Abstract
Risposta immunitaria efficace dipende da una rapida mobilitazione dei leucociti del sangue al sito di infezione o lesioni. Indagare la migrazione dei leucociti in vivo è di fondamentale importanza per la comprensione delle basi molecolari della migrazione dei leucociti transendoteliale e l'interazione con l'endotelio vascolare. Un approccio potente coinvolge microscopia intravitale su topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule di interesse.
Qui vi presentiamo un protocollo per i monociti imaging e neutrofili nel CX 3 CR1 GFP / peso del mouse iv iniettato con arancio neutrofili dye-etichettati con un microscopio confocale invertito. Film time-lapse raccolti da 30 minuti a diverse ore dell'imaging permettere l'analisi del comportamento dei leucociti nelle vene mesenteriche sia in condizioni di stato e infiammatorie costante. Abbiamo inoltre descritti i passi per indurre localmente infiammazione dei vasi sanguigni con TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 e monitorare la subsequent reclutamento dei neutrofili e monociti.
La tecnica presentata può anche essere utilizzato per monitorare altre popolazioni di leucociti e indagare le molecole implicate nel reclutamento dei leucociti o nel traffico con altri stimoli o topi transgenici.
Introduction
Neutrofili e monociti sono cellule del sistema immune innato che circolano continuamente nel sangue. Su lesioni o infezioni, segnali infiammatori inducono leucociti diapedesi in tessuti danneggiati e infetti, qui l'avvio di una risposta immunitaria cellulare 1-3. La rapidità di leucociti mobilizzazione determina l'esito positivo delle risposte immunitarie. Questi processi intricati basano su molecole specifiche (ad esempio, selectine, chemochine endotelio-bound) presenti sull'endotelio infiammata che aiutano per la creazione di contatti tra adesivi leucociti circolanti e l'endotelio 1-3 .Per ottenere approfondimenti sulle molecole implicate nella leucociti assunzione in cascata, è importante visualizzare la cinetica di reclutamento di cellule e per monitorare il comportamento di ciascuna cella / popolazione. Un metodo efficace consiste microscopia intravitale su topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti in cellule di interesse.
content "> Ad oggi, diversi approcci usando la microscopia intravitale sono stati sviluppati per l'immagine del sistema vascolare 4,5. Ad esempio, l'imaging del derma orecchio vascolarizzazione o vene mesenteriche mediante microscopia confocale intravitale è stato utilizzato per identificare il comportamento pattugliamento delle Ly6C murino monociti bassi e umano CD14 dim CD16 + monociti sul lato luminale dei vasi sanguigni a regime di 6-8. Il modello di vascolarizzazione del mouse cremastere viene spesso utilizzato per monitorare il comportamento di neutrofili o Ly6C infiammatoria elevati monociti in condizioni infiammatorie o ischemiche in topi transgenici. In tale caso, Cremaster è stimolata mediante iniezione intrascrotale di IL1β, CCL2, TNFβ o fMLP. Dopo 2-4 ore, i tessuti vengono poi chirurgicamente esteriorizzate e analizzati da confocale microscopio intravitale 9-11.Il protocollo seguente descrive un metodo per monitorare monociti e neutrofili contemporaneamente con qualsiasifluorescenza invertito microscopio confocale. Inoltre, il nostro metodo descrive come immagine stessa nave prima (condizione di stato stazionario) e dopo l'infiammazione e come seguire la cinetica di reclutamento dei leucociti. A questo scopo, si usa il CX 3 CR1 topo GFP / peso, il cui monociti esprimere eGFP, iv iniettato con un arancio neutrofili murini dye-etichettati. Utilizzando un microscopio confocale invertito, è possibile (1) per monitorare e analizzare le pattugliamento Ly6C basse monociti in condizioni stazionarie e (2) a seguire l'assunzione di entrambi i monociti e neutrofili nella stessa nave dopo infiammazione locale. Qui creiamo le condizioni infiammatorie utilizzando l'agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Inoltre, tali immagini può aiutare a determinare il ruolo di specifiche molecole di interesse nelle varie fasi della cascata reclutamento dei leucociti se eseguita su specifici topi knock-out o in presenza di anticorpi bloccanti 6,9,13.
