Abstract
Indsatsen bliver effektiv immunrespons er afhængig af hurtig mobilisering af blodleukocytter til stedet for infektion eller skade. Undersøgelse af leukocytmigrering in vivo er afgørende for forståelsen af molekylære basis for leukocyt transendothelial migration og interaktion med vaskulære endotel. Et kraftfuldt tilgang indebærer intravital mikroskopi på transgene mus, der udtrykker fluorescerende proteiner i celler af interesse.
Her præsenterer vi en protokol for billeddiagnostiske monocytter og neutrofile i CX 3 CR1 GFP / vægt mus iv injiceret med orange farvestof-mærkede neutrofiler med en omvendt konfokal mikroskop. Time-lapse film indsamlet fra 30 minutter til flere timers billedbehandling tillader analyse af leukocyt adfærd i mesenteriske årer under både stationære og inflammatoriske tilstande. Vi beskriver også de skridt til lokalt at fremkalde blodkar betændelse med TLR2 / TLR1-agonist Pam3SK4 og overvåge subsequent rekruttering af neutrofiler og monocytter.
De præsenterede teknik kan også anvendes til at overvåge andre populationer af leukocytter og undersøge molekyler impliceret i leukocytrekruttering eller handel anvender andre stimuli eller transgene mus.
Introduction
Neutrofiler og monocytter er celler i det medfødte immunsystem, der kontinuerligt cirkulerer i blodet. Ved skade eller infektion, inflammatoriske signaler inducerer leukocyt diapedese i ødelagte og inficerede væv, heri indlede en cellulær immunreaktion 1-3. Den hurtighed, hvormed leukocyt mobilisering afgør det positive resultat af de immunreaktioner. Disse indviklede processer er afhængige af specifikke molekyler (f.eks selectiner, endotel-bundne kemokiner) til stede på den betændte endotel, der hjælper til etablering af selvklæbende kontakter mellem cirkulerende leukocytter og endotelet 1-3 .For få indblik i molekylerne impliceret i leukocyt rekruttering kaskade, er det vigtigt at visualisere kinetik celletilgang og til at spore adfærd hver celle / population. En effektiv fremgangsmåde involverer intravital mikroskopi på transgene mus, der udtrykker fluorescerende proteiner i celler af interesse.
indhold "> Hidtil blev adskillige metoder, der anvender intravital mikroskopi udviklet til at afbilde vaskulaturen 4,5. For eksempel blev billeddannelse af øre dermis vaskulatur eller mesenteriske årer af intravital konfokal mikroskopi anvendes til at identificere patruljering adfærd murine Ly6C lave monocytter og humane CD14 CD16 + dim monocytter på den luminale side af blodkar under steady-state betingelser 6-8. Musen cremaster vaskulatur model anvendes ofte til at overvåge adfærden af neutrofiler eller inflammatorisk Ly6C høje monocytter under inflammatoriske eller iskæmiske tilstande i transgene mus. I denne tilfælde er cremaster stimuleres via intrascrotal injektion af IL1β, CCL2, TNFp eller fMLP. Efter 2-4 timer, væv derefter kirurgisk blotlagt og analyseret af intravital konfokal mikroskopi 9-11.Følgende protokol beskriver en fremgangsmåde til overvågning af monocytter og neutrofiler samtidig med enhverinverteret fluorescens konfokalt mikroskop. Desuden er vores metode detaljer, hvordan billedet det samme fartøj før (steady state tilstand), og efter inflammation og hvordan at følge kinetikken af leukocytrekruttering. Til dette formål bruger vi CX 3 CR1 GFP / vægt mus, hvis monocytter udtrykker eGFP, iv injiceret med en orange farvestof-mærkede murine neutrofiler. Brug en omvendt konfokal mikroskop, er det muligt (1) til at spore og analysere patruljering Ly6C lave monocytter under steady state betingelser og (2) at følge rekrutteringen af både monocytter og neutrofiler i samme fartøj efter lokal inflammation. Her skaber vi de inflammatoriske tilstande ved at bruge TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12. Desuden kan en sådan billeddannelse med til at bestemme rollen af specifikke molekyler af interesse i de forskellige trin af leukocytrekruttering kaskade, hvis det sker på specifikke knock-out-mus eller tilstedeværelse af blokerende antistoffer 6,9,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Animal procedurer blev udført i overensstemmelse med den institutionelle Etisk Komité Animal Care i Genève, Schweiz og Cantonal Veterinærkontoret. Autorisationsnummer GE / 63/14.
