den röda pilen indikerar en tarmkäxvenen. Den blå pilen indikerar en mesenterial artär. Den gröna pilen indikerar fettvävnad som omger fartygen. Det mörka området på sidorna av de bildresultat från närvaron av vätta vävnad som används för att immobilisera tarmen. Vit skala stapel representerar 1 mm.k "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Bildbehandling med ImageJ.
De olika stegen i bildbehandling visas för första bilden av film 1. Grön (monocyter) och röda (neutrofiler) kanalerna behandlas separat. Till de ursprungliga rådata (A), är ett medianfilter appliceras (B) och omvandlas sedan till en binär bild (C). (D) Kanaler slås samman till en slutlig bild. Gröna eller röda linjer som observerats i rådata är celler som rör sig så snabbt att mikroskopet inte kan helt förvärva dem. Vit skala stapel representerar 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Individuellaleukocyt spår.
Spår av monocyter (A) och neutrofiler (B) patrullerar endotel behandlas med Imaris Software (Bitplane). Vit skala stapel representerar 40 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. Leukocyter skannar den endoteliala väggen vid det stabila tillståndet. Vid stationärt tillstånd, Ly6C låga monocyter patrullera endotelet. Neutrofiler cirkulerar enligt blodflödet. Neutrofiler är i rött och monocyter är i grönt. Skala stapel representerar 50 pm. Genereras med 20X objektiv. Klicka här för att se filmen.
GE = "always"> 
2:. Leukocyter avsökning av endoteliala väggen efter TLR2-förmedlad inflammation Samma område av intresse som i Film 1. Film startar 90 min efter tillsats av 20 pl PBS innehållande 100 | ig av Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 agonist) direkt på fartyget. Rekryterade monocyter och neutrofiler är minutiöst skanna endothelial muren. Neutrofiler är i rött och monocyter är i grönt. Skala stapel representerar 50 pm. Klicka här för att se filmen.
Movie 3: Resultat från felaktig förberedelse musrörelser av fartyg erhålls när anestesi eller immobilisering av tarmen är felaktiga.. Skala stapel representerar 50 pm.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" target = "_ blank"> Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs i detta manuskript ger en konsekvent strategi för att effektivt studera monocyt och neutrofil beteende mesenteriska ådror under stationära tillstånd och inflammatoriska tillstånd.
Det avgörande steget i beredningen är immobiliseringen av tarmen med PBS-vätta vävnader. Om det utförs på rätt sätt, är mesenteriska fartyg snyggt exponerad på täck för bildtagning. Detta möjliggör val av flera intresseområden för att övervaka leukocyt beteenden i mesenteriala ådror.
Vår protokoll innebär exteriorisering av mesenteriska fartyg innan experimenten, som gör det möjligt (1) för att direkt framkalla inflammation på de övervakade fartyg, och (2) för att spela den tidiga tidpunkter efter stimulering och (3) för att följa upp kinetik rekrytering av leukocyter och deras beteende i samma kärl före och efter induktion av inflammation.
Vi Överfer neutrofiler renades från mus benmärg från samma genetiska bakgrund och inte från blod eftersom fler celler kan erhållas per djur (6-12x10 6 vs 0.5-2x10 6 / mus). Om användning av blodneutrofiler föredrages, kan samma protokoll utföras för cellrening.
I intravital avbildning, är visualiseringen av vaskulaturen aktiveras av det transmitterade ljuset i fallet med mesenteriala kärl. Alternativt kan fluorescerande antikroppar mot PECAM1 (klon 390) eller fluorescerande hög molekylvikt dextran (70kDa eller 2 MDa) 6,14 vara iv injiceras för att detektera kärl. Till exempel var intra-testikelcancer injektion av 3 pg anti-PECAM1 (klon 390) rapporterade att möjliggöra kärldetektering med låg bakgrund och inte påverka leukocyter aktivitet i cremaster modellen 9. Jämfört med transmitterat ljus, användningen av fluorescerande antikroppar eller färgämnen, särskilt inför möjligheten av 3D-rekonstruktion av Vasculature, men en kanal offras till märkning och förvärvet tiden ökar. Överförda ljuset är tillräckligt i mesenter modellen tack vare öppenheten i kärlsystemet, som beskrivs här. Tvärtom är fluorescerande märkning av kärl obligatorisk i örat dermis eller ogenomskinliga organ.
