Abstract
תגובה חיסונית יעילה תלויה בגיוס מהיר של כדוריות דם לבנות בדם לאתר של זיהום או פציעה. חוקר הגירת יקוציט in vivo הוא חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של הגירת Transendothelial יקוציט ואינטראקציה עם האנדותל של כלי דם. גישה רבת עוצמה אחד כרוכה מיקרוסקופיה intravital בעכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין.
כאן אנו מציגים פרוטוקול למונוציטים הדמיה ונויטרופילים בCX 3 iv עכבר CR1 GFP / WT הוזרק נויטרופילים שכותרתו צבע כתומים עם מיקרוסקופ confocal הפוך. זמן לשגות סרטים שנאספו מ -30 דקות לכמה שעות של הדמיה מאפשרים הניתוח של התנהגות יקוציט בעורקי mesenteric תחת שני תנאי המדינה ודלקתיים יציבים. אנו גם מתארים את הצעדים כדי לגרום לדלקת בכלי דם באופן מקומי עם TLR2 / TLR1 אגוניסט Pam3SK4 ולפקח על subsequeגיוס NT של נויטרופילים ומונוציטים.
גם הטכניקה שהוצגה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר אוכלוסיות אחרות של לויקוציטים ולחקור מולקולות מעורבות בגיוס לויקוציטים או סחר באמצעות גירויים אחרים או עכברים מהונדסים.
Introduction
נויטרופילים ומונוציטים הם תאים של מערכת החיסון המולדת, כי כל זמן במחזור הדם. על פציעה או זיהום, אותות דלקתיים לגרום diapedesis לויקוציטים לרקמות שנפגעו ונגועים, במסמך ייזום תגובה חיסונית תאית 1-3. המהירות של גיוס לויקוציטים קובעת את התוצאה החיובית של התגובה החיסונית. תהליכים מורכבים אלה מסתמכים על מולקולות ספציפיות (למשל, selectins, כמוקינים מאוגדים האנדותל) הנוכחיות על האנדותל המודלק המסייעות להקמת קשר דבק בין כדוריות דם לבנות במחזור והאנדותל 1-3 בדי לקבל תובנות על המולקולות מעורבות ביקוציט מפל גיוס, חשוב לדמיין את קינטיקה של גיוס תא ולעקוב אחר ההתנהגות של כל תא / אוכלוסייה. שיטה יעילה כרוכה מיקרוסקופיה intravital בעכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין.
תוכן "> נכון להיום, כמה גישות באמצעות מיקרוסקופ intravital פותחו לתמונה בכלי הדם 4,5. לדוגמא, הדמיה של כלי דם הדרמיס אוזן או ורידי mesenteric על ידי מיקרוסקופ confocal intravital שימשה לזהות סיור ההתנהגות של מונוציטים נמוכים Ly6C עכברי ואנושי CD14 לעמעם CD16 + מונוציטים בצד luminal של כלי דם בתנאי מצב יציבים 6-8. מודל כלי דם Cremaster העכבר משמש לעתים קרובות כדי לפקח על התנהגותם של נויטרופילים או מונוציטים גבוהים Ly6C הדלקתי בתנאים דלקתיים או איסכמי בעכברים מהונדסים. שב מקרה, Cremaster מגורה באמצעות הזרקת intrascrotal של IL1β, CCL2, TNFβ או fMLP. לאחר 2-4 שעות, רקמות ואז בניתוח exteriorized ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal intravital 9-11.הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לניטור מונוציטים ונויטרופילים באותו הזמן עם כלהקרינה הפוכה מיקרוסקופ confocal. יתר על כן, השיטה שלנו מפרטת כיצד תמונה אותו כלי השיט לפני (מצב מצב יציב) ולאחר דלקת ואיך לבצע את קינטיקה של גיוס לויקוציטים. לצורך כך, אנו משתמשים 3 CR1 עכבר GFP / WT CX, מונוציטים שלהביע eGFP, הזריק IV עם נויטרופילים עכברי שכותרתו צבע כתום. באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך, זה אפשרי (1) למעקב וניתוח מונוציטים הנמוכים Ly6C הסיור בתנאי מצב יציבים ו( 2) למעקב הגיוס של שני מונוציטים ונויטרופילים באותו הכלי לאחר דלקת מקומית. כאן אנו יוצרים את המצבים דלקתיים על ידי השימוש באגוניסט TLR2 / TLR1 12 Pam3CSK4. יתר על כן, הדמיה כזו עשויה לעזור לקבוע את התפקיד של מולקולות ספציפיות של עניין בשלבים השונים של מפל גיוס לויקוציטים אם בוצע על עכברי נוק-אאוט ספציפיים או בנוכחות של נוגדני חסימת 6,9,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: נהלי בעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה המוסדית האתית של טיפול בבעלי חיים בז'נבה, שווייץ ולשכת הווטרינרית המחוזית. מספר אישור GE / 63/14.