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Protocol
NOTA: le procedure di animali sono stati eseguiti in conformità con la Comitato Etico Istituzionale di Animal Care a Ginevra, in Svizzera e l'Ufficio cantonale di veterinaria. Numero di autorizzazione GE / 63/14.
1. Preparazione di una sospensione singola cella da midollo osseo
- Mouse Sacrificio (8-12 settimane di età) per dislocazione cervicale. Sterilizzare zampe posteriori con il 70% di etanolo. Togliere la pelle dalle gambe posteriori.
- Sezionare femori e tibie e il mouse rimuovere il tessuto da gambe con un bisturi. Sciacquare gambe con il 90% di etanolo e posto in un piatto cultura piena di PBS.
- Sotto il cofano della cultura, il tessuto pulito da femore e tibia con un bisturi e separato ginocchio. Tagliare ogni estremità delle ossa.
- Lavare midollo osseo da ciascun osso utilizzando un ago 23G e una siringa da 1 ml riempito con media preparazione (fenolo aneritro DMEM / F12, siero di ratto 1%), in 50 ml vite tubo. Disrupt aggregati di cellule da delicatamente passaging attraverso il non 23Gedle e una siringa da 1 ml. Portare il volume totale di 25 ml di media preparazione.
- Centrifuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1 ml Globulo rosso tampone Lysis rblc (8,3 g di NH 4 Cl, 1 g NaHCO 3, 1 ml di EDTA (100 mm), completo di 1 L con acqua distillata, filtrare 0,22 micron) in 15 ml di vite tubo. Incubare 30 sec su ghiaccio.
- Aggiungere 10 ml di terreno preparato e centrifugare a 250 xg, 5 min, 4 ° C. Gettare il surnatante e risospendere in 2 ml di mezzo di preparazione.
2. neutrofili Arricchimento per selezione negativa
- Aggiungere 150 ml di mouse cocktail neutrofili arricchimento (isolamento delle cellule kit piattaforma come EasySep). Mescolare e incubare in ghiaccio per 10 min.
- Aggiungere 10 ml di fenolo DMEM rosso gratuito. Invertire una volta e centrifugare 250 xg, 3 min, 4 ° C.
- Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1,75 ml di media preparazione in 5 ml di polistirolo tubi tondi fondo. Aggiungere 250 microlitri Biotin Selezione Cocktail. Mescolare e incubare in ghiaccio per 10 min.
- Agitare le particelle magnetiche (dal kit piattaforma di isolamento delle cellule) per 30 secondi per risospendere le particelle. Aggiungere 500 microlitri di particelle magnetiche sospensione cellulare. Mescolare e incubare in ghiaccio per 10 min.
- Mettere la provetta a magnete. Attendere 3 minuti.
- Invertire il magnete su un nuovo 5 ml polistirolo tubi tondi fondo per raccogliere le cellule senza etichetta desiderati. Non prendere l'ultima goccia appeso nel tubo. Cellule indesiderate rimarranno nel tubo all'interno del magnete. Eliminare questo tubo in una rifiuti a rischio biologico.
- Posizionare il nuovo tubo nel magnete. Attendere 3 minuti.
- Invertire il magnete su un nuovo 15 ml vite tubo per raccogliere le cellule senza etichetta desiderati. Non prendere l'ultima goccia appeso nel tubo.
- Completa il volume a 5 ml con rosso fenolo DMEM gratuito.
3. Etichettatura dei neutrofili
- Aggiungere 0,5 ml di un colorante arancione come il cellulare Tracker Orange (concentrazione di lavoro1 micron, CMRA - clorometil-rodol-acetato, magazzino 10 mM in DMSO). Incubare 2 min a 37 ° C.
- Aggiungere 2,5 ml di terreno preparato. Centrifuga 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1 ml di media preparazione in una provetta da 1,5 ml.
- Prelevare un 'aliquota di contare con hematocytometer.
