Abstract
استجابة مناعية فعالة تعتمد على التعبئة السريعة من الكريات البيض في الدم إلى موقع العدوى أو الإصابة. التحقيق هجرة الكريات البيض في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجزيئي للهجرة الكريات البيض transendothelial والتفاعل مع بطانة الأوعية الدموية. واحد طريقة فعالة ينطوي intravital المجهري على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في خلايا الفائدة.
هنا نقدم بروتوكول للحيدات التصوير والعدلات في 3 CX CR1 GFP / وزن الرابع الماوس حقن العدلات البرتقال المسمى صبغ مع مجهر متحد البؤر مقلوب. تجمع الأفلام مرور الزمن من 30 دقيقة إلى عدة ساعات من التصوير السماح للتحليل سلوك الكريات البيض في الأوردة المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة على حد سواء. نحن أيضا وصف الخطوات للحث محليا الأوعية الدموية التهاب مع TLR2 / TLR1 ناهض Pam3SK4 ورصد subsequeالتوظيف الإقليم الشمالي العدلات وحيدات.
ويمكن أيضا أن تقنية قدم استخدامها لرصد الشعوب الأخرى من الكريات البيض والتحقيق جزيئات المتورطين في تجنيد الكريات البيض أو الاتجار باستخدام المنبهات الأخرى أو الفئران المعدلة وراثيا.
Introduction
العدلات وحيدات هي خلايا الجهاز المناعي الفطري التي تنتشر باستمرار في الدم. على الإصابة أو العدوى، وإشارات التهابات تحفز الكرية البيضاء انسلال إلى الأنسجة التالفة والمصابة، وبدء في هذه الوثيقة استجابة مناعية خلوية 1-3. سرعة تعبئة الكريات البيض تحدد نتيجة إيجابية من الاستجابات المناعية. هذه العمليات معقدة تعتمد على جزيئات محددة (على سبيل المثال، selectins، كيموكينات محددة البطانة) موجودة على البطانة الملتهبة التي تساعد على إقامة اتصالات بين لاصقة تعميم الكريات البيض والبطانة 1-3. لحصول على رؤى على جزيئات المتورطين في الكريات البيض سلسلة التوظيف، من المهم أن تصور حركية تجنيد خلية وتتبع سلوك كل خلية / السكان. ويشمل وسيلة فعالة intravital المجهري على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في خلايا الفائدة.
محتوى "> وحتى الآن، وقد وضعت عدة نهج باستخدام intravital المجهري لصورة الأوعية الدموية 4،5. فعلى سبيل المثال، تم استخدام التصوير من الأدمة الأذن الأوعية الدموية أو الأوردة المساريقي بواسطة المجهر متحد البؤر حيوي داخلي لتحديد السلوك الدوريات من Ly6C الفئران حيدات منخفضة والإنسان CD14 CD16 + حيدات قاتمة على الجانب اللمعية الأوعية الدموية في ظل ظروف مستقرة 6-8. وغالبا ما يستخدم نموذج الأوعية الدموية الماوس المشمرة لرصد سلوك العدلات أو Ly6C التهابات حيدات عالية في ظل الظروف الملتهبة أو الدماغية لدى الفئران المعدلة وراثيا. وفي هذا الحالة، يتم تحفيز المشمرة عن طريق الحقن داخل الصفن من IL1β، CCL2، TNFβ أو fMLP بعد 4/2 ساعة، ثم يتم exteriorized جراحيا الأنسجة وتحليلها من قبل متحد البؤر حيوي داخلي المجهري 11/09.يصف بروتوكول التالية طريقة لمراقبة وحيدات والعدلات في نفس الوقت مع أيمضان مقلوب المجهر متحد البؤر. وعلاوة على ذلك، تفاصيل أسلوبنا كيفية صورة السفينة نفسها قبل (حالة حالة مستقرة) وبعد الالتهاب وكيفية متابعة حركية التوظيف الكريات البيض. لهذا الغرض، ونحن نستخدم CX 3 CR1 GFP / وزن الفأر، الذي أعرب عن EGFP حيدات، والرابع حقن مع المسمى الصبغة البرتقالية العدلات الفئران. باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب، فمن الممكن (1) لمتابعة وتحليل الدوريات Ly6C حيدات منخفضة في ظل ظروف مستقرة و(2) لمتابعة توظيف كل من وحيدات والعدلات في السفينة نفسها بعد التهاب المحلي. نحن هنا تهيئة الظروف التهابات باستخدام ناهض TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. وعلاوة على ذلك، يمكن لمثل هؤلاء التصوير يساعد على تحديد دور جزيئات محددة من الفائدة في مختلف مراحل سلسلة التوظيف الكريات البيض إذا أجريت على الفئران محددة الضربة القاضية، أو في وجود منع الأجسام المضادة 6،9،13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة الأخلاقية المؤسسية رعاية الحيوان في جنيف، سويسرا والمكتب البيطري كانتون: ملاحظة. إذن عدد GE / 63/14.