1. הכנת תרחיף תא בודד ממח העצם
- עכבר קורבן (8-12 בן שבוע) נקע בצוואר רחם. לעקר רגליים אחוריות עם 70% אתנול. להסיר עור מרגליים אחוריות.
- לנתח את עצמות ירך עכבר וtibias ולהסיר רקמה מרגליים עם אזמל. יש לשטוף את הרגליים עם 90% אתנול ומקום לתוך צלחת תרבות מלאה PBS.
- מתחת למכסה מנוע התרבות, רקמות נקיות מעצמות ירך וtibias עם אזמל ונפרד במפרק הברך. חותך את כל קצה של העצמות.
- מח עצם סומק מעצם באמצעות מחט 23G ומזרק 1 מיליליטר מלא בינוני הכנה (DMEM / F12 האדום ללא פנול, 1% בסרום עכברוש), לבורג 50 מיליליטר צינור. לשבש אגרגטים תא על ידי בעדינות passaging דרך ne 23Gedle ומזרק 1 מיליליטר. להביא נפח הכולל עד 25 מיליליטר עם מדיום הכנה.
- צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C. supernatant מחק. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של תאי דם אדומים חיץ תמוגה RBLC (8.3 גר 'NH 4 Cl, גרם NaHCO 1 3, 1 מיליליטר EDTA (100 מ"מ), שלם לL 1 עם מים מזוקקים, לסנן 0.22 מיקרומטר) בצינור 15 מיליליטר בורג. דגירה 30 שניות על קרח.
- הוסף 10 מיליליטר של מדיום ההכנה וXG 250 צנטריפוגות, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant וגלול ב 2 מיליליטר בינוני הכנה.
2. נויטרופילים העשרה על ידי סלקציה שלילית
- להוסיף 150 μl של קוקטייל העשרת נויטרופילים עכבר (ערכת פלטפורמת בידוד תא כגון EasySep). לערבב דגירה על קרח למשך 10 דקות.
- להוסיף 10 מיליליטר של פנול אדום DMEM החופשי. הפוך פעם צנטריפוגות 250 XG, 3 דקות, 4 מעלות צלזיוס.
- supernatant מחק. גלולה גלולה ב1.75 בינוני מיליליטר הכנה ב 5 מיליליטר קלקר עגול צינורות תחתון. הוסף 250 μl ביובקוקטייל בחירה. לערבב דגירה על קרח למשך 10 דקות.
- מערבולת חלקיקים המגנטיים (מערכת פלטפורמת בידוד תא) למשך 30 שניות כדי resuspend חלקיקים. הוסף 500 חלקיקים מגנטיים μl להשעיה תא. לערבב דגירה על קרח למשך 10 דקות.
- מניחים את הצינור לתוך המגנט. חכה 3 דקות.
- הפוך את המגנט על 5 מיליליטר קלקר חדש עגול צינורות תחתון כדי לאסוף את התאים ללא תווית הרצויה. אל תיקח את הטיפה האחרונה התלויה בצינור. תאים לא רצויים יישארו בצינור בתוך המגנט. בטל צינור זה לפסולת ביולוגית מסוכנת.
