Abstract
有效的免疫反应是依赖于血液中的白细胞的快速动员到感染或损伤的部位。 调查白细胞迁移体内对于理解白细胞跨内皮迁移和相互作用与血管内皮的分子基础是至关重要的。一种有效的方法包括在表达荧光蛋白在感兴趣的细胞转基因小鼠活体显微镜。
在这里，我们提出了一个协议，用于成像的单核细胞和中性粒细胞在CX 3 CR1 GFP /鼠标重量静脉注射橙色染料标记的嗜中性粒细胞用倒置的共聚焦显微镜。时间推移电影收集从30分钟到几个小时的成像允许的白细胞行为在肠系膜静脉两个稳态和炎性条件下分析。我们还描述的步骤，以在本地引起血管炎症TLR2 / TLR1激动剂Pam3SK4和监控subsequeNT招聘中性粒细胞和单核细胞。
所提出的技术也可以用于监测白细胞的其他人口和调查使用等刺激或转基因小鼠的分子参与了白细胞招聘或贩运。
Introduction
嗜中性粒细胞和单核细胞是先天免疫系统，它在血液中循环连续的细胞。在损伤或感染，炎症信号诱导白细胞血细胞渗出到受损和感染的组织中，本文引发细胞免疫应答1-3。白细胞动员的快速性决定了免疫应答的积极成果。这些复杂的过程依赖于特定的分子 （如选择素，血管内皮细胞结合的趋化因子）出现在发炎的内皮细胞，帮助循环白细胞和血管内皮细胞1-3之间建立接触胶。要得到牵连白细胞分子见解招募级联，可视化细胞募集的动力学和跟踪每个小区/群体的行为是重要的。一种有效的方法包括在表达荧光蛋白在感兴趣的细胞的转基因小鼠活体显微镜。
内容“>迄今为止，使用活体显微镜几种方法被开发以图像脉管4,5，例如，耳真皮脉管或肠系膜静脉由活体共聚焦显微镜成像被用来确定的鼠的Ly6C 低的单核细胞和人巡逻行为CD14 变暗 CD16 +单核细胞上的血管的稳定状态条件下6-8腔侧，鼠标提睾脉管模型通常用于监测炎症或缺血性病症中的转基因小鼠嗜中性粒细胞之下或炎症的Ly6C 高的单核细胞的行为。在这情况下，提睾通过阴囊内注射IL1β，CCL2，TNFβ或fMLP的刺激后2-4小时，组织，然后手术形象化和活体共聚焦显微镜9-11分析。以下方案描述了一种方法来监控单核细胞和中性粒细胞的同时与任何倒置荧光共聚焦显微镜。此外，我们的方法，详细介绍了如何前映像相同的容器（稳态条件）和炎症后如何遵循白细胞募集的动力学。为此目的，我们使用在CX 3 CR1 GFP /重量鼠标，其单核细胞表达eGFP的，静脉注射一种橙色色素标记的鼠中性粒细胞。使用倒置共聚焦显微镜，它是可能的（1）来跟踪和分析稳态条件和（2）以符合两个单核细胞和中性粒细胞在同一容器中的后局部炎症招募下巡逻的Ly6C 低的单核细胞。在这里，我们创建了炎症的使用TLR2 / TLR1激动剂Pam3CSK4 12。而且，这样的成像可有助于确定是否对特定敲除小鼠或在阻断抗体6,9,13的存在下进行的，在各个步骤的白细胞募集级联感兴趣的特定分子的作用。
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Protocol
注：动物的程序是按照动物护理在瑞士日内瓦的机构伦理委员会和州兽医办公室进行。授权号GE / 63/14
1.准备一个单细胞悬液，从骨髓
- 牺牲小鼠（8-12周龄）颈椎脱位。消毒后腿以70％的乙醇。从后腿去除皮肤。
- 解剖出鼠标的股骨和胫骨和腿部用手术刀去除组织。冲洗的腿与90％的乙醇和地方变成培养皿填充有PBS。
- 根据培养罩，干净的纸巾，从股骨和胫骨用手术刀和独立的膝关节。切断骨头的两端。
- 从每个骨骼使用23G针和1ml注射器填充有制备培养基（无酚红的DMEM / F12，1％大鼠血清），到50毫升冲洗骨髓的螺旋管。通过经由23Gね微妙传代破坏细胞聚集体edle和1ml注射器。把总体积25毫升的准备中。
- 离心机250 XG，5分钟，4℃。弃上清。在1ml重悬沉淀红细胞溶解RBLC缓冲液（8.3克氯化铵 ，1克碳酸氢钠，加入1ml EDTA（100毫米），完整到1L蒸馏水，过滤0.22微米）在15ml的螺旋管。孵育30秒在冰上。