1. إعداد تعليق خلية واحدة من نخاع العظام
- الماوس التضحية (8-12 اسبوع) خلع عنق الرحم. تعقيم رجليه الخلفيتين مع 70٪ من الإيثانول. إزالة الجلد من رجليه الخلفيتين.
- تشريح خارج عظام الفخذ الماوس وtibias وإزالة الأنسجة من الساقين مع مشرط. شطف الساقين مع 90٪ من الإيثانول ومكان في صحن الثقافة مليئة PBS.
- تحت غطاء محرك السيارة والثقافة، ومنديل نظيف من عظام الفخذ وtibias مع مشرط ومنفصلة في مفصل الركبة. قطع كل نهاية العظام.
- نخاع العظم دافق من كل العظام باستخدام إبرة 23G وحقنة 1 مل مليئة إعداد المتوسطة (الفينول الحمراء الخالية DMEM / F12، 1٪ مصل الفئران)، إلى 50 مل المسمار الأنبوب. تعطيل المجاميع الخلية عن طريق الركض بدقة من خلال شمال شرق 23Gedle وحقنة 1 مل. يصل إجمالي حجم إلى 25 مل مع إعداد المتوسطة.
- الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C. طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1 مل خلايا الدم الحمراء تحلل RBLC العازلة (8.3 ز NH 4 الكلورين، 1 غرام NaHCO 3، 1 مل EDTA (100 ملم)، الكامل إلى 1 L مع الماء المقطر، تصفية 0.22 ميكرون) في 15 مل المسمار الأنبوب. احتضان 30 ثانية على الجليد.
- إضافة 10 مل من إعداد المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C. تجاهل وطاف resuspend في 2 مل إعداد المتوسطة.
2. العدلات إثراء حسب التحديد السلبي
- إضافة 150 ميكرولتر من الفأر كوكتيل تخصيب العدلات (العزلة خلية منصة عدة مثل EasySep). خلط واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 10 مل من الفينول DMEM مجانا الأحمر. عكس مرة واحدة وأجهزة الطرد المركزي 250 x ج، 3 دقائق، 4 ° C.
- طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1.75 مل إعداد المتوسطة في البوليسترين 5 مل جولة أنابيب أسفل. إضافة 250 ميكرولتر بيوفي اختيار كوكتيل. خلط واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- دوامة الجزيئات المغناطيسية (من العزلة خلية منصة طقم) لمدة 30 ثانية ل resuspend الجسيمات. إضافة 500 الجزيئات المغناطيسية ميكرولتر لتعليق الخلية. خلط واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- وضع أنبوب إلى المغناطيس. الانتظار لمدة 3 دقائق.
- عكس المغناطيس على جديد البوليسترين 5 مل جولة أنابيب أسفل لجمع الخلايا غير المسماة المطلوب. لا تأخذ آخر قطرة شنقا في الأنبوب. ستبقى الخلايا غير المرغوبة في أنبوب داخل المغناطيس. تجاهل هذا الأنبوب إلى نفايات بيولوجية.
- وضع أنبوب جديد في المغناطيس. الانتظار لمدة 3 دقائق.