1. Udarbejdelse af en enkelt celle suspension fra knoglemarv
- Sacrifice mus (8-12 uger gamle) ved cervikal dislokation. Sterilisere bagbenene med 70% ethanol. Fjern skind fra bagbenene.
- Dissekere ud mus lårben og skinneben og fjerne væv fra ben med en skalpel. Skyl ben med 90% ethanol og anbringes i en skål fyldt kultur med PBS.
- Under kultur hætte, rene væv fra lårben og skinneben med en skalpel og separat på knæleddet. Skær hver ende af knoglerne.
- Flush knoglemarv fra hvert ben under anvendelse af en 23G nål og en 1 ml sprøjte fyldt med fremstilling medium (phenolrødt-frit DMEM / F12, 1% rotteserum), i en 50 ml skrue røret. Forstyrre celleaggregater ved fint passage gennem 23G neEdle og en 1 ml sprøjte. Bring samlet volumen på 25 ml med fremstilling medium.
- Centrifuger 250 xg 5 min, 4 ° C. Supernatanten kasseres. Resuspender pellet i 1 ml Red Blood Cell Lysis RBLC puffer (8,3 g NH4Cl, 1 g NaHCO3, 1 ml EDTA (100 mM), komplet til 1 l med destilleret vand, 0,22 um) i en 15 ml skrue røret. Inkuber 30 sek på is.
- Der tilsættes 10 ml forberedelse medium og centrifuger 250 xg, 5 min, 4 ° C. Supernatanten kasseres, og resuspender i 2 ml præparat medium.
2. Neutrofil Berigelse af negativ selektion
- Tilsæt 150 pi Mouse neutrofil berigelse cocktail (celleisoleringsfremgangsmade platform kit såsom EasySep). Blandes og inkuberes på is i 10 min.
- Der tilsættes 10 ml phenolrødtfrit DMEM. Vend gang og centrifugeres 250 xg, 3 min, 4 ° C.
- Supernatanten kasseres. Resuspender pellet i 1,75 ml præparat medium i 5 ml polystyren rundbundede rør. Tilsæt 250 pi Bioti Valg Cocktail. Blandes og inkuberes på is i 10 min.
- Vortex de magnetiske partikler (fra cellen isolation platform kit) i 30 sek for at resuspendere partiklerne. Tilføj 500 pi magnetiske partikler til celle suspension. Blandes og inkuberes på is i 10 min.
- Placer røret i magneten. Vent 3 min.
- Vend magneten på en ny 5 ml polystyren rundbundede rør til at indsamle de ønskede umærkede celler. Du må ikke tage den sidste dråbe hængende i røret. Uønskede celler vil forblive i røret inde i magneten. Kassér dette rør ind i en biologisk farligt affald.
- Placere den nye slange i magneten. Vent 3 min.
- Vend magneten på en ny 15 ml skrue røret for at indsamle de ønskede umærkede celler. Du må ikke tage den sidste dråbe hængende i røret.
- Komplet volumen til 5 ml med phenolrødt frit DMEM.
3. Mærkning af neutrofiler
- Tilføj 0,5 ul af en orange farvestof såsom Cell Tracker Orange (arbejder koncentration1 uM, CMRA - chlormethyl-rodol-acetat, 10 mM stock i DMSO). Inkuber 2 minutter ved 37 ° C.
