Abstract
Etkin bağışıklık tepkisi enfeksiyon veya hasar bölgesinde kan lökositlerinin hızla harekete bağlıdır. In vivo lökosit göçü incelenmesi damar endotel ile lökosit endotel göç ve etkileşim moleküler temelini anlamak için çok önemlidir. Bir etkili bir yaklaşım ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir.
Burada bir ters konfokal mikroskop ile turuncu boya etiketli nötrofil enjekte CX 3 CR1 GFP / ağırlık fare iv görüntüleme monosit ve nötrofillerin için bir protokol mevcut. Time-lapse film hem kararlı hal ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde lökosit davranışının analizine imkan görüntüleme birkaç saat 30 dk toplandı. Yerel TLR2 / TLR1 agonisti Pam3SK4 kan damarı inflamasyonunu indüklemek ve subseque izlemek Ayrıca adımları açıklarnötrofil ve monositlerin nt işe.
Sunulan teknik aynı zamanda lökositlerin diğer popülasyonları izlemek ve diğer uyaranlara veya transgenik fareler kullanılarak lökosit alımı veya insan ticareti karışmış molekülleri araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Nötrofiller ve monositler sürekli dolaşıma doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücreleri bulunmaktadır. Yaralanma ya da enfeksiyon üzerine, enflamatuar sinyaller burada hücresel bir bağışıklık tepkisi başlatılması 1-3, hasar görmüş enfekte dokulara lökosit ROS neden olur. Lökosit seferberlik hızlılığı bağışıklık tepkilerinin olumlu sonucunu belirler. Bu karmaşık süreçler lökosit karışmış moleküller üzerinde anlayışlar elde .To dolaşan lökositler ve endotelyum 1-3 arasındaki yapışma temasların kurulması için yardım iltihaplı endotel üzerinde bulunan belirli moleküllerin (örneğin, selektinler, endotel bağlı kemokinler) güveniyor işe alım çağlayan, hücre işe kinetiği görselleştirmek için ve her bir hücre / nüfus davranışlarını izlemek için önemlidir. Etkili bir yöntem ilgi hücrelerinde floresan proteinleri eksprese eden transgenik fareler üzerinde İntra vital mikroskopik içerir.
Bugüne kadar içeriği ">, intravital mikroskopi kullanılarak çeşitli yaklaşımlar görüntüye geliştirilen damar 4,5. Mesela, kulak dermis damar sistemi ya da intravital konfokal mikroskobu ile mezenterik damarların görüntüleme kemirgen Ly6C düşük monosit ve insan devriye davranışını tanımlamak için kullanılan CD14 kararlı hal şartları altında 6-8 kan damarlarının lümen tarafında CD16 + monositleri dim. Fare cremaster damar modeli, genellikle transgenik farelerin enflamatuvar veya iskemik koşullar altında nötrofil veya enflamatuar Ly6C yüksek monosit davranışını izlemek için kullanılır. Bu ise durumda, Cremaster IL1β, CCL2, TNFβ ya fMLP intraskrotal enjeksiyon ile uyarılır. 2-4 saat sonra, dokular daha sonra cerrahi dışarı çıkarılmıştır ve intravital konfokal mikroskopi 9-11 ile analiz edilmiştir.Aşağıdaki protokol bir ile aynı anda monositleri ve nötrofilleri izlemek için bir yöntemi tarif etmektedirters floresan konfokal mikroskop. Ayrıca, yöntem lökosit işe kinetiği takip nasıl daha önce görüntü aynı geminin (kararlı hal durumu) ve inflamasyon sonra nasıl ayrıntıları. Bu amaç için, olan monositler eGFP ifade iv portakal renkli bir boya etiketli kemirgen nötrofillerinin, enjekte CX 3 CR1 gfp / ağ fare kullanılır. Ters konfokal mikroskop kullanılarak, (1) izler ve kararlı koşullar ve (2) lokal enflamasyon sonrasında aynı kap içinde iki monosit ve nötrofillerin ilerlemesini takip etmek altında devriye Ly6C düşük monositleri analiz etmek mümkündür. Burada TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 kullanarak inflamatuar koşullar yaratır. Ayrıca, bu tür görüntüleme belirli nakavt fareler üzerinde ya da engelleme antikorların 6,9,13 varlığında gerçekleştirilir ise lökosit işe çağlayan çeşitli adımlar ilgi belirli moleküllerin rolünü belirlemek için yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Hayvan prosedürleri İsviçre'nin Cenevre şehrinde Hayvan Bakım kurumsal Etik Komitesi ve Kanton Veteriner Dairesi ile uygun olarak yapıldı. Yetkilendirme numarası GE / 63/14.