- عكس المغناطيس على جديد 15 مل المسمار أنبوب لجمع الخلايا غير المسماة المطلوب. لا تأخذ آخر قطرة شنقا في الأنبوب.
- مجلد كامل إلى 5 مل مع الفينول الأحمر DMEM مجانا.
3. صفها من العدلات
- إضافة 0.5 ميكرولتر من صبغ برتقالي مثل تعقب خلية البرتقال (تركيز العمل1 ميكرومتر، CMRA - كلورو-RODOL خلات، والأوراق المالية 10 ملم في DMSO). احتضان 2 دقيقة عند 37 ° C.
- إضافة 2.5 مل من إعداد المتوسطة. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C.
- طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1 مل إعداد المتوسطة في أنبوب 1.5 مل.
- اتخاذ قسامة الاعتماد مع الكريات.
- احتضان 5 دقائق عند 37 ° C. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C.
- طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1 مل PBS. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C لغسل.
- طاف تجاهل. بيليه resuspend كما 10X10 6 خلايا لكل 100 ميكرولتر PBS. الحفاظ على الجليد حتى حقن الرابع. ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا الرابع حقن في أسرع وقت ممكن. عادة ما يتم الحصول عليها 6-12x10 6 العدلات / الماوس.
4. إعداد ماوس لحيوي داخلي المجهر
ملاحظة: الخطوة 4.1) و 4.2) يجب أن يتم تنفيذ في بداية التجربة لتجنب وقت الانتظار الممتد من العدلات المسمى على جيمه.
- تزن 3 CX CR1 GFP الماوس (8-12 أسبوع من العمر).
- إعداد 800 ميكرولتر من التخدير (الكيتامين 60 ملغ / كغ، زيلازين 4.5 مغ / كغ، acepromazone 1.75 مغ / كغ في PBS).
- تخدير الماوس. حقن الملكية الفكرية مع 200 ميكرولتر / 20 غرام من الماوس. التخدير سيطرة أخمص القدمين معسر وعن طريق التحقق من معدل التنفس.
- حقن العدلات (10X10 6 الخلايا في 100 ميكرولتر PBS) عن طريق الوريد باستخدام أوردة الذيل الأفقي أو الجيوب الأنفية الرجعية المدارية، في راحة المجرب.
- ضع الماوس على وسادة التدفئة وحماية العينين مع هلام العين.
- يتم وضع ساترة الزجاج (35 مم) في طبق نسيج الثقافة 10 سم، والتي لديها ثقب قطره 30 ملم. استخدام النفط للحفاظ على طبق زراعة الأنسجة في اتصال مع ساترة.
- شق جلد البطن مع مقص لفضح الصفاق. شق الصفاق مع مقص لفضح الأمعاء.
- إضافة 200 ميكرولتر PBS (تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية) في صتجويف eritoneal. خذ الماوس في يدك وتحويل وجهه لأسفل، بحيث يحصل على الأمعاء من التجويف البريتوني مع ضغط لطيف. ضع الماوس في طبق زراعة الأنسجة.
- deroll بلطف الأمعاء مع براعم القطن المعقم على ساترة من أجل فضح الأوعية المساريقي.
- قطع المناديل الورقية في نطاقات والرطب لهم 37 درجة مئوية PBS ساخنة. لشل حركة الأمعاء مع قطعة من المناديل الورقية لتقليل الحركات الناتجة عن التمعج.
- وضع صحن زراعة الأنسجة والماوس داخل غرفة thermostated 37 ° C على حسب الطلب المرحلة علبة من مجهر مقلوب. إدخال حقنة تحتوي على مواد التخدير الشوري في الساق الخلفية. ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، يمكن للماوس تلقي الأكسجين (0.5 لتر / دقيقة) مع قناع.
- الماوس السيطرة للتخدير بواسطة إصبع معسر والتحقق من معدل التنفس كل 30 دقيقة. إذا لزم الأمر، وتقديم دفعة من مواد التخدير (20 ميكرولتر) للحفاظ على التخدير بشكل صحيح. ليسE: يجب تجنب تجفيف الأوعية الدموية. لذلك، يتم الحفاظ على الرطوبة عن طريق التبول بانتظام المناديل الورقية المستخدمة لشل حركة الأمعاء مع 37 ° C درجة حرارة PBS.