Upptäckt av populationer av leukocyter kan åstadkommas med hjälp av transgena djur som uppvisar endogen fluorescens i specifika celltyper (monocyter Cx 3 CR1 EGFP / vikt 6 eller cd115 CFP 15 eller CD68 gfp 16, monocyter och neutrofiler Lys EGFP 9, och blodplättar CD41 YFP 17) . Även CX3CR1 uttrycks i alla monocyter och vissa undergrupper av NK- och T-celler, Cx 3 CR1 EGFP / vikt mus är intressant att skilja mellan inflammatorisk Ly6C <sup> höga monocyter som uppvisar mindre GFP fluorescens än bosatt Ly6C låga monocyter 6. Eftersom CD115 är specifik för monocytiska linjen, är MacBlue musen cd115 CFP en intressant modell. Det är dock inte möjligt att skilja Ly6C hög och Ly6C låga monocyter.
Ett alternativ till transgena fluorescerande möss är intravenös injektion av fluorescerande antikroppar för att märka populationer av leukocyter i realtid. Till exempel kan monocyter märkas med anti-CD115 (klon AFS98), neutrofiler med anti Ly6G (klon 1A8) och blodplättar med anti-CD49b (klon HMα2). I allmänhet är alla dessa antikroppar nedbrytande vid hög dos. Därför bör de användas med försiktighet för kort period av gånger och vid låga nivåer. Det bör noteras att även vid låg dos, en inverkan på cellfunktionen kan inte uteslutas. Personliga erfarenheter med små mängder (1-2 ug) möjliggör märkning av CD115 + månocytes och Ly6G + neutrofiler utan utarmning (data ej offentliggjort).
Trots att modellen av örat dermis kärl är icke-invasiv som örat är orörd, är djupet av örat dermis ett problem, vilket gör det till en modell mer passande för 2-foton mikroskopi 13. Dessutom är det inte möjligt att direkt stimulera kärlet i örat modellen utan att störa fysiskt preparatet.
Vår protokoll kan appliceras med vilken som helst inverterad konfokalmikroskop. Eftersom scanningshastighet och lasereffekt är maskinberoende, förvärv av en ram (512 x 512 bildpunkter, det vill säga 635 um) vid en enda z-planet kräver ungefär 2,2 sekunder med våra inställningar för galvano scanner av Nikon A1R. Tyvärr, begränsar detta låg hastighet möjligheten att spela in fyra-dimensionella filmer av mesenteriska vener utan att kvaliteten försämras. Resonans skanner av A1R erbjuder en hög upptagningshastighet, även omkvaliteten på bilderna är starkt reducerad (bakgrund kontra specifik signal) för våra experiment med CX 3 CR1 gfp / vikt mus. Det bör hållas i minnet att lasrar är inställd på mindre än 0,5% (<0,25 mW) för att undvika fototoxicitet och blekning.
Woodfin et al lyckades förvärva filmer i 4D (60 z-stack bilder i 40 sek) av cremaster venoler med hjälp av en Leica TCS-SP5 9. Som författarna bildvärdena av 20-40 mikrometer i diameter, de är förmodligen mindre känsliga för förändringar i fokus än i vår modell (övervakning av mesenteriala nerver av 200-400 um). När avbildning levande vävnad, är kontroll av fokus den viktigaste oro, vilket begränsar möjligheten att spela in en unik film som varar i flera timmar. Vi anser att filminspelning varar 30 minuter (eller 45 minuter) är den mest praktiska i mesenteriala modellen.
Tillsatsen av TLR-agonister förändrar bredden fartyget och därför fokus. Följaktligen,det är mycket svårt att avbilda korrekt den första 10-15 min efter stimulering tills kärlen stabiliseras.
En annan begränsning är experimentets varaktighet. På grund av svårigheten att bibehålla mus bedövades korrekt över en lång tidsperiod, är det svårt att avbilda mer än 4 h efter inflammation. Användning av andra anestesimedel, såsom kontinuerlig isofluran inandning, kan vara ett alternativ (även om det inte testats av oss).
I gamla möss (över 16 veckors ålder), ökad mängd fettdepåer runt fartyg minskar kvaliteten på visualisering av mesenteriala kärl. Därför är det bättre att köra experiment med 8-12 veckor gamla möss.
Denna teknik kan kombineras med intravenös injektion av antikroppar för att blockera molekyler av intresse eller bryter givna leukocytpopulationer, så att betydelsen av molekyler inblandade i leukocytrekrytering eller beteende kan bestämmas. Dessutom,andra leukocyter delmängder kan spåras med hjälp av andra transgena möss stammar som uttrycker fluorescerande proteiner i cellpopulationer av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