- 加入10毫升制备培养基和离心机250×g离心5分钟，4℃。弃上清，悬浮在2毫升的准备中。
2.中性粒细胞富集阴性选择
- 加入150微升鼠标中性粒细胞富集的鸡尾酒（细胞分离试剂盒的平台，如EasySep）。混合并在冰上孵育10分钟。
- 加入10毫升酚红的DMEM。倒置一次和离心机250×g离心3分钟，4℃。
- 弃上清。悬浮颗粒在1.75毫升制备介质在5毫升聚苯乙烯圆底管。加入250微升比奥在选择鸡尾酒。混合并在冰上孵育10分钟。
- 涡磁性粒子（从细胞分离平台盒）30秒重悬颗粒。加入500μl磁性粒子的细胞悬浮液。混合并在冰上孵育10分钟。
- 将管插入磁铁。等待3分钟。
- 反转磁铁到一个新的5毫升聚苯乙烯圆底管，收集所需的未标记细胞。不要把最后一滴挂在管。不需要的细胞将保留在磁铁内部的管。丢弃该管成生物危险废物。
- 将新管插入磁体。等待3分钟。
- 反转磁铁到新款15毫升螺旋管，收集所需的未标记细胞。不要把最后一滴挂在管。
- 完整体积至5ml用酚红的DMEM。
3.标签中性粒细胞
- 添加0.5微升橙色染料如细胞跟踪橙色（工作浓度为1μM，CMRA - 氯甲基rodol乙酸酯，库存的10mM在DMSO中）。在37℃下2分钟。
- 加入2.5毫升的准备中。离心机250 XG，5分钟，4℃。
- 弃上清。重悬沉淀在1ml制备介质在1.5ml管中。
- 以等分用血细胞计数器计数。
- 孵育5分钟，在37℃。离心机250 XG，5分钟，4℃。
- 弃上清。重悬沉淀在1ml PBS中。离心机250×g离心5分钟，4℃下洗。
- 弃上清。悬浮颗粒每100微升PBS 10×10 6个细胞 。置于冰上，直到静脉注射。注：电池必须IV尽快注射越好。 6-12x10 6中性粒细胞/鼠标，通常获得的。
4.鼠标准备活体显微镜
注意：步骤4.1）和4.2）应在实验开始时进行，以避免对IC标记的嗜中性粒细胞的延长的等待时间即
- 称量CX 3 CR1 GFP小鼠（8-12周龄）。
- 制备800微升麻醉药（氯胺酮60毫克/公斤，甲苯噻嗪4.5毫克/千克，acepromazone 1.75毫克/公斤的PBS）。
- 麻醉鼠标。注射IP用200微升/ 20克鼠标。按捏脚趾并通过检查呼吸频率控制麻醉。
- 注入的中性粒细胞（10×10 6个细胞在100μlPBS中）静脉内使用的侧面尾静脉或眶后窦，在实验者的便利性。
- 把鼠标放在加热垫，保护眼睛，眼部凝胶。
- 的玻璃盖玻片（直径为35毫米）放置在10厘米组织培养皿，它有一个直径30毫米的孔。使用油是维持组织培养皿中的盖玻片接触。
- 切开腹部皮肤用剪刀，露出腹膜。腹膜切开用剪刀，露出肠。
- 加入200μl的PBS（预加热，在37℃）到peritoneal腔。拿鼠标在你的手，把它面朝下，使肠道得到了腹腔中有一个温和的压力。鼠标放置在组织培养皿。
- 轻轻deroll用消毒棉签将肠道到盖玻片，以暴露肠系膜血管。
- 切纸组织的乐队，与37℃加热PBS弄湿。固定与面纸的部分小肠，以减少从肠蠕动而产生的运动。
- 把组织培养皿和鼠标37℃恒温室内部到倒置显微镜的定做托盘阶段。引入含有麻醉药SC到后腿的注射器。注：此外，鼠标可以接收氧气（0.5升/分钟）用的掩模。
- 控制鼠标麻醉通过脚趾捏和检查呼吸频率每30分钟。如果需要，提供麻醉药的提升（20微升）妥善维持麻醉。不E：应避免脉管的干燥。因此，它的湿度是通过定期润湿用于固定肠用37℃温热的PBS的纸巾保持。
5.测量中性粒细胞和单核细胞行为发炎的血管在体内使用活体显微镜
- 设置激光器488-和561-在需要避免激光诱导光毒性最低的功耗。在我们的实验中，这是低于0.5％。绿色荧光蛋白在单核细胞和橙色染料中性粒细胞的强度是如此明亮，通常为0.3％就足够了。注意：此表示0.15〜0.25毫瓦与我们的系统的激光功率。
- 收购的512×512像素（ 即 635微米）的2.2秒的图像，使用倒置显微镜的20X干客观开放的针孔。使用10的Z深度20微米，以确保足够的信号与低功率的激光。