5. قياس العدلات والوحيدات السلوك في سفن الملتهبة في فيفو باستخدام الميكروسكوب حيوي داخلي
- تعيين الليزر ل488- 561- وبأقل القوة اللازمة لتجنب الضيائية التي يسببها الليزر. في تجاربنا، فمن أقل من 0.5٪. كثافة GFP في حيدات وصبغ برتقالي في العدلات هو مشرق بحيث عادة 0.3٪ بما فيه الكفاية. ملاحظة: هذا يمثل قوة الليزر من 0،15-0،25 ميغاواط مع نظامنا.
- الحصول على صور من 512 X 512 بكسل (أي 635 ميكرون) في 2.2 ثانية مع الثقب المفتوح باستخدام الهدف 20X الجاف للمجهر مقلوب. استخدام متعمقة ض بين 10-20 ميكرون، التي تضمن إشارة كافية مع القوى الليزر منخفضة.
ملاحظة: نحن عادة إجراء تجارب مع متعمقة ض بين 12-1656؛ م. في حالة الأرقام والأفلام المقدمة، ض عمق 20 ميكرون. الطوري يسمح بتحديد الجدران البطانية ويتم تنفيذ التصوير في عروق المساريقي. منذ خلايا تقوم بدوريات تتحرك ببطء شديد مع سرعة 10/05 ميكرون / دقيقة 6، مسجلا مجال اهتمام كل 20 ثانية مرضية. مع الإعدادات وصفها، في مرحلة الآلية تسمح للتسجيل ما يصل إلى 7 مجالات الاهتمام في نفس الوقت. - ضع الماوس والأوعية المساريقي في غرفة ترموستات المجهر يتم السماح لهم للتعافي من إعداد لمدة 30 دقيقة قبل الحصول على أول فيلم. خلال هذا الوقت، واختيار العديد من المجالات ذات الاهتمام. التركيز على سطح اللمعية السفينة الأقرب إلى الهدف. إذا لزم الأمر، والاستفادة من طفيف لصناعة السيارات في مضان من البطانة لتعيين التركيز.
ملاحظة: جراحة خلال إعداد الماوس يؤكد قليلا البطانة. ونتيجة لذلك، المتداول العدلات وويمكن ملاحظة / أو وحيدات في أول 15 دقيقة بعد إعداد الماوس. - تسجيل أول فيلم لمدة 30 دقيقة في ظل ظروف مستقرة وصورة واحدة كل 20 ثانية.
ملاحظة: البرنامج يكتسب كل مجال من مجالات الاهتمام في 2.2 ثانية ومرحلة الآلية تنتقل تلقائيا من حقل واحد إلى آخر. انه يعود الى المركز الأول في غضون 20 ثانية خلال 30 دقيقة من الفيلم تسجيل. - لبدء الأوعية الدموية التهاب، إضافة قطرة من 20 ميكرولتر من PBS تحتوي على 100 ميكروغرام من TLR2 / TLR1 ناهض Pam3CSK4 12 مباشرة على الأوعية تصويرها.
- السيطرة على التركيز في كل مجال الفائدة.
ملاحظة: خلال الاكتساب، هناك دائما تغييرات طفيفة في التركيز على محور ض. وعلى الرغم من 10-20 ميكرون ض متعمقة، وهذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في كثافة مضان. وبالتالي، إعادة تركيز يدويا في كل مجال الفائدة في نهاية كل فيلم، إذا لزم الأمر. تسجيل الأفلام لمدة 30 دقيقة الفترات وتصل إلى 3 ساعات لالتل بعد بدء الالتهاب. - في نهاية التجربة، التضحية الماوس تخدير قبل خلع عنق الرحم.
6. الجيل من ملفات الأفلام وتتبع من الكريات البيضاء
ملاحظة: برنامج الحصول على نيكون يولد .nd2 الملفات ولكن سيكون الإجراء التالي