- Tilføj 2,5 ml præparat medium. Centrifuger 250 xg 5 min, 4 ° C.
- Supernatanten kasseres. Resuspender pellet i 1 ml præparat medium i et 1,5 ml rør.
- Tag en portion til at tælle med hematocytometer.
- Inkuber 5 min ved 37 ° C. Centrifuger 250 xg 5 min, 4 ° C.
- Supernatanten kasseres. Resuspender pellet i 1 ml PBS. Centrifuger 250 xg 5 min, 4 ° C for at vaske.
- Supernatanten kasseres. Resuspender pellet 10x10 6 celler pr 100 pi PBS. Hold på is indtil iv injektion. BEMÆRK: celler skal være iv injiceret så hurtigt som muligt. 6-12x10 6 neutrofiler / mus er normalt opnås.
4. Mus Forberedelse til Intravital Microscopy
BEMÆRK:.. Trin 4.1) og 4.2) bør udføres i begyndelsen af forsøget for at undgå forlænget ventetid af mærkede neutrofiler på ice.
- CX 3 CR1 GFP mus (8-12 uger gamle) afvejes.
- Forbered 800 pi anæstetika (ketamin 60 mg / kg, xylazin 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg i PBS).
- Bedøve mus. Injektion ip med 200 pi / 20 g mus. Kontrol anæstesi ved tå klemme og ved at kontrollere respirationsfrekvens.
- Injicer neutrofiler (10x10 6 celler i 100 pi PBS) intravenøst ved hjælp af laterale halevener eller retroorbitale bihule ved hjælp af forsøgslederen.
- Sæt musen på varmepuden og beskytte øjnene med okulær gel.
- Et dækglas (mm diameter 35) sættes i en 10 cm vævskulturskål, der har en huldiameter 30 mm. Brug olie er at opretholde vævskulturskål i kontakt med dækglas.
- Incise abdominale hud med en saks for at blotlægge peritoneum. Incise bughinden med en saks for at eksponere tarmen.
- Tilsæt 200 pi PBS (forvarmet ved 37 ° C) i peritoneal hulrum. Tag musen i hånden og slå den med forsiden nedad, så tarmen får ud af bughulen med et let tryk. Placer musen i vævskulturskål.
- Forsigtigt deroll tarmen med steriliseret vatpinde på dækglasset med henblik på at blotlægge mesenteriske fartøjer.
- Skær papir væv i bands og våd dem med 37 ° C opvarmet PBS. Immobilisere tarmen med stykker af papir væv til at mindske bevægelserne som følge af peristaltikken.
- Sæt vævsdyrkningsskål og musen inde i 37 ° C termostatstyret kammer på skræddersyet bakke fase af inverteret mikroskop. Indføre en sprøjte indeholdende bedøvelsesmidler fm i bagbenet. BEMÆRK: Derudover kan musen modtage oxygen (0,5 L / min) med en maske.
- Kontrol mus til anæstesi ved tå klemme og kontrollere respirationsfrekvens hver 30 min. Hvis det er nødvendigt, levere et løft af anæstetika (20 ul) til korrekt opretholde anæstesi. IKKEE: Tørring af vaskulaturen bør undgås. Derfor er dens fugtighed opretholdes ved regelmæssigt at fugte papirlommetørklæder anvendes til at immobilisere tarmen med 37 ° C opvarmet PBS.
5. Måling Neutrofil og Monocyt Opførsel i det betændte Fartøjer in vivo ved hjælp Intravital Microscopy
- Set lasere til 488- og 561- på det laveste strømforbrug nødvendig for at undgå laser-induceret fototoksicitet. I vores eksperimenter, den er lavere end 0,5%. Intensitet af GFP i monocytter og orange farvestof i neutrofiler er så lyse, der normalt 0,3% er nok. BEMÆRK: Dette er en laser effekt på 0,15-0,25 mW med vores system.