- מניחים את הצינור החדש לתוך המגנט. חכה 3 דקות.
- הפוך את המגנט על 15 מיליליטר חדש לדפוק צינור כדי לאסוף את התאים ללא תווית הרצויה. אל תיקח את הטיפה האחרונה התלויה בצינור.
- נפח מלא עד 5 מיליליטר עם DMEM החופשי פנול האדום.
3. תיוג של נויטרופילים
- הוסף 0.5 μl של צבע כתום כגון תא Tracker אורנג ריכוז עבודה (1 מיקרומטר, CMRA - chloromethyl-rodol-אצטט, מניית 10 מ"מ בDMSO). דגירה 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיום הכנה. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C.
- supernatant מחק. גלולה גלולה במדיום 1 מיליליטר הכנה בצינור 1.5 מיליליטר.
- קח aliquot לספור עם hematocytometer.
- דגירה 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C.
- supernatant מחק. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר PBS. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C כדי לשטוף.
- supernatant מחק. גלולה גלולה כ10x10 6 תאים לכל 100 μl PBS. שמור על קרח עד הזרקת IV. הערה: תאים צריכים להיות מוזרק iv מהר ככל האפשר. 6-12x10 6 נויטרופילים / עכבר בדרך כלל מתקבל.
4. עכבר הכנה למיקרוסקופי Intravital
הערה:.. שלב 4.1) ו -4.2) צריכה להתבצע בתחילת הניסוי, כדי למנוע זמן ההמתנה ממושך של נויטרופילים שכותרת על ICדואר.
- לשקול את עכבר CX 3 CR1 GFP (8-12 בן שבוע).
- הכן 800 μl של הרדמה (60 מ"ג / קילוגרם קטמין, 4.5 מ"ג / קילוגרם xylazine, acepromazone 1.75 מ"ג / קילוגרם בPBS).
- הרדימי עכבר. IP הזרקה עם 200 μl / 20 גרם של עכבר. הרדמה שליטה על ידי בוהן צביטה ועל ידי בדיקת קצב הנשימה.
- הזרק נויטרופילים (10x10 6 תאים ב100 μl PBS) לוריד באמצעות ורידי זנב לרוחב או בסינוסים רטרו מסלולית, בנוחות של הנסיין.
- שים את העכבר על כרית חימום ולהגן על העיניים עם ג'ל העיני.
- Coverslip זכוכית (35 מ"מ קוטר) הוא לשים בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים, שבו יש חור בקוטר 30 מ"מ. שמן שימוש הוא לשמור על צלחת תרבית רקמה במגע עם coverslip.
- לחתוך עור בטן במספריים כדי לחשוף את הצפק. לחתוך הצפק עם מספריים לחשוף מעי.
- להוסיף 200 μl PBS (מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס) לעמחלל eritoneal. קח את העכבר ביד שלך ולהפוך אותו עם פנים כלפי מטה, כך שהמעי יוצא מחלל הצפק עם לחץ עדין. מניחים את העכבר בצלחת תרבית רקמה.
- בעדינות deroll המעי עם ניצני כותנה מעוקרים על coverslip כדי לחשוף את כלי mesenteric.
- לחתוך רקמות נייר בלהקות ולהרטיב אותם עם 37 מעלות צלזיוס PBS מחומם. לשתק את המעי עם החתיכות של רקמות נייר כדי להקטין את התנועות הנובעות מתנועה פריסטלטית.
- שים את צלחת תרבית רקמה והעכבר בתוך חדר thermostated 37 ° C על הבמה המגש המותאמת אישית של מיקרוסקופ ההפוכה. להציג את מזרק המכיל sc הרדמה לרגלו האחורית. הערה: בנוסף, העכבר יכול לקבל חמצן (0.5 ליטר / דקה) עם מסכה.