- Incubare 5 minuti a 37 ° C. Centrifuga 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Surnatante scarto. Risospendere pellet in 1 ml di PBS. Centrifugare 250 xg, 5 min, 4 ° C per lavare.
- Surnatante scarto. Risospendere il pellet come 10x10 6 cellule per 100 l di PBS. Tenere in ghiaccio fino a iniezione endovenosa. NOTA: cellule devono essere iv iniettato il più rapidamente possibile. 6-12x10 6 neutrofili / mouse sono solitamente ottenuti.
4. Preparazione del mouse per intravitale Microscopia
NOTA:.. Fase 4.1) e 4.2) deve essere eseguita all'inizio dell'esperimento per evitare tempi di attesa prolungato di neutrofili etichettati sulla ice.
- Pesare il CX 3 CR1 topo GFP (8-12 settimana di vita).
- Preparare 800 ml di anestetici (ketamina 60 mg / kg, xilazina 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg in PBS).
- Anestetizzare il mouse. Ip Iniezione con 200 microlitri / 20 g di mouse. Controllo anestesia da punta pizzicotti e controllando la frequenza respiratoria.
- Iniettare neutrofili (10x10 6 cellule in 100 microlitri di PBS) per via endovenosa utilizzando le vene coda laterali o seno retro-orbitale, alla convenienza dello sperimentatore.
- Ponga il mouse sul tappetino riscaldamento e proteggere gli occhi con il gel oculare.
- Un coprioggetto di vetro (diametro 35 mm) viene messo in un piatto di coltura di tessuto 10 cm, che ha un foro di diametro 30 mm. Usare olio è di mantenere il piatto di coltura di tessuto a contatto con il coprioggetto.
- Incidere la pelle addominale con le forbici per esporre il peritoneo. Incidere peritoneo con le forbici per esporre intestino.
- Aggiungere 200 microlitri di PBS (preriscaldata a 37 ° C) in pcavità eritoneal. Prendete il mouse in mano e girare a faccia in giù, in modo che l'intestino esce dalla cavità peritoneale con una leggera pressione. Posizionare il mouse nel piatto coltura di tessuti.
- Deroll delicatamente l'intestino con bastoncini di cotone sterilizzati sul vetrino, al fine di esporre i vasi mesenterici.
- Tagliate fazzoletti di carta in bande e bagnarli con 37 ° C riscaldata PBS. Immobilizzare l'intestino con i pezzi di fazzoletti di carta per ridurre i movimenti risultanti dal peristalsi.
- Mettere il piatto di coltura tissutale e il mouse all'interno della camera termostatata 37 ° C sul palco del vassoio su misura del microscopio invertito. Introdurre una siringa contenente anestetici sc nella zampa posteriore. NOTA: Inoltre, il mouse può ricevere ossigeno (0,5 L / min) con una maschera.
- Il mouse di controllo per l'anestesia da punta pizzicare e il controllo della frequenza respiratoria ogni 30 min. Se necessario, fornire una spinta di anestetici (20 ml) per mantenere correttamente anestesia. NONE: Essiccamento della vascolarizzazione deve essere evitato. Pertanto, l'umidità è mantenuta bagnando regolarmente i fazzoletti di carta usati per immobilizzare l'intestino con 37 ° C-riscaldato PBS.
5. Misurazione dei neutrofili e monociti comportamento in recipienti infiammate In Vivo con intravitale Microscopia
- Impostare laser per 488- 561- e alla potenza minima necessaria per evitare la fototossicità indotta da laser. Nei nostri esperimenti, è inferiore a 0,5%. Intensità di GFP in monociti e arancio tintura dei neutrofili è così intensa che di solito lo 0,3% è sufficiente. NOTA: Ciò rappresenta una potenza laser di 0.15 al 0.25 mW con il nostro sistema.
- Acquisire immagini da 512 x 512 pixel (vale a dire, 635 micron) in 2.2 secondi con un foro stenopeico aperto con l'obiettivo 20X secco del microscopio invertito. Utilizzare un z-profondità compresa tra 10 e 20 micron, che garantisce un segnale sufficientemente con le potenze laser bassi.