Kemik iliğinden tek bir hücre süspansiyonu hazırlanması 1.
- Servikal dislokasyon ile Kurban fare (eski 8-12 hafta). % 70 etanol ile arka ayakları sterilize. Arka ayakları cildi çıkarın.
- Fare uyluk ve kaval kemiklerinden inceleyin ve bir neşter ile bacaklarından doku kaldırmak. PBS ile dolu bir kültür çanak içine% 90 etanol ve yer ile bacakları durulayın.
- Diz ekleminde bir neşter ve ayrı olan uyluk ve kaval kemiklerinden kültürü kaputu, temiz dokusu altında. Kemiklerin her bir ucunu kesti.
- 50 ml'lik bir 23G iğne ve hazırlama ortamı (fenol kırmızısız DMEM / F12,% 1 sıçan serum) ile dolu bir 1 ml şırınga kullanarak her bir kemikten kemik iliği yıkayın tüp vidalı. Ince 23G NE içinden Pasajlanması hücre agrega DisruptEdle ve 1 ml'lik şırınga. Hazırlık ortamı ile, 25 ml toplam hacim getirin.
- Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C. Atın süpernatant. 1 ml içinde süspanse pelet Eritrosit Lizis RBLC tamponu 15 ml tüp vidası (8.3 g NH4CI, distile su ile 1 L'ye tamamlandı 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), 0,22 um filtre). Buz üzerinde 30 saniye inkübe edin.
- Hazırlık orta ve santrifüj 250 x g'de 10 ml, 5 dakika, 4 ° C ekleyin. 2 ml hazırlanmış sıvı supernatant ve tekrar süspansiyon atın.
Negatif Seçim ile 2. Nötrofil Zenginleştirme
- Fare nötrofil zenginleştirme kokteyli (hücre izolasyonu platformu kiti gibi EasySep gibi) 150 ul ekleyin. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- Fenol kırmızısı içermeyen DMEM 10 ml ekleyin. Bir kez ters çevirin ve santrifüj 250 xg, 3 dakika, 4 ° C.
- Atın süpernatant. Alt tüpler yuvarlak 5 ml polistiren 1.75 ml hazırlık ortamda süspanse pelet. 250 ul ekle BiotSeçim Kokteyl. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- Tanecikleri yeniden sübyeleştirmek için 30 saniye için (hücre izolasyon platformu kit) manyetik parçacıkları vorteksleyin. Hücre süspansiyonunun 500 ul manyetik parçacıkların ekleyin. Karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- Cazibe merkezi haline tüp yerleştirin. 3 dakika bekleyin.
- İstenen Etiketsiz hücreleri toplamak için alt tüpler yuvarlak yeni bir 5 ml'lik polistiren üzerine mıknatıs ters çevirin. Tüp içinde asılı son damlasına almayın. İstenmeyen hücre mıknatıs içine bir tüp içinde kalır. Bir biohazard atık içine bu tüp atın.
- Mıknatıs yeni tüp yerleştirin. 3 dakika bekleyin.
- Yeni 15 ml istenen etiketsiz hücreleri toplamak için tüp vidalı üzerine mıknatıs ters çevirin. Tüp içinde asılı son damlasına almayın.
- Fenol kırmızısı serbest DMEM ile 5 ml Komple hacmi.
Nötrofiller 3. Etiketleme
- Böyle Hücre Tracker Orange olarak turuncu bir boya 0.5 ul ekleyin (çalışma konsantrasyonu1 uM, CMRA - klorometil-RODOL-asetat, hazır DMSO içinde 10 mM). 37 ° C 'de 2 dakika kuluçkalayın.
- Hazırlama ortamına 2.5 ml ilave edilir. Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C.
- Atın süpernatant. 1.5 ml bir tüp içinde 1 ml hazırlanmış sıvı içinde süspanse pelet.
- Hematositometre ile saymak için bir kısım atın.
- 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Santrifüj 250 xg 5 dak, 4 ° C.