- Erhverve billeder af 512 x 512 pixels (dvs. 635 um) i 2,2 sek med en åben pinhole under anvendelse af 20X tør mål for inverteret mikroskop. Brug en z-dybde på mellem 10 til 20 pm, der sikrer en tilstrækkelig signal med den lave lasereffekter.
BEMÆRK: Vi normalt udfører eksperimenter med en z-dybde mellem 12.-1656 m. I tilfælde af registrerede tal og film, z-dybde er 20 um. Fasekontrast muliggør identifikationen af endotelceller vægge og billedbehandling udføres på mesenteriske årer. Siden patruljerer celler bevæger sig ganske langsomt med en hastighed på 5-10 um / min 6, optager en interesseområde hver 20 sek er tilfredsstillende. Med de beskrevne indstillinger, den motoriserede scenen tillader registrering af op til 7 interesseområder samtidig. - Placer musen og mesenteriale fartøjer i termostaten kammer af mikroskopet er give dem mulighed for at komme sig forberedelsen af 30 minutter før købet af den første film. I løbet af denne tid, skal du vælge flere områder af interesse. Fokus på den luminale overflade af karret tættest på målet. Hvis det er nødvendigt, drage fordel af den lille autofluorescens af endothel at indstille fokus.
BEMÆRK: Kirurgi under forberedelse musen understreger anelse endotelet. Følgelig rullende af neutrofiler og/ eller monocytter kan observeres i de første 15 min efter muse forberedelse. - Optage en første film i 30 min under steady state, et billede hver 20 sek.
BEMÆRK: Softwaren erhverver hvert felt af interesse i 2,2 sek og den motoriserede etape bevæger sig automatisk fra et felt til det andet. Det går tilbage til den første position inden for 20 sek i de sidste 30 minutter af optagelsen filmen. - For at starte fartøj betændelse blod, tilsættes en dråbe 20 pi PBS indeholdende 100 ug TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 direkte på de afbildede skibe.
- Styre fokus for hvert interesseområde.
BEMÆRK: I løbet af købet, er der altid små ændringer fokus på z-aksen. På trods af den 10-20 um z-dybden, kan dette resultere i et fald i fluorescensintensitet. Derfor manuelt koncentrere hvert felt af interesse ved slutningen af hver film, hvis det er nødvendigt. Optag film for 30 min-perioder og op til 3 timer tiltal efter påbegyndelse af inflammation. - Ved afslutningen af forsøget, ofre bedøvede mus ved cervikal dislokation.
6. Generering af filmfiler og sporing af leukocytter
BEMÆRK: Nikon erhvervelse software genererer .nd2 filer, men den følgende procedure ville være lignende med anden software og mærker.
- Eksport filer som tiff-serien.
- Gå til ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importer tiff-serien. Hver kanal som en anden fil.
- Påfør en median filter med en radius på 2,0 pixel for de grønne og røde kanaler til at reducere baggrundsstøj (Proces> Filtre> Median ...).
- Konvertere filer i binær (Proces> Binary> Make Binary). Aktiver softwaren til beregning af tærsklen for hvert billede.
- Flet kanaler til én billedserier (Image> Farve> Flet Kanaler ...). Vælg monocytterne i green-kanal, neutrofilerne i den røde kanal og det transmitterede lys i det grå kanal.
- Konverter stablet billeder i RGB-farver (Image> Farve> Stack til RGB).
- Gem filen som .avi
- Data er importeret og samlet i Imaris software (Bitplane). Bevægelser af monocytter og neutrofile derefter spores ved hjælp af guiden Spot Tracking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manuskriptet beskriver en optimeret protokol til nemt at overvåge adfærden af monocytter og neutrofiler i de mesenteriske årer af bedøvede mus i realtid. Anvendelsen af en 37 ° C-termostateret kammer er obligatorisk at holde temperaturen af musen og også på grund af temperaturafhængig bevægelse af leukocytter. Fremstilling af mus er vist i figur 1. Figur 2 viser alle området ses under mikroskop. Transmitteret lys muliggør identifikation af mesenteriske årer (rød pil) og arterier (blå pil).