- עכבר בקרה להרדמה על ידי בוהן צביטה ובדיקת קצב הנשימה בכל 30 דקות. במידת הצורך, לספק דחיפה של הרדמה (20 μl) כדי לשמור על הרדמה כראוי. לֹאE: יש להימנע ייבוש של כלי הדם. לכן, לחותו נשמר על ידי ההרטבה באופן קבוע רקמות נייר משמשות כדי לשתק את המעי עם 37 מעלות PBS חימם-C.
5. התנהגות מדידת נויטרופילים ומונוציטים בכלי שייט מוסת in vivo באמצעות מיקרוסקופית Intravital
- לייזרי סט ל488- ו561- בהספק הנמוך ביותר הנחוץ כדי למנוע phototoxicity מושרה לייזר. בניסויים שלנו, הוא נמוך מ -0.5%. עוצמה של ה- GFP במונוציטים וצבע כתום בנויטרופילים היא כל כך בהירה, כי בדרך כלל 0.3% הוא מספיק. הערה: זה מייצג כוח לייזר של 0.15-0.25 mW עם המערכת שלנו.
- לרכוש תמונות של 512 x 512 פיקסלים (כלומר, 635 מיקרומטר) ב 2.2 שניות עם חריר פתוח באמצעות אובייקטיבי היבשה 20X של מיקרוסקופ ההפוכה. השתמש בZ- עומק בין 10 עד 20 מיקרומטר, שמבטיח אות מספיק עם סמכויות לייזר נמוכות.
הערה: אנחנו בדרך כלל לבצע ניסויים עם Z- עומק בין 12 עד 1656; מ '. במקרה של דמויות וסרטים שהוצגו, Z- העומק הוא 20 מיקרומטר. בניגוד שלב מאפשר זיהוי של קירות אנדותל והדמיה מתבצעת על ורידי mesenteric. מאחר ותאים שסיירו לעבור די לאט עם מהירות של 5-10 מיקרומטר / min 6, הקלטת תחום העניין בכל 20 שניות היא משביעת רצון. עם ההגדרות שתוארו, השלב הממונע מאפשר ההקלטה של עד 7 תחומי העניין באותו הזמן. - מניחים את העכבר וכלי mesenteric בתא התרמוסטט של המיקרוסקופ הם לאפשר להם להתאושש מההכנה למשך 30 דקות לפני הרכישה של הסרט הראשון. במהלך תקופה זו, לבחור כמה תחומי העניין. פוקוס על פני השטח luminal של כלי השיט הקרוב ביותר למטרה. במידת הצורך, לנצל את אוטומטי הקרינה הקלה של האנדותל כדי להגדיר את המיקוד.
הערה: ניתוח במהלך הכנת עכבר מעט מדגיש את האנדותל. כתוצאה מכך, מתגלגל של נויטרופילים וניתן לצפות / או מונוציטים בהכנת 15 דקות הראשונה שלאחר העכבר. - להקליט סרט ראשון למשך 30 דקות בתנאי מצב יציבים, תמונה אחת בכל 20 שניות.
הערה: התוכנה רוכשת כל תחום העניין ב2.2 שניות והבמה הממונעת עוברת באופן אוטומטי מתחום אחד למשנהו. זה חוזר למצב הראשון בתוך 20 שניות במהלך 30 דקות של סרט ההקלטה. - ליזום דלקת בכלי דם, להוסיף טיפה של 20 μl של PBS המכילה TLR2 של 100 מיקרוגרם / TLR1 אגוניסט Pam3CSK4 12 ישירות על כלי הדמיה.
- לשלוט במיקוד לכל תחום העניין.
הערה: במהלך הרכישה, תמיד יש שינויים קלים של התמקדות בציר z. למרות Z- עומק 10-20 מיקרומטר, זה יכול לגרום לירידה של עוצמת הקרינה. לכן, למקד ידני בכל תחום העניין בסופו של כל סרט, במידת צורך. הקלטת סרטים למשך 30 דקות תקופות ועד 3 שעות לטל לאחר תחילת הדלקת. - בסוף הניסוי, להקריב את העכבר הרדים נקע בצוואר רחם.