- Atın süpernatant. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse pelet. Santrifüj 250 xg, 5 dk, yıkamak için 4 ° C.
- Atın süpernatant. 100 ul PBS başına 10x10 6 hücre olarak süspanse pelet. Iv enjeksiyon kadar buz üzerinde tutun. NOT: Hücreler iv mümkün olduğunca çabuk enjekte olması gerekir. 6-12x10 6 nötrofil / fare genellikle elde edilir.
İntra vital mikroskopik 4. Fare Hazırlama
NOT:.. Adım 4.1) ve 4.2) ic üzerinde etiketli nötrofil uzun bekleme süresini önlemek için denemenin başında yapılmalıdıre.
- CX 3 CR1 GFP fare (eski 8-12 hafta) tartılır.
- (PBS içinde 1.75 mg / kg ketamin acepromazone 60 mg / kg, ksilazin 4,5 mg / kg), anestezik 800 ul hazırlayın.
- Fare anestezisi. Fare için 200 ul / 20 g Enjeksiyon ip. Kısma ayak tarafından ve solunum hızını kontrol ederek Kontrol anestezi.
- Nötrofiller (100 ul PBS içinde 10x10 6 hücre), venöz deneyci kolaylık, yanal kuyruk venleri veya retro-orbital sinüs enjekte edilir.
- Isıtma yastığı fare koyun ve göz jeli ile gözleri korumak.
- Bir cam lamel (35 mm çapında), bir 30 mm çapında bir delik olan bir 10 cm doku kültürü çanağı içinde konur. Kullanım yağı lamel ile temas halinde doku kültürü çanak tutmaktır.
- Periton maruz makas ile karın cildi İnsizyon. Bağırsak maruz makas ile periton İnsizyon.
- 200 ul PBS p haline (37 ° C'de önceden ısıtılmış) ilaveeritoneal boşluğu. Elinizdeki fareyi alın ve bağırsak nazik bir basınç ile periton boşluğuna dışarı çıkar böylece, yüzü aşağı çevirin. Doku kültürü çanak fare yerleştirin.
- Yavaşça mezenterik damarları açığa amacıyla lamel üzerine steril pamuk tomurcukları ile bağırsak tekrar turlama.
- Bantlarında kağıt mendil kesin ve 37 ° C ısıtılmış PBS ile ıslatın. Peristaltizm kaynaklanan hareketleri azaltmak için kağıt dokuların adet bağırsak hareketsiz.
- Ters mikroskop ısmarlama tepsi sahneye 37 ° C termostatlı hazne içerisindeki doku kültürü çanak ve fare koyun. Arka bacak içine anestezik sc içeren bir şırınga tanıtın. NOT: Ayrıca, fare bir maske ile oksijen (0.5 L / dk) alabilirsiniz.
- Ayak kısma ve solunum hızı her 30 dakikada bir kontrol ederek anestezi Kontrol fare. Gerekirse, düzgün anesteziyi idame ettirmek için anestezik bir destek (20 ul) teslim. DEĞİLE: damar kurutulması kaçınılmalıdır. Bu nedenle, nem oranının düzenli 37 ° C ısıtılmış PBS ile bağırsak immobilize etmek için kullanılan kağıt mendil ıslatıcı tarafından yapılmaktadır.
Intravital Mikroskobu kullanılarak In Vivo iltihaplı Gemiler 5. Ölçme Nötrofil ve Monosit Davranışı
- Set lazerler ve lazer 488- kaynaklı fototoksisite önlemek için gerekli olan en düşük güçte 561- etmek. Deneylerde, 0,5% 'den düşüktür. Nötrofillerinde monositlerinde GFP ve portakal boya Yoğunluğu genellikle% 0.3 yeterli olduğunu çok parlak olduğunu. NOT: Bu bizim sistemimizle 0.15 mW 0.25 bir lazer gücü temsil eder.
- Ters mikroskop 20X kuru objektif kullanarak açık bir iğne deliği ile 2.2 saniyede 512 x 512 piksel (yani 635 mikron) görüntülerini elde edin. Düşük lazer güçler yeterli sinyal sağlayan 20 um 10 arasında bir z-derinlik kullanın.