NOTA BENE: Di solito effettuare esperimenti con una z-profondità compresa tra 12 a 1656; m. Nel caso delle cifre presentate e film, la z-profondità è di 20 micron. Contrasto di fase permette l'identificazione di pareti endoteliali e di imaging viene eseguita su vene mesenteriche. Poiché le cellule pattugliano muovono molto lentamente con una velocità di 5-10 micron / min 6, la registrazione di un campo di interesse ogni 20 s è soddisfacente. Con le impostazioni descritte, la fase motorizzato consente di registrare fino a 7 campi di interesse allo stesso tempo. - Posizionare il mouse e vasi mesenterici nella camera del termostato del microscopio sono consentirne il recupero dalla preparazione per 30 minuti prima dell'acquisizione del primo film. Durante questo tempo, scegliere diversi campi di interesse. Focus sulla superficie luminale della nave vicina all'obiettivo. Se necessario, sfruttare la leggera auto-fluorescenza di endotelio per impostare la messa a fuoco.
NOTA: La chirurgia durante la preparazione del mouse sottolinea leggermente l'endotelio. Di conseguenza, a rotazione dei neutrofili e/ o monociti possono essere osservati nei primi 15 minuti dopo la preparazione del mouse. - Registrare un primo film per 30 min a regime, una immagine ogni 20 secondi.
NOTA: Il software acquisisce ogni campo di interesse per 2,2 secondi e lo stadio motorizzato si sposta automaticamente da un campo all'altro. Si ritorna alla prima posizione entro 20 secondi durante i 30 min del film registrazione. - Per avviare infiammazione dei vasi sanguigni, aggiungere una goccia di 20 l di PBS contenente 100 mg di TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 12 direttamente sui vasi imaged.
- Controllare il punto di riferimento per ogni campo di interesse.
NOTA: Nel corso di acquisizione, c'è sempre lievi modifiche di focalizzazione su asse z. Nonostante il 10-20 micron z-profondità, questo può provocare una diminuzione dell'intensità di fluorescenza. Pertanto, riorientare manualmente ogni campo di interesse alla fine di ogni film, se necessario. Film record per 30 min-periodi e fino a 3 ore aTal dopo l'inizio di infiammazione. - Alla fine dell'esperimento, sacrificare topo anestetizzato per dislocazione cervicale.
6. Generazione di file di film e tracciamento dei leucociti
NOTA: Il software di acquisizione Nikon genera .nd2 file, ma la seguente procedura sarà simile con altri software e marchi.
- I file di esportazione come serie tiff.
- Vai a software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importare la serie tiff. Ogni canale come un file diverso.
- Applicare un filtro mediano con un raggio di 2.0 pixel per i canali verde e rosso per ridurre il rumore di fondo (di processo> Filtri> mediani ...).
- Convertire i file in binario (Processo> Binary> Crea Binary). Attivare il software per calcolare la soglia per ogni immagine.
- Unire i canali in un'unica serie di immagini (Immagine> Colore> Unisci canali ...). Selezionare i monociti del green canali, i neutrofili nel canale rosso e la luce trasmessa nel canale grigio.
- Convertire immagini impilate in colori RGB (Immagine> Colore> Stack per RGB).
- Salvare il file come .avi
- I dati vengono importati e compilati nel software Imaris (Bitplane). Movimenti di monociti e neutrofili vengono poi monitorati tramite il tracking guidata Spot.
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Representative Results
Il manoscritto descrive un protocollo ottimizzato in modo da controllarne il comportamento di monociti e neutrofili nelle vene mesenteriche di topi anestetizzati in tempo reale. L'uso di una camera 37 ° C-termostatato è obbligatoria per mantenere la temperatura del mouse e anche a causa della temperatura di circolazione dipendente leucociti. Preparazione del mouse viene visualizzato in Figura 1. La Figura 2 mostra tutta la zona visto al microscopio. Luce trasmessa permette l'identificazione delle vene mesenteriche (freccia rossa) e le arterie (freccia blu).