6. דור של קבצי סרטים ומעקב של לויקוציטים
הערה: רכישת תוכנת ניקון מייצרת .nd2 קבצים אבל ההליך הבא יהיה דומה עם תוכנה ומותגים אחרים.
- קבצי יצוא סדרת TIFF כ.
- עבור לתוכנת ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). לייבא את סדרת TIFF. כל ערוץ כקובץ שונה.
- החל מסנן חציון ברדיוס של 2.0 פיקסל לערוצים הירוקים ואדום כדי להפחית את רעש רקע (תהליך> מסננים> חציון ...).
- להמיר קבצים לינארי (תהליך> ינארי> הפוך ינארי). הפעל את התוכנה על מנת לחשב את הסף לכל תמונה.
- מיזוג ערוצי סדרת תמונה אחת (תמונה> צבע> מיזוג ערוצים ...) ל. בחר מונוציטים בGreeערוץ n, נויטרופילים במסלול האדום והאור מועבר בערוץ האפור.
- המרת תמונות נערמו לצבעי RGB (תמונה> צבע> מחסנית ל- RGB).
- שמור את הקובץ כ.אבי
- נתונים מיובאים והידור בתוכנת Imaris (Bitplane). תנועות של מונוציטים ונויטרופילים לאחר מכן מעקב באמצעות ספוט מעקב האשף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כתב היד מתארת פרוטוקול מותאם כדי לפקח על התנהגותם של מונוציטים ונויטרופילים בורידי mesenteric של עכברים מורדמים בזמן אמת בקלות. השימוש בתא thermostated-37 ° C הוא חובה כדי לשמור על הטמפרטורה של העכבר וגם בשל התנועה תלויה בטמפרטורה של לויקוציטים. הכנה של העכבר מוצגת באיור 1. איור 2 מציג את כל האזור ראה מתחת למיקרוסקופ. אור מועבר מאפשר זיהוי של ורידי mesenteric (חץ אדום) ועורקים (חץ כחול).
טיפול בתמונות שנרכשו עם קבצי סרטי ImageJ תוכנה שנוצרה, כגון סרט 1 וסרט 2. איור 3 מציג את השלבים השונים של עיבוד תמונה לנקודת הזמן הראשונה של סרט 1. סרט 1 מציג את הפטרול של מונוציטים נמוכים Ly6C בתנאי מצב יציבים , כדה בעברscribed 6,8,14 ואילו כל נויטרופילים מסתובבים בזרם הדם. אין נויטרופילים הוא סיירו בקיר אנדותל. סרט 2 מראה את אותו השדה של עניין 90 דקות לאחר התוספת של TLR2 / TLR1 אגוניסט Pam3CSK4 למקומי ליזום דלקת. במקרה זה, נויטרופילים ומונוציטים הם מסיבי גויסו לקיר אנדותל, שהם סורקים בקפדנות. חשוב לציין בנוסף כי של אגוניסט TLR גורם לשינויים ברוחב האנדותל וכתוצאה מכך משנה את המיקוד של ציר z. לכן, דגש צריך להיות מבוקר בקפידה לאחר התוספת של אגוניסט. אוסף של נתונים בתוכנת Imaris (Bitplane) מאפשר המעקב של לויקוציטים הבודד באמצעות ספוט מעקב האשף. איור 4 מציג את נתיבי מסלול המדויקים של מונוציטים (ירוק) ונויטרופילים (אדום) שסיירו לאורך האנדותל. הנתונים מתקבלים מהניתוח של סרט 2, כלומר, 90 דקות לאחר תחילתו של INFlammation. מעקב של נתיבי יקוציט ניתן לייצא כקבצי TIFF או קבצי xls כדי לקבל נתונים סטטיסטיים שונים כגון אורך מסלול, עקירה, משך או מהירות.