NOT: Biz genellikle 12 ila 16 arasında bir z-derinliği ile deneyler gerçekleştirmek56 m. Sunulan rakamlar ve film durumunda, z-derinlik 20 mm. Faz kontrast endotel duvar belirlenmesini sağlar ve görüntüleme mesenterik damarlar üzerinde gerçekleştirilir. Devriye gezen hücreler ilgi alanı kayıt, 5-10 mikron / dk 6 hızında oldukça yavaş hareket beri her 20 sn tatmin edicidir. Açıklanan ayarlar ile, motorlu sahne aynı anda ilgi kadar 7 alanların kayıt sağlar. - Onları ilk film edinimi önce 30 dakika boyunca hazırlık kurtarmak için izin vardır fare ve mikroskop termostat odasında mezenterik damarlar yerleştirin. Bu süre zarfında, ilgi alanlarını çeşitli seçin. Amacına en yakın geminin lümen yüzeyi üzerinde odaklanın. Gerekirse, odağı ayarlamak için endotel hafif otomatik floresan yararlanın.
NOT: Fare hazırlanması sırasında Cerrahisi hafifçe endotelyumu vurguluyor. Sonuç olarak, nötrofillerin haddeleme ve/ veya monositler, ilk 15 dakika takiben fare hazırlanmasında gözlenebilir. - Kararlı hal şartları altında, 30 dakika, tek bir görüntü her 20 saniye için bir birinci film kaydedin.
NOT: Yazılım 2.2 sn ilgi her alan kazanır ve motorlu sahne otomatik olarak diğer bir alandan geçer. Bu kayıt film 30 dakika boyunca geri 20 saniye içinde ilk pozisyona gider. - Kan damarı iltihabı başlatmak için, TLR2 100 ug içeren PBS 20 ul bir damla ekleme / TLR1 agonisti Pam3CSK4 12, doğrudan görüntü verilen gemilerin üzerine.
- Ilgi her alan için odağı kontrol edin.
NOT: edinim sırasında, her zaman vardır z ekseni üzerindeki odak küçük değişiklikler. 10-20 mikron z-derinliğine rağmen, bu floresans yoğunluğunu bir azalmaya neden olabilir. Gerekirse nedenle, el, her filmin sonunda ilgi her alan yönlendirmesi. 30 dakika-sürelerle ve 3 saat kadar Tutanak filmlerital inflamasyon başladıktan sonra. - Deneyin sonunda, servikal dislokasyon ile anestezi uygulanmış fare kurban.
Film Dosyaları ve lökosit ve Takip 6. Nesil
NOT: Nikon kazanım yazılım dosyalarını .nd2 üretir ancak aşağıdaki prosedür diğer yazılım ve markalar ile benzer olacaktır.
- Tiff serisi olarak ihracat dosyaları.
- ImageJ yazılım (Git http://rsb.info.nih.gov/ij/). Tiff serisi içe aktarın. Farklı bir dosya olarak Her kanal.
- Arka plan gürültüsünü azaltmak için yeşil ve kırmızı kanallar (Süreç> Filtreler> Medyan ...) için 2.0 piksel yarıçaplı bir medyan filtre uygulayın.
- (İkili olun> Proses> Binary) ikili dosyaları dönüştürün. Her görüntü için eşiği hesaplamak için yazılım etkinleştirin.
- Bir resim serisi (Görüntü> Renk> ... Kanallar Merge) içine kanalları Birleştirme. Lenmesi, monositler seçinn kanal, kırmızı kanal ve gri kanalda iletilen ışık nötrofiller bulunmaktadır.
- RGB renk içine yığılmış görüntüleri dönüştürün (Görüntü> Renk> RGB Stack).
- Avi olarak dosyayı kaydedin
- Veriler ithal ve Imaris yazılımı (Bitplane) derlenmiştir. Monosit ve nötrofillerin hareketleri sonra Nokta İzleme Sihirbazı kullanılarak izlenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eser gerçek zamanlı olarak kolayca anestezi farelerin mesenterik damarlar içindeki monosit ve nötrofillerin davranışını izlemek için optimize edilmiş bir protokol açıklamaktadır. 37 ° C-termostatlı odacığın kullanımı fare sıcaklığı korumak için zorunludur ve aynı zamanda nedeniyle lökositlerin sıcaklığa bağlı hareket etmektir. Fare hazırlanması Şekil görüntülenir 1. Şekil 2 mikroskop altında görülen tüm bölgeyi gösterir. İletilen ışık mezenterik damarlar (kırmızı ok) ve arterler (mavi ok) belirlenmesini sağlar.