注：我们通常用做实验用12至16的Z深度56，M。在呈现附图和电影的情况下，在z深度为20微米。相衬允许内皮墙壁的识别和成像肠系膜上静脉进行。由于巡逻细胞移动相当缓慢，5-10微米/分钟6的速度，记录的关注的一个领域，每20秒令人满意。所描述的设置，电动阶段允许感兴趣多达7字段的同时记录。 - 鼠标放置在显微镜的恒温室中的肠系膜血管被允许他们从获取的第一部电影的前准备30分钟恢复。在此期间，选择感兴趣的几个领域。重点放在最接近目标容器的腔表面。如果需要，采取轻微的自体荧光血管内皮细胞的优势，设置焦点。
注：鼠标准备在手术过程中稍微强调内皮。因此，轧制中性粒细胞和/或单核细胞所用的第一15分钟以下鼠标制剂中观察到。 - 录制的第一部电影稳态条件下30分钟，一张图片，每20秒。
注：该软件获取的每个感兴趣字段在2.2秒和电动阶段自动地从一个场移动到另一个。这又回到了在20秒内的第一个位置，在记录电影的30分钟。 - 要启动血管炎症，加入20微升PBS含100微克TLR2的下降/ TLR1激动剂Pam3CSK4 12直接到成像的船只。
- 控制聚焦为每个感兴趣的领域。
注：在收购的过程中，总有重点的对Z轴的细微变化。尽管10-20微米的z深度，这会导致降低的荧光强度的。因此，手动重新集中的每个感兴趣字段在每部电影的最后，如果需要的话。 30分钟时段和最多3个小时，拍摄电影TAL炎症开始后。 - 在实验结束时，通过颈脱位牺牲麻醉小鼠。
6.代电影文件和白细胞跟踪
注：尼康采集软件生成.nd2文件，但下面的程序将与其他软件和品牌的同类。
- 文件导出为TIFF系列。
- 转到ImageJ的软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/）。导入TIFF系列。每个信道为不同的文件。
- 具有2.0像素为绿色和红色通道，以减少背景噪声（处理过程>滤波器>中位...）的半径应用中值滤波器。
- 文件转换成二进制（流程>二进制>进行二进制）。启用软件来计算阈值的每个图像。
- 合并频道合并为一个图像序列（图像>彩色>合并通道...）。选择格力的单核细胞n个信道，在红色通道，并在灰色通道的透射光的中性粒细胞。
- 堆叠图像转换为RGB颜色（图像>颜色>堆栈RGB）。
- 文件保存为.AVI
- 数据被导入并在了Imaris软件（位平面）编制。单核细胞和中性粒细胞的运动即期跟踪向导，然后跟踪。
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Representative Results
手稿描述了一种优化的协议来方便地监视单核细胞和嗜中性粒细胞中的实时麻醉的小鼠的肠系膜静脉的行为。使用37℃-恒温室的是强制性的，以保持鼠标的温度，也由于白细胞的温度相关的运动。鼠标的制备显示于图1中。图2示出了所有在显微镜下看到的面积。透射光使肠系膜静脉（红色箭头）和动脉（蓝色箭头）的标识。
治疗ImageJ的软件生成的视频文件，如电影1和 Movie 2获取的图像，图3显示的不同步骤的图像处理为电影的第一个时间点1。电影1显示的Ly6C 低的单核细胞在稳态条件下的巡逻，如前面解划线6,8,14而所有中性粒细胞在血液中循环。不嗜中性粒细胞被巡逻的内皮墙。 电影2示出了感兴趣90分钟，同场加的TLR2 / TLR1激动剂Pam3CSK4的局部炎症开始后。在这种情况下，嗜中性粒细胞和单核细胞被大规模募集到内皮壁，它们扫描精心。要注意，除了一个TLR激动剂诱导的变化内皮宽度并因此改变了z轴的焦点是重要的。因此，重点应仔细加入激动剂后控制。在了Imaris软件（位平面）数据的汇编允许使用地点跟踪向导个别白细胞的跟踪。 图4示出了单核细胞（绿色）和嗜中性粒细胞（红色）沿内皮巡逻的精确光道路径。数据从电影2的分析得到的， 即 ，90分钟的inf开始后lammation。白细胞路径跟踪可以导出为TIFF文件或XLS文件以获得各种统计数据，如轨道长度，位移，时间和速度。