Trattamento di immagini acquisite con file di filmati ImageJ generato software, come Film 1 e Film 2. La Figura 3 mostra le varie fasi di elaborazione delle immagini per il primo punto volta di Movie 1. Film 1 mostra il pattugliamento delle Ly6C bassi monociti in condizioni stazionarie , come precedentemente dedescritto 6,8,14 mentre tutti i neutrofili sono in circolazione nel sangue. Nessun neutrofili sta perlustrando la parete endoteliale. Movie 2 mostra lo stesso campo di interesse di 90 minuti dopo l'aggiunta del TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 di avviare a livello locale l'infiammazione. In questo caso, neutrofili e monociti reclutati sono massicciamente alla parete endoteliale, quali scansione meticolosamente. È importante notare che l'aggiunta di un agonista TLR induce cambiamenti di larghezza endotelio e modifica, di conseguenza il focus della z. Pertanto, l'attenzione deve essere attentamente controllata dopo l'aggiunta di agonista. Compilazione dei dati nel software Imaris (Bitplane) consente la tracciatura dei singoli leucociti utilizzando Tracking guidata Spot. Figura 4 mostra i percorsi della pista esatte dei monociti (verde) e neutrofili (rosso) che pattugliano lungo l'endotelio. I dati sono ottenuti dall'analisi del film 2, vale a dire, 90 minuti dopo l'inizio della inflammation. Monitoraggio dei percorsi leucociti può essere esportato come file TIFF o file xls per ottenere varie statistiche come lunghezza della pista, lo spostamento, la durata o la velocità.
Questa tecnica offre un modo piacevole per monitorare il comportamento di monociti e neutrofili, allo stesso tempo, prima e dopo l'infiammazione. E 'possibile monitorare il reclutamento di queste cellule sul lavoro straordinario parete endoteliale. Perdita di concentrarsi su z o x / y spostamento può verificarsi come conseguenza di movimenti intestinali che rovinano l'esperimento. Film 3 illustra tale preparazione fallito e acquisizione.
Figura 1. Preparazione del mouse.
Frecce nere indicano tessuto PBS-umidificato utilizzato per immobilizzare l'intestino. Freccia bianca indica che il piatto di coltura 10 centimetri di tessuto. T indica la fase del vassoio misura in alluminio che si inserisce nel microscopio. Mesenterica i vasi sanguigni sono ben esposte al centro sul vetrino. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Le succursali di vene e arterie mesenteriche.
Immagini (20 x 10), scattate con una obiettivo 10X sono state cucite per costituire un'unica grande immagine della superficie disponibile. Diversi campi di interesse sono poi scelti per controllare il movimento dei leucociti con un obiettivo 20X. La freccia rossa indica una vena mesenterica. La freccia blu indica una arteria mesenterica. La freccia verde indica che il tessuto adiposo che circonda i vasi. L'area scura sui lati dei risultati di immagini dalla presenza di tessuto bagnato usato per immobilizzare l'intestino. Barra bianca scala rappresenta 1 mm.k "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Elaborazione delle immagini con ImageJ.
Le varie fasi di elaborazione delle immagini sono illustrate per la prima immagine del film 1. verdi (monociti) e (neutrofili) canali rosso vengono elaborati separatamente. Per i dati grezzi originali (A), un filtro mediano viene applicato (B) e poi convertita in un'immagine binaria (C). (D) I canali sono fuse in un'immagine finale. Linee verdi o rossi osservati nei dati grezzi sono cellule che si muovono così velocemente che il microscopio non è in grado di acquisire loro totalmente. Barra bianca scala rappresenta 40 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. individualetracce leucociti.
Tracce di monociti (A) e neutrofili (B) che pattugliano l'endotelio sono trattati con Imaris Software (Bitplane). Barra bianca scala rappresenta 40 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie 1. I leucociti scansione parete endoteliale allo stato stazionario. Allo stato stazionario, Ly6C bassi monociti pattugliano l'endotelio. I neutrofili sono in circolazione in base al flusso di sangue. I neutrofili sono in rosso e monociti sono in verde. Barra della scala rappresenta 50 micron. Generato con l'obiettivo 20X. Cliccate qui per vedere il video.