Böyle Movie 1 ve Film 2 olarak ImageJ yazılımı oluşturulan film dosyaları ile elde edilen görüntülerin tedavisi. 3 görüntüler Film ilk zaman noktası için görüntü işleme farklı adımları Şekil 1. Film 1 kararlı hal koşullarında Ly6C düşük Monositlerin devriye gösterir daha önce de olduğu gibiTüm nötrofil kan dolaşımında oysa 6,8,14 kayıtsız kalamayız. Hiçbir nötrofil endotel duvarı devriye geziyor. Film 2 yerel iltihabı başlatmak için TLR2 / TLR1 agonisti Pam3CSK4 eklendikten sonra faiz 90 dakika aynı alanını gösterir. Bu durumda, nötrofiller ve monositler kitlesel onlar titizlikle tarama endotel duvarına işe alınırlar. Bu TLR agonistinin bu ilaveli endotel genişliği değişikliğe sebep ve sonuç olarak z ekseni odağını değiştirir dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, odak dikkatle agonist ilave edilmesinden sonra kontrol edilmelidir. Imaris yazılımı (Bitplane) veri derlenmesi Nokta İzleme Sihirbazı kullanarak bireysel lökosit takibi sağlar. Şekil 4 endotel boyunca devriye gezen monositler (yeşil) ve nötrofil (kırmızı) tam parça yollarını gösterir. Veri, yani 90 dakika inf başladıktan sonra, Film 2 analizinden elde edilirlammation. Lökosit yolları Takibi gibi hat uzunluğu, yer değiştirme, süre veya hız gibi çeşitli istatistikleri almak tiff dosyaları veya xls dosyaları olarak ihraç edilebilir.
Bu teknik, önce ve iltihabı sonra, aynı zamanda monositlerin ve nötrofillerin davranışını izlemek için iyi bir yol sunar. Bu endotel duvar mesai bu hücrelerin işe izlemek mümkündür. Z ekseni ya da x / y deplasman odaklanma kaybı deneyi berbat bağırsak hareketlerinin bir sonucu olarak ortaya çıkabilir. Film 3 gibi başarısız hazırlık ve satın alma göstermektedir.
1. Fare hazırlık Şekil.
Siyah oklar bağırsak hareketsiz kullanılan PBS ıslatılmış doku gösterir. Beyaz ok 10cm doku kültürü çanak gösterir. T mikroskop sığar alüminyum ısmarlama tepsi sahne gösterir. Mesenter kan damarları güzel lamel merkezinde maruz kalmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mezenterik ven ve arterlerin 2. Şubeler Şekil.
10X amacı ile çekilen görüntüler (20 x 10) mevcuttur alanın büyük bir görüntü teşkil dikişli bulundu. Çevrede çeşitli alanlar daha sonra bir 20X objektif lökosit hareketi izlemek için seçilir. Kırmızı ok bir mezenterik ven gösterir. Mavi ok mezenterik arter gösterir. Yeşil ok damarları çevreleyen yağ dokusu gösterir. Islanan doku varlığı görüntü sonuçları tarafta karanlık alan bağırsak hareketsiz hale getirmek için kullanılır. Beyaz ölçek çubuğu 1 mm temsil eder.k "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ImageJ ile 3. Görüntü işleme Şekil.
Görüntü işleme farklı aşamaları ayrı ayrı ele alınmaktadır Film 1. Yeşil (monositler) ve kırmızı (nötrofiller) ilk kanal görüntü için gösterilmiştir. Orijinal ham verilerin (A) için, medyan filtresi (B) uygulanır ve daha sonra bir ikili görüntüde (C) dönüştürülür. (D) Kanallar nihai görüntüye birleştirilir. Ham veri gözlenen yeşil veya kırmızı çizgiler mikroskop tamamen onları elde etmek mümkün olmadığı kadar hızlı hareket ediyor hücrelerdir. Beyaz ölçek çubuğu 40 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Bireysellökosit izler.