טכניקה זו מציעה דרך נחמדה כדי לפקח על התנהגותם של מונוציטים ונויטרופילים באותו הזמן, לפני ואחרי הדלקת. אפשר לעקוב אחר הגיוס של תאים אלה על קיר שעות נוספות אנדותל. הפסד של התמקדות בציר z או אפילו x / y העקירה יכול להתרחש כתוצאה מתנועות מעיים שיהרסו את הניסוי. סרט 3 ממחיש הכנה נכשלה כזה ורכישה.
איור 1. הכנת עכבר.
חיצים שחורים מצביעים על רקמות הרטובות-PBS משמשות כדי לשתק את המעי. ראש חץ לבן מציין את המנה תרבות 10 ס"מ רקמה. T מציין את שלב מגש מחוייט אלומיניום שמתאים למיקרוסקופ. Mesenteric כלי דם יפה נחשפים במרכז על coverslip. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. סניפים של הוורידים ועורקים mesenteric.
תמונות (20 x 10) צולמו עם מטרת 10X היו תפורות למהוות תמונה אחת גדולה של האזור זמין. כמה תחומי העניין לאחר מכן נבחרו לניטור תנועת יקוציט עם מטרת 20X. החץ האדום מצביע על וריד mesenteric. החץ הכחול מציין עורק mesenteric. החץ הירוק מציין את רקמת השומן המקיפה את כלי הדם. האזור הכהה בצידי תוצאות התמונה מהנוכחות של רקמה רטובה משמש כדי לשתק את המעי. סרגל קנה מידה לבן מייצג 1 מ"מ.k "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור עיבוד תמונה 3. עם ImageJ.
הצעדים השונים של עיבוד תמונה מצוירים לתמונה הראשונה של סרט 1. גרין (מונוציטים) וערוצים אדומים (נויטרופילים) מעובדות בנפרד. לנתונים המקוריים גלם (), מסנן חציון מוחל (ב ') ולאחר מכן הוסב לתמונה בינארי (C). ערוצים (D) ימוזגו לתוך תמונה סופית. קווים ירוקים או אדומים שנצפו בנתונים גולמיים הם תאים שעוברים כל כך מהר שמיקרוסקופ הוא לא תוכל לרכוש אותם בשלמות. סרגל קנה מידה לבן מייצג 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פרט 4. איור מסלולי יקוציט.
מסלולים של מונוציטים () ונויטרופילים (ב) מסיירים האנדותל מעובדים עם Imaris תוכנה (Bitplane). סרגל קנה מידה לבן מייצג 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1. Leukocytes סריקת קיר אנדותל במצב היציב. במצב היציב, מונוציטים הנמוכים Ly6C לפטרל האנדותל. נויטרופילים מסתובבים בהתאם לזרימת הדם. נויטרופילים הם באדום ומונוציטים הם בירוק. בר סולם מייצג 50 מיקרומטר. נוצר במטרה 20X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
GE = "תמיד"> 
2:. Leukocytes סריקת קיר אנדותל לאחר דלקת בתיווך TLR2 אותו תחום העניין כמו בסרט 1. סרט מתחילה 90 דקות לאחר התוספת של 20 μl של PBS המכילה של Pam3CSK4 (אגוניסט TLR2 / TLR1) 100 מיקרוגרם ישירות על גבי כלי השיט. מונוציטים ונויטרופילים גויסו בקפידה סריקת קיר אנדותל. נויטרופילים הם באדום ומונוציטים הם בירוק. בר סולם מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
סרט 3: תוצאות המתקבלות מהכנת עכבר שגויה תנועות של כלי מתקבלים כאשר הרדמה או חוסר תנועה של מעי אינה נכונות.. בר סולם מייצג 50 מיקרומטר.f = יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" = "_ blank"> אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתודולוגיות מתוארות בכתב היד הזה מספקים גישה עקבית ללמוד ביעילות מונוציטים ונויטרופילים התנהגות בעורקי mesenteric בתנאי מדינה ודלקתית יציבים.