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2:. Leucociti scansione parete endoteliale dopo infiammazione TLR2-mediata stesso campo di interesse in film 1. film inizia 90 minuti dopo l'aggiunta di 20 ml di PBS contenente 100 mg di Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 agonista) direttamente sulla nave. Monociti e neutrofili reclutati sono meticolosamente la scansione della parete endoteliale. I neutrofili sono in rosso e monociti sono in verde. Barra della scala rappresenta 50 micron. Clicca qui per vedere questo video.
Movie 3: I risultati ottenuti dalla preparazione scorretto del mouse movimenti delle navi ottenuti quando l'anestesia o l'immobilizzazione dell'intestino sono corretti.. Barra della scala rappresenta 50 micron.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere questo video.
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Discussion
Le metodologie descritte in questo manoscritto forniscono un approccio coerente per studiare in modo efficiente monociti e il comportamento dei neutrofili nelle vene mesenteriche in condizioni di stato e infiammatorie costante.
La fase cruciale della preparazione è l'immobilizzazione dell'intestino con tessuti PBS-bagnate. Se eseguita correttamente, vasi mesenterici sono ben esposti sul vetrino per l'acquisizione delle immagini. Ciò consente la selezione di vari campi di interesse per monitorare il comportamento dei leucociti nelle vene mesenteriche.
Il nostro protocollo prevede l'esteriorizzazione vasi mesenterici prima dell'inizio degli esperimenti, consentendo (1) per indurre direttamente infiammazione sui vasi monitorati, e (2) per registrare i punti temporali iniziali dopo stimolazione e (3) per seguire le cinetiche di reclutamento dei leucociti e il loro comportamento nella stessa nave prima e dopo l'induzione di infiammazione.
Noi Trasfer neutrofili purificati da murino midollo osseo dello stesso background genetico e non da sangue, come più cellule possono essere ottenute per ogni animale (6-12x10 6 vs 6 0.5-2x10 / mouse). Se l'uso di neutrofili nel sangue è preferito, lo stesso protocollo può essere effettuata per la purificazione delle cellule.
In Imaging intravitale, la visualizzazione della vascolarizzazione è abilitato per la luce trasmessa nel caso di vasi mesenterici. In alternativa, gli anticorpi fluorescenti contro PECAM1 (clone 390) o fluorescente ad alta destrano peso molecolare (70kDa o 2 MDA) 6,14 può essere iniettato iv per rilevare il sistema vascolare. Ad esempio, l'iniezione intra-scrotale di 3 mg anti-PECAM1 (clone 390) è stato segnalato per attivare il rilevamento vascolare con basso background e non influenzare l'attività dei leucociti nel modello cremaster 9. Rispetto a luce trasmessa, l'uso di anticorpi fluorescenti o coloranti introduce in particolare la possibilità di ricostruzione 3D della vascunitario, ma un canale è sacrificato per la sua etichettatura e il tempo di acquisizione viene aumentato. Luce trasmessa è sufficiente nel modello mesenter grazie alla trasparenza del sistema vascolare, come descritto qui. Al contrario, marcatura fluorescente della vascolarizzazione è obbligatoria nel derma dell'orecchio o organi opache.
Rilevamento delle popolazioni di leucociti può essere realizzato utilizzando animali transgenici che presentano una fluorescenza endogena in tipi cellulari specifici (monociti Cx 3 CR1 eGFP / peso 6 o CFP 15 o CD68 GFP 16 cd115; monociti e neutrofili Lys eGFP 9; e piastrine CD41 YFP 17) . Sebbene CX3CR1 si esprime in tutti i monociti e alcuni sottoinsiemi di cellule NK e T, il Cx 3 CR1 eGFP / mouse peso è interessante distinguere tra infiammatoria Ly6C <sup> alti monociti che presentano meno fluorescenza GFP di Ly6C residente basse monociti 6. Come CD115 è specifico della linea monocitaria, il MacBlue del mouse cd115 PCP è un modello interessante. Tuttavia non è possibile distinguere Ly6C alta e bassa Ly6C monociti.