Behandling af erhvervede billeder med ImageJ software genereret filmfiler, såsom Movie 1 og Movie 2. Figur 3 viser de forskellige trin i billedbehandling for første gang punkt i Movie 1. Movie 1 viser patruljering af Ly6C lave monocytter under steady state betingelser som tidligere debeskrevet 6,8,14 mens alle neutrofiler cirkulerer i blodbanen. Nr neutrofil er patruljerer endotel væg. Movie 2 viser det samme område af interesse 90 minutter efter tilsætningen af TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 lokalt initiere inflammation. I dette tilfælde er neutrofiler og monocytter massivt rekrutteret til endotel væggen, som de scanne omhyggeligt. Det er vigtigt at bemærke, at tilsætning af en TLR agonist inducerer ændringer i endotel bredde og dermed ændrer fokus for z-aksen. Derfor bør styres omhyggeligt fokus efter tilsætning af agonisten. Indsamling af data i Imaris software (Bitplane) gør det muligt at spore de enkelte leukocytter hjælp af guiden Spot Tracking. Figur 4 viser de nøjagtige spor stier monocytter (grøn) og neutrofiler (rød) patruljerer langs endotel. Opnås Data fra analysen af Movie 2, dvs 90 min efter indledningen af inflammation. Sporing af leukocyt stier kan eksporteres som TIFF-filer eller xls-filer for at få forskellige statistikker såsom banelængde, forskydning, varighed eller hastighed.
Denne teknik giver en pæn måde at overvåge adfærden af monocytter og neutrofiler samtidig før og efter inflammation. Det er muligt at spore rekrutteringen af disse celler på endotel væggen overtid. Tab af fokus på z-aksen eller endda x / y forskydning kan forekomme som en konsekvens af tarm bevægelser, der ødelægger eksperimentet. Movie 3 illustrerer en sådan mislykkedes forberedelse og opkøb.
Figur 1. præparat Mus.
Sorte pile angiver PBS-befugtet væv, der anvendes til at immobilisere tarmen. White pilespids angiver 10cm vævskulturskål. T angiver aluminium specialfremstillet bakke fase, der passer ind i mikroskopet. Mesenterial blodkar er pænt eksponeret i midten på dækglasset. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Filialer af de mesenteriske vener og arterier.
Billeder (20 x 10), taget med et 10X mål blev syet til at udgøre et stort billede af den tilgængelige område. Flere områder af interesse derefter valgt at overvåge leukocyt bevægelse med en 20X målsætning. Den røde pil viser en mesenterialvene. Den blå pil angiver en mesenterialarterie. Den grønne pil viser fedtvævet omkring skibene. Det mørke område på siderne af billedet resultater fra tilstedeværelsen af befugtet væv, der anvendes til at immobilisere tarmen. Hvid skalalinjen repræsenterer 1 mm.k "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Billedbehandling med ImageJ.
De forskellige trin i billedbehandling er illustreret for det første billede af Movie 1. Grøn (monocytter) og røde (neutrofiler) kanaler behandles separat. Til de oprindelige rådata (A), er et medianfilter anvendt (B) og derefter omdannet til et binært billede (C). (D) Kanaler flettes ind i et endeligt billede. Grønne eller røde linjer observeret i rådata er celler, der bevæger sig så hurtigt, at mikroskopet ikke er i stand til helt at erhverve dem. Hvid skala søjle repræsenterer 40 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Individuelleukocyt spor.