Monositler (A) ve endotel devriye nötrofillerin (B) Parçalar Imaris Yazılımı (Bitplane) ile işlenir. Beyaz ölçek çubuğu 40 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film kararlı durumdaki endotel duvarı tarayarak 1. Lökositler. Kararlı durumda, Ly6C düşük monositler endotel devriye. Nötrofiller kan akımına göre dolaşmaktadır. Nötrofiller kırmızı ve monositler yeşil bulunmaktadır. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. 20X amacı ile oluşturulan. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ge = "always"> 
2:. Lökositler TLR2 aracılı iltihap sonrası endotel duvar tarama ilgi aynı alan Film 1 'deki gibi film 90 dakika ile doğrudan gemiye Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 agonist), 100 ug içeren PBS 20 ul ilave edildikten sonra başlar. Işe monositler ve nötrofiller titizlikle endotel duvarı taradığınız. Nötrofiller kırmızı ve monositler yeşil bulunmaktadır. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 3: Yanlış fare hazırlama elde edilen sonuçlar anestezi veya bağırsak immobilizasyonu yanlıştır elde edilen gemilerin hareketleri.. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" target = "_ blank"> Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda anlatılan metodolojiler verimli kararlı durum ve inflamatuar koşullarda mezenterik venlerde monosit ve nötrofil davranışlarını incelemek için tutarlı bir yaklaşım sağlamak.
Hazırlık önemli adım PBS ıslak mendil ile bağırsak immobilizasyonu olduğunu. Düzgün gerçekleştirilen Eğer mezenterik damarlar güzel görüntü elde etmek için lamel maruz kalmaktadır. Bu mezenterik venlerde lökosit davranışını izlemek için ilgi çeşitli alanlarda seçimini sağlar.
Bizim protokolü (1) doğrudan izlenen damarlarda enflamasyon ikna etmek, ve (2) stimülasyon sonra erken zaman noktaları kaydetmek ve (3) kinetiği takip etmek sağlayarak, deneylerin başlamasından önce mezenterik damarların eksteriorizasyon içerir lökositlerin işe öncesi ve inflamasyon indüksiyon sonrası aynı kap içinde davranışları.
Biz transfdaha fazla hücre (0.5-2x10 6 / fare vs 6-12x10 6) hayvan başına elde edilebilir er nötrofiller aynı genetik kökenli fare kemik iliğinden saflaştınldı ve kandan. Kan nötrofillerinin kullanılması tercih edilir ise, aynı protokol hücre saflaştırılması için gerçekleştirilebilir.
Intravital görüntülemede, damar görüntüleme mezenterik damarların durumunda iletilen ışık etkindir. Alternatif olarak, PECAM1 karşı floresan antikor (klon 390) ya da floresan yüksek molekül ağırlıklı dekstran (70kDa veya 2 MDa) 6,14 damarsal algılamak için enjekte iv olabilir. Örneğin, 3 ug anti-PECAM1 (klon 390) intra-skrotal enjeksiyon, düşük arka plan ile damar algılamasını etkinleştirmek ve cremaster modeli 9 lökosit aktivitesini etkilemediği bildirildi. Iletilen ışık ile karşılaştırıldığında, floresan antikorlar veya boyaların kullanımı özellikle vascu 3D rekonstrüksiyon olasılığını tanıttılature ama kanalının etiketleme öldürülür ve elde etme süresi artar. Burada tarif edildiği gibi İletilen ışık, damar şeffaflık mezenter modeli sayesinde yeterlidir. Aksine, damar floresan etiketleme kulak dermiş veya opak organlarda zorunludur.
Lökosit popülasyonları tespiti belirli bir hücre tipinde endojen floresan sergileyen transjenik hayvanlar (; monositler ve nötrofiller Lys EGFP 9 ve trombositler CD41 YFP 17 monositler Cx 3 CR1 eGFP / ağ 6 veya cd115 CFP 15 veya CD68 gfp 16) kullanılarak elde edilebilir . CX3CR1, Cx 3 Tüm monositlerin ve NK ve T hücrelerinin, bazı alt gruplarında CR1 eGFP / ağırlık fare ifade edilir, ancak iltihap LY6C <ayırt etmek ilginçtirsup> yerleşik Ly6C düşük monositler 6 daha az GFP floresan sergileyen yüksek monositler. CD115 monositik ait özel bir olduğu için, bir fare MacBlue cd115 CFP ilginç bir modeldir. Ancak Ly6C yüksek ve alçak Ly6C monositlerini ayırt etmek mümkün değildir.