הצעד המכריע של ההכנה הוא חוסר תנועה של המעי עם רקמות הרטובות-PBS. אם מבוצע כראוי, כלי mesenteric הם יפה נחשפו על coverslip לרכישת תמונה. זה מאפשר את הבחירה של כמה תחומי העניין לפקח יקוציט התנהגות בעורקי mesenteric.
הפרוטוקול שלנו כרוך בהחצנה של כלי mesenteric לפני תחילת הניסויים, מה שמאפשר (1) לגרום לדלקת ישירות על כלי פיקוח, ו- (2) כדי להקליט את נקודות הזמן המוקדמות לאחר גירוי ו( 3) למעקב קינטיקה של גיוס של לויקוציטים וההתנהגות שלהם באותו הכלי לפני ואחרי הגיוס של דלקת.
אנו transfאה נויטרופילים מטוהרים ממח עצם בעכברים מאותו הרקע הגנטי ולא מהדם כפי שניתן להשיג יותר תאים לכל בעלי חיים (6-12x10 6 לעומת 0.5-2x10 6 / עכבר). אם שימוש של נויטרופילים דם הוא מועדף, באותו הפרוטוקול יכול להתבצע לטיהור תא.
בהדמיה intravital, ההדמיה של כלי הדם מופעלת על ידי האור מועבר במקרה של כלי mesenteric. לחלופין, נוגדנים נגד ניאון PECAM1 (שיבוט 390) או dextran הניאון הגבוה המולקולרי משקל (70kDa או 2 מד"א) 6,14 יכולים להיות iv המוזרק כדי לזהות את כלי הדם. לדוגמא, הזרקה תוך צק אשכים של 3 מיקרוגרם אנטי-PECAM1 (שיבוט 390) דווחה לאפשר זיהוי כלי דם עם רקע נמוך ולא להשפיע על פעילות יקוציט במודל Cremaster 9. בהשוואה לאור מועבר, השימוש בנוגדנים או צבעי ניאון בעיקר מציג את האפשרות של שחזור 3D של vasculature, אבל ערוץ הקריב לתיוג שלה וזמן הרכישה מוגבר. אור מועבר די בבזכות מודל mesenter לשקיפות של כלי הדם, כפי שתואר כאן. להיפך, תיוג ניאון של כלי הדם הוא חובה בדרמיס האוזן או איברים אטומים.
זיהוי של אוכלוסיות של לויקוציטים יכול להיות מושגים באמצעות בעלי חיים מהונדסים שמפגינים הקרינה אנדוגני בסוגי תאים ספציפיים (מונוציטים Cx 3 cr1 eGFP / WT 6 או cd115 CFP 15 או GFP cd68 16; מונוציטים ונויטרופילים יס eGFP 9; cd41 וטסיות הדם YFP 17) . למרות CX3CR1 בא לידי ביטוי בכל מונוציטים וכמה תת קבוצות של תאי NK וT, Cx 3 cr1 eGFP / עכבר WT מעניין להבחין בין Ly6C הדלקתי <sup> מונוציטים גבוהים שמפגינים פחות הקרינה GFP מ מונוציטים נמוכים Ly6C תושב 6. כCD115 הוא ספציפי של קו monocytic, MacBlue עכבר cd115 CFP הוא מודל מעניין. עם זאת, לא ניתן להבחין מונוציטים נמוכים Ly6C הגבוה וLy6C.
אלטרנטיבה לעכברים מהונדסים ניאון היא הזרקת IV של נוגדני ניאון לתייג האוכלוסיות של לויקוציטים בזמן אמת. לדוגמא, יכולים להיות שכותרתו מונוציטים עם אנטי-CD115 (AFS98 שיבוט), נויטרופילים עם אנטי-Ly6G (שיבוט 1A8) וטסיות דם עם אנטי-CD49b (שיבוט HMα2). באופן כללי, כל נוגדנים אלה מרוקנים במינון גבוה. לכן, הם צריכים להשתמש בזהירות לתקופה קצרה של פעמים וברמות נמוכות. יש לציין כי גם במינון נמוך, השפעה על תפקוד תא לא ניתן לשלול. ניסיון אישי עם כמויות נמוכות (1-2 מיקרוגרם) מאפשר התיוג של CD115 + monocytes ונויטרופילים Ly6G + ללא דלדול (נתונים לא פורסמו).