Spor af monocytter (A) og neutrofiler (B) patruljerer endotelet behandles med Imaris Software (Bitplane). Hvid skala søjle repræsenterer 40 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. Leukocytter scanning af endotel væggen ved steady state. Ved steady state, Ly6C lave monocytter patruljere endotelet. Neutrofiler cirkulerer ifølge blodgennemstrømningen. Neutrofiler er i rødt og monocytter er i grønt. Målestokken repræsenterer 50 um. Genereret med 20X målsætning. Klik her for at se denne video.
ge = "altid"> 
2:. Leukocytter scanning af endotel væggen efter TLR2-medieret inflammation samme område af interesse som i Movie 1. Movie starter 90 minutter efter tilsætning af 20 pi PBS indeholdende 100 ug Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 agonist) direkte på beholderen. Rekrutteret monocytter og neutrofiler er omhyggeligt at scanne endotel væg. Neutrofiler er i rødt og monocytter er i grønt. Scale søjle repræsenterer 50 um. Klik her for at se denne video.
Film 3: Resultater opnået ved forkert mus forberedelse Bevægelser af fartøjer opnået, når anæstesi eller immobilisering af tarmen er forkerte.. Målestokken repræsenterer 50 um.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" target = "_ blank"> Klik her for at se denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet i dette manuskript metoder giver en konsekvent tilgang til effektivt at studere monocyt og neutrofil adfærd i mesenteriske årer under stationære eller inflammatoriske tilstande.
Det afgørende trin i forberedelse er immobilisering af tarmen med PBS-fugtede væv. Hvis udført korrekt, er mesenteriske fartøjer pænt eksponeret på dækglasset for billedoptagelse. Dette gør det muligt at udvælge flere områder af interesse for at overvåge leukocyt adfærd i mesenteriske årer.
Vores protokol involverer eksteriorisering af mesenteriske fartøjer før starten af eksperimenterne, der gør det muligt (1) til direkte at inducere inflammation på de overvågede fartøjer, og (2) til at registrere de tidlige tidspunkter efter stimulering og (3) at følge op kinetik rekruttering af leukocytter og deres adfærd i den samme beholder før og efter induktion af inflammation.
Vi transfER neutrofiler oprenset fra murine knoglemarv af samme genetiske baggrund og ikke af blod som kan opnås flere celler per dyr (6-12x10 6 vs 0.5-2x10 6 / mus). Hvis anvendelsen af blodneutrofiler foretrækkes, kan den samme protokol udføres for celle oprensning.
I intravital billeddannelse, er visualisering af vaskulaturen aktiveret af det transmitterede lys i tilfælde af mesenteriske fartøjer. Alternativt kan fluorescerende antistoffer mod PECAM1 (klon 390) eller fluorescerende høj molekylvægt dextran (70 kDa eller 2 MDA) 6,14 være iv injiceret til påvisning vaskulaturen. For eksempel blev intra-scrotal injektion af 3 ug anti-PECAM1 (klon 390) rapporteret at aktivere vaskulatur detektion med lav baggrund og ikke at påvirke leukocytaktivitet i cremaster model 9. Sammenlignet med transmitteret lys, brug af fluorescerende antistoffer eller farvestoffer bl.a. åbner mulighed for 3D-rekonstruktion af vasculature, men en kanal er ofret til mærkning og købet tiden øges. Transmitterede lys er tilstrækkeligt i mesenter model takket være gennemsigtighed vaskulaturen, som beskrevet her. Tværtimod er obligatorisk i øret dermis eller uigennemsigtige organer fluorescerende mærkning af karrene.
Påvisning af populationer af leukocytter kan opnås ved anvendelse af transgene dyr, der udviser endogen fluorescens i specifikke celletyper (monocytter CX3 CR1 eGFP / vægt 6 eller cd115 CFP 15 eller CD68 GFP 16 monocytter og neutrofiler Lys eGFP 9 og blodplader CD41 YFP 17) . Selvom CX3CR1 udtrykkes i alle monocytter og nogle undergrupper af NK- og T-celler, Cx 3 CR1 eGFP / vægt mus er interessant at skelne mellem inflammatorisk Ly6C <sup> høje monocytter, der udviser mindre GFP-fluorescens end bosiddende Ly6C lave monocytter 6. Da CD115 er specifik for monocytisk linje, den MacBlue musen cd115 fælles fiskeripolitik er en interessant model. Det er imidlertid ikke muligt at skelne Ly6C høje og lave Ly6C monocytter.