这种技术提供了一个很好的方式之前和炎症后监测单核细胞和中性粒细胞在同一时间的行为。能够跟踪这些细胞的募集的内皮壁加班。焦点上的z轴或甚至x / y的位移损失，可能会发生作为破坏实验肠运动的结果。动画3示出了这种失败制备和采集。
图1.鼠标准备。
黑色箭头指示用于固定在肠道的PBS-润湿组织。白色箭头指示10厘米组织培养皿。 T表示配合到所述显微镜的铝定做托盘阶段。肠系膜血管很好地暴露在中心的盖玻片。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.分行肠系膜静脉和动脉。
图像（20×10）与10X物镜拍摄被缝合以构成可用的区域的一个大图像。感兴趣的几个领域，然后选择监控与20倍的目标白细胞的运动。红色箭头表示肠系膜静脉。蓝色箭头表示肠系膜动脉。绿色箭头指示血管周围的脂肪组织。从湿润组织的存在的图像的结果的侧面暗区用于固定肠道。白色比例尺为1毫米。K“>点击此处查看该图的放大版本。
图与ImageJ的3图像处理。
示出用于动画1.绿色（单核细胞）和红（中性粒细胞）的信道被分开处理的第一图像中的不同步骤的图像处理。到原始的原始数据（A）中，中值滤波器被应用（B），然后转换为二进制图像（C）的。 （D）的信道被合并成一个最终的图像。在原始数据中观察到绿色或红色的线是被移动的如此之快，在显微镜不能全资收购它们的细胞。白色比例尺代表40微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.个人白细胞轨道。
单核细胞（A）和中性粒细胞（B）巡逻内皮轨道与处理软件了Imaris（位平面）。白色比例尺代表40微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
电影1白细胞扫描内皮墙的稳定状态。在稳定状态下， 低的Ly6C巡逻单核细胞内皮细胞。嗜中性粒细胞是根据血流循环。嗜中性粒细胞是在红和单核细胞是绿色。比例尺条为50微米。生成与20X的目标。 请点击此处观看该视频。
GE =“总是”> 
2：白细胞扫描内皮壁后TLR2介导的炎症的兴趣相同领域如电影1电影开始含有100μg的Pam3CSK4（TLR2 / TLR1激动剂）加入20微升PBS，直接到容器后的90分钟。招募单核细胞和中性粒细胞精心扫描内皮墙。嗜中性粒细胞是在红和单核细胞是绿色。比例尺代表50微米。 请点击此处观看该视频。
电影3：不正确配制鼠标得到的结果时获得的麻醉或肠管固定是不正确的血管运动。比例尺条为50微米。F =“https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi”目标=“_空白”>请点击此处观看该视频。
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Discussion
在这个手稿中描述的方法提供了一个一致的方法来有效地研究单核细胞和中性粒细胞行为的稳态和炎症的条件下肠系膜静脉。
制剂的关键步骤是用PBS-湿的薄纸肠的固定。如果执行得当，肠系膜血管是很好的暴露在盖玻片进行图像采集。这使得感兴趣的几个领域的选择，监测肠系膜静脉白细胞行为。
我们的方案涉及肠系膜血管的外化的实验开始前，使（1）直接诱导所监视船只炎症，和（2）刺激后，记录的早期时间点，（3），以跟进的动力学招募白细胞和前和诱导炎症后在同一容器中它们的行为。
我们TRANSF嗜中性粒细胞呃从相同遗传背景的小鼠骨髓纯化，并不会从血液随着更多的细胞可以每只动物得到（6-12x10 6 VS 0.5-2x10 6 /小鼠）。如果使用血液嗜中性粒细胞是优选的，相同的协议，可以进行用于细胞纯化。