למרות שהמודל של כלי דם הדרמיס האוזן אינו פולשני כמו האוזן היא לא נגע, העומק של הדרמיס האוזן הוא דאגה, מה שהופך את מודל מתאים יותר למיקרוסקופיה 2-פוטון 13. יתר על כן, לא ניתן לגרות ישירות את הכלי במודל האוזן מבלי להפריע פיזי ההכנה.
הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם בכל מיקרוסקופ confocal הפוך. מאז מהירות סריקה וכוח הלייזר הם מכונת תלויה, רכישה של מסגרת אחת (512 x 512 פיקסלים, כלומר, 635 מיקרומטר) בZ-מטוס יחיד דורשת כ 2.2 שניות עם ההגדרות שלנו לסורק Galvano של A1R ניקון. למרבה הצער, במהירות נמוכה זה מגבילה את האפשרות של הקלטת סרטי ארבעה-ממדיים של עורקי mesenteric ללא אובדן של איכות. סורק התהודה של A1R מציע מהירות גבוהה רכישה, למרות שאיכות של תמונות בחום מופחת (רקע לעומת אות מסוימת) לניסויים שלנו עם העכבר / WT CR1 GFP CX 3. יש לזכור כי לייזרים נקבעים בנמוך מ -0.5% (<0.25 mW), כדי למנוע phototoxicity והלבנה.
Woodfin et al הצליח לרכוש סרטים ב4D (תמונות 60 Z- מחסנית ב 40 שניות) של venules Cremaster באמצעות היקה TCS-SP5 9. כערכי תמונת מחברים של 20-40 מיקרומטר בקוטר, הם כנראה פחות רגישים לשינויים בפוקוס מאשר במודל שלנו (ניטור של ורידי mesenteric של 200-400 מיקרומטר). כאשר ההדמיה רקמה חיות, שליטה של מוקד הוא הנושא החשוב ביותר, המגביל את האפשרות להקליט סרט ייחודי שנמשך כמה שעות. אנו רואים שהקלטת סרטים שנמשכים 30 דקות (או 45 דקות) היא המעשית ביותר במודל mesenteric.
התוספת של אגוניסטים TLR משנה את רוחב הכלי ולכן המיקוד. כתוצאה מכך,זה מאוד קשה לתמונה כראוי דקות 10-15 הראשונות לאחר הגירוי עד כלי לייצב.
מגבלה נוספת היא משך הניסוי. בשל הקושי לשמור על העכבר בהרדמה כראוי על פני תקופה ארוכה של זמן, זה קשה יותר מתמונה 4 שעות לאחר דלקת. השימוש בהרדמה אחרת, כגון שאיפת isoflurane רציפה, עשויה להיות אופציה (אם כי לא נבדק על ידינו).
בעכברים ישנים (מעל גיל 16 שבועות), כמות מוגברת של פיקדונות שומן סביב כלי להקטין את איכות ההדמיה של כלי mesenteric. לכן, עדיף להריץ ניסויים עם עכברים 8-12 שבועות.
טכניקה זו יכולה להיות משולבת עם הזרקת IV של נוגדנים לחסום מולקולות של עניין או לרוקן אוכלוסיות יקוציט נתון, כך שהחשיבות של מולקולות מעורבות בגיוס לויקוציטים או התנהגות ניתן לקבוע. בְּנוֹסַף,ניתן לעקוב תת יקוציט אחר באמצעות זני עכבר מהונדסים אחרים להביע חלבוני ניאון באוכלוסיות תאים של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