Et alternativ til transgene mus fluorescerende er iv injektion af fluorescerende antistoffer til at mærke populationer af leukocytter i realtid. For eksempel kan monocytter mærkes med anti-CD115 (klon AFS98), neutrofiler med anti-Ly6G (klon 1A8) og blodplader med anti-CD49b (klon HMα2). Generelt er alle disse antistoffer nedbrydende ved høj dosis. Derfor bør de anvendes med forsigtighed til kort periode gange og på et lavt niveau. Det skal bemærkes, at selv ved lave doser, en indvirkning på cellefunktion kan ikke udelukkes. Personlig erfaring med lave mængder (1-2 ug) muliggør mærkning af CD115 + monocytes og Ly6G + neutrofiler uden udtømning (data ikke offentliggjort).
Selv den model af øre dermis vaskulaturen er non-invasiv, da øret er uberørt, dybden af øret dermis er en bekymring, hvilket gør det en model mere egnet til 2-foton mikroskopi 13. Desuden er det ikke muligt direkte at stimulere skibet i øret-model uden at forstyrre fysisk forberedelse.
Vores protokol kan anvendes med enhver inverteret konfokalt mikroskop. Da scanningshastighed og laser magt er maskine-afhængige, erhvervelse af en ramme (512 x 512 pixels, dvs 635 um) på et enkelt z-planet kræver ca. 2,2 sek med vores indstillinger for galvanisk scanneren af Nikon A1R. Desværre er dette lav hastighed begrænser muligheden for at optage fire-dimensionelle film af mesenteriske årer, uden tab af kvalitet. Resonant scanner af A1R tilbyder en høj erhvervelse hastighed, selv omkvaliteten af billeder er stærkt reduceret (baggrund versus specifikt signal) for vores eksperimenter med CX 3 CR1 GFP / vægt mus. Det skal holdes for øje, at lasere er fastsat på mindre end 0,5% (<0,25 mW) for at undgå fototoksicitet og blegning.
Woodfin et al formået at erhverve film i 4D (60 z-stack billeder i 40 sek) af cremaster venuler ved hjælp af en Leica TCS-SP5 9. Som forfatterne billedværdierne på 20-40 um i diameter, er de sandsynligvis mindre følsomme over for ændringer i fokus end i vores model (overvågning af mesenteriske årer på 200-400 um). Når billeddannelse levende væv, kontrol af fokus er den vigtigste bekymring, som begrænser muligheden for at optage en unik film varer flere timer. Vi mener, at optagelse af film, der varer 30 minutter (eller 45 min) er den mest praktiske i mesenteriale modellen.
Tilsætningen af TLR agonister ændrer fartøjets bredde og fokus. FølgeligDet er meget vanskeligt at billedet korrekt første 10-15 min efter stimulering, indtil beholderne stabiliseres.
En anden begrænsning er varigheden af eksperimentet. På grund af vanskeligheden ved at fastholde musen bedøvet korrekt i lang tid, er det vanskeligt at billedet mere end 4 timer efter inflammation. Anvendelsen af andre anæstetika, såsom kontinuerlig isofluran inhalation, kunne være en mulighed (dog ikke testet af os).
I gamle mus (over 16 uger), øget mængde af fedtdepoter omkring skibe falder kvaliteten af visualisering af mesenteriske fartøjer. Derfor er det bedre at køre eksperimenter med 8-12 uger gamle mus.
Denne teknik kan kombineres med iv injektion af antistoffer til at blokere molekyler af interesse eller nedbryder givne leukocytpopulationer, således at betydningen af molekyler involveret i leukocyt rekruttering eller adfærd kan bestemmes. Derudoverandre leukocyt delmængder kan spores ved hjælp af andre transgene musestammer udtrykker fluorescerende proteiner i celle populationer af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