在活体成像，脉管的可视化是通过在肠系膜血管的情况下的透射光启用。可替代地，针对PECAM1荧光抗体（克隆390）或荧光高分子葡聚糖（的70kDa或2 MDA）6,14可以是静脉注射，以检测血管。例如，内阴囊注射3微克的反PECAM1（克隆390）的报道，使血管检测与低背景和不影响白细胞的活动在提睾模型9。相比透射光，利用荧光抗体或染料的特别引入三维重建vascu的可能性lature，但一个信道会牺牲其标签和采集时间增加。透射光足以在mesenter模型由于脉管的透明度，如这里所述。相反，脉管系统的荧光标记是强制性的在耳真皮或不透明器官。
可以使用转基因动物表现出在特定的细胞类型的内源性荧光（单核细胞和中性粒细胞赖氨酸 绿色荧光蛋白9;和血小板CD41 YFP 17单核细胞CX 3 CR1 EGFP /重量6或CD115 CFP 15或 CD68 GFP 16）来实现检测白细胞种群。虽然CX3CR1在单核细胞的所有和NK细胞和T细胞的部分子集被表达， 在 CX 3 CR1 的eGFP /重量小鼠是有趣炎症的Ly6C <区分SUP>高的单核细胞表现出较少的绿色荧光比居民的Ly6C 低的单核细胞6。由于CD115是特定的单核细胞系中，该MacBlue鼠标CD115 CFP是一个有趣的模式。然而，它是无法区分的Ly6C 高和低的Ly6C单核细胞。
一种替代的转基因小鼠的荧光是静脉注射荧光抗体的实时标记的白细胞种群。例如，单核细胞，可以用抗CD115（克隆AFS98），具有抗Ly6G（克隆1A8）嗜中性粒细胞和血小板具有抗CD49b（克隆HMα2）。在一般情况下，所有这些抗体消耗高剂量。因此，它们应谨慎使用为次短的时间内和在较低水平。应当指出的是，即使在低剂量，对细胞功能的影响不能排除。个人经历与少量（1-2微克）能够CD115 +周一的标签ocytes和Ly6G +中性粒细胞无损耗（数据未公布）。
虽然耳真皮脉管系统的模型是非侵入性的耳朵是原封不动，耳真皮的深度是一个问题，这使得它的模型更适合于双光子显微镜13。此外，它是不可能直接刺激在耳朵模型中的容器，而不会干扰身体的制备。
我们的协议可以与任何倒置共聚焦显微镜被应用。由于扫描速度和激光功率取决于计算机，获取在一个单一的z平面的一帧（512×512像素， 即 635微米）的要求与我们的设置尼康A1R的电流计扫描器约为2.2秒。不幸的是，这种低转速限制记录肠系膜静脉的四维电影无质量的损失的可能性。该A1R的共振扫描仪具有很高的采集速度，虽然图像质量大大减少（背景与具体的信号），用于我们的实验与CX 3 CR1 GFP /重量鼠标。应当记住的是，激光设定在低于0.5％的（<0.25毫瓦），以避免光毒性和漂白。
伍德芬等人成功地获得使用Leica TCS-SP5 9提睾肌静脉的4D电影（60 Z堆栈图像40秒）。如20-40微米的直径的作者的图像的值，它们可能的变化，焦点比在我们的模型（监测200-400微米肠系膜静脉的）较不敏感。当成像活组织，聚焦的控制是最重要的问题，这限制记录一个独特电影持续几个小时的可能性。我们认为，拍摄短片时持续30分钟（或45分钟）是最实际的肠系膜模型。
加TLR激动剂的改变容器的宽度和因此的焦点。因此，它是非常困难的图像正确第一10-15分钟刺激后，直到容器稳定。
另一个限制是在实验的持续时间。因为保持鼠标麻醉适当的过长时间的困难，也很难图像多于炎症后4小时。使用其他麻醉剂，如异氟烷连续吸入，可能是一种选择（虽然不是由我们测试）。
在老年小鼠（超过16周龄），血管周围脂肪堆积量增加减少肠系膜血管可视化的质量。因此，最好是运行8-12周龄小鼠实验。
这种技术可以用静脉注射抗体阻断感兴趣的分子或耗尽给予白细胞群，使分子牵涉白细胞募集或行为的重要性可确定进行组合。另外，其它白细胞亚群可以使用表达在感兴趣的细胞群的荧光蛋白质的转基因的其他小鼠品系进行跟踪。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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