Un'alternativa a topi transgenici fluorescenti è l'iniezione iv di anticorpi fluorescenti etichettare le popolazioni di leucociti in tempo reale. Ad esempio, i monociti possono essere etichettati con l'anti-CD115 (clone AFS98), neutrofili con anti-Ly6G (clone 1A8) e delle piastrine con anti-CD49b (clone HMα2). In generale, tutti questi anticorpi sono esaurendo a dosi elevate. Pertanto, essi dovrebbero essere usati con cautela per breve periodo di tempo e a bassi livelli. Va notato che anche a basse dosi, un impatto sulla funzione cellulare non può essere esclusa. Esperienza personale con basse quantità (1-2 mcg) consente l'etichettatura dei CD115 + monocytes e neutrofili Ly6G + senza esaurimento (dati non pubblicati).
Sebbene il modello del derma orecchio vascolarizzazione non è invasivo come l'orecchio è intatta, la profondità del derma orecchio è una preoccupazione, che lo rende un modello più adatto per la microscopia 2-photon 13. Inoltre, non è possibile stimolare direttamente il vaso nel modello orecchio senza disturbare fisicamente la preparazione.
Il nostro protocollo può essere applicato a qualsiasi microscopio confocale invertito. Poiché la velocità di scansione e la potenza del laser sono macchina-dipendente, acquisizione di un frame (512 x 512 pixel, cioè 635 micron) in un unico piano z richiede circa 2,2 sec con le nostre impostazioni per lo scanner galvano della Nikon A1R. Purtroppo, questa bassa velocità limita la possibilità di registrare film a quattro dimensioni delle vene mesenteriche senza una perdita di qualità. Lo scanner di risonanza del A1R offre una elevata velocità di acquisizione, sebbene laqualità delle immagini è fortemente ridotto (sfondo rispetto segnale specifico) per i nostri esperimenti con il CX 3 CR1 GFP del mouse / peso. Va tenuto presente che i laser sono fissati a inferiore allo 0,5% (<0,25 mW) per evitare fototossicità e candeggio.
Woodfin et al riuscì ad acquistare film in 4D (immagini 60 z-stack in 40 sec) di venule Cremaster usando una Leica TCS-SP5 9. Poiché gli autori valori dell'immagine di 20-40 micron di diametro, sono probabilmente meno sensibile alle variazioni di fuoco che nel nostro modello (monitoraggio delle vene mesenteriche di 200-400 micron). Quando l'imaging tessuto vivo, il controllo della messa a fuoco è la preoccupazione più importante, che limita la possibilità di registrare un filmato unico della durata di diverse ore. Riteniamo che la registrazione di filmati della durata di 30 minuti (o 45 minuti) è il più pratico nel modello mesenterica.
L'aggiunta di agonisti TLR altera la larghezza nave e quindi la messa a fuoco. Di conseguenza,è molto difficile immagine correttamente il primo 10-15 min dopo stimolazione fino stabilizzano i vasi.
Un'altra limitazione è la durata dell'esperimento. A causa della difficoltà di mantenere il mouse anestetizzato correttamente per un lungo periodo di tempo, è difficile immagine più di 4 ore dopo l'infiammazione. L'uso di altri anestetici, come continua inalazione isoflurano, potrebbe essere un'opzione (anche se non testato da noi).
In topi vecchi (oltre 16 settimane di età), maggiore quantità di depositi di grasso intorno i vasi diminuire la qualità di visualizzazione dei vasi mesenterici. Pertanto, è meglio eseguire esperimenti con 8-12 settimane di età topi.
Questa tecnica può essere combinata con l'iniezione iv di anticorpi per bloccare molecole di interesse o esaurire dato popolazioni leucocitarie, in modo che l'importanza di molecole implicate nel reclutamento o il comportamento dei leucociti può essere determinato. Inoltre,altri sottoinsiemi di leucociti possono essere monitorati utilizzando altri ceppi di topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti in popolazioni di cellule di interesse.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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