Transgenik floresan farelerin bir alternatif gerçek zamanlı olarak lökositlerin popülasyonları etiket floresan antikor iv enjeksiyonu olduğunu. Örneğin, monositler, anti-CD115 (klon AFS98), anti-CD49b (klon HMα2) anti-Ly6G (klon 1A8) olan nötrofil ve trombosit ile etiketlenebilir. Genel olarak, bu antikorlar, yüksek bir dozda tükenmektedir. Bu nedenle, bazen kısa bir süre için ve düşük seviyelerde dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Hatta düşük dozda, hücre fonksiyonu üzerinde bir etkisi göz ardı edilemez olduğu not edilmelidir. Düşük miktarlarda (1-2 mikrogram) ile kişisel deneyim CD115 + mon etiketlenmesi sağlartükenmesi olmadan ocytes ve Ly6G + nötrofiller (veri yayınlanmadı).
Kulak bakir olduğu gibi kulak dermis damarsal model non-invaziv olmasına rağmen, kulak dermis derinliği onu yapar, bir husustur 2-foton mikroskopi 13 için daha uygun bir modeli. Ayrıca, doğrudan fiziksel hazırlık bozmadan kulak modelinde kap teşvik etmek mümkün değildir.
Bizim protokol herhangi bir ters konfokal mikroskop ile uygulanabilir. Tarama hızı ve lazer güç makine bağımlı, olduğu tek z-düzleminde bir kare (512 x 512 piksel, yani 635 mikron) edinimi Nikon A1R'ye ve galvano tarayıcı için bizim ayarlarla yaklaşık 2.2 sn gerektirir. Ne yazık ki, bu düşük hızda kalite kaybı olmadan mezenterik damarların dört boyutlu film kaydı olasılığını sınırlamaktadır. A1R'ye rezonans tarayıcı olmasına rağmen, yüksek bir edinim hızı sunuyorGörüntülerin kalitesi kuvvetle CX 3 CR1 GFP / ağırlık fare ile deneyler için (spesifik sinyal karşı background) azalır. Bu lazerler fototoksisite ve ağartma önlemek için% 0.5'in altında (<0.25 mW) ayarlanır akılda tutulmalıdır.
Woodfin ark Leica TCS-SP5 9 kullanarak cremaster venüllerin (40 sn 60 z-yığın görüntüleri) 4D film elde başardı. Çapı 20-40 mikron yazarları görüntü değerlerine gelince, onlar muhtemelen bizim modeli (200-400 mikron mezenterik damarların izlenmesi) 'den odak değişikliklere daha az duyarlıdır. Canlı doku görüntüleme yaparken, odak kontrolü birkaç saat süren eşsiz bir film kaydetmek imkanı kısıtlar en önemli endişe olduğunu. Biz 30 dakika (ya da 45 dakika) süren film kaydı mezenterik modelinde en pratik olduğunu düşünüyoruz.
Toll benzeri reseptör agonistlerinin ekleme kabı genişliğini ve dolayısıyla odak değiştirir. Sonuç olarak,gemiler stabilize kadar stimülasyon sonra düzgün resmin ilk 10-15 dk çok zordur.
Başka bir sınırlama deney süresidir. Uzun bir süre boyunca uygun şekilde anestezi fare korumak için zorluk nedeniyle, iltihap sonrası 4 saat daha görüntü zordur. (Bizim tarafımızdan test olmasa da) bu tür sürekli izofluran inhalasyon gibi diğer anestezikler, kullanımı bir seçenek olabilir.
Eski farelerde (yaş 16 hafta boyunca), damarların çevresinde yağ mevduat miktarının artması mezenterik damarların görüntülenmesi kalitesini düşürmektedir. Bu nedenle, 8-12 haftalık fareler ile deneyler çalıştırmak daha iyidir.
Bu teknik ilgi moleküllerinin bloke etmek veya lökosit göçünün ya da davranış implike moleküllerin önemini tespit edilebilir, böylece, belirli bir lökosit popülasyonları tüketmek için antikorların iv enjeksiyonu ile kombine edilebilir. Buna ek olarak,Diğer lökosit alt-gruplar ilgi hücre popülasyonlarında floresan proteinleri eksprese eden transgenik fare suşları, diğer kullanılarak takip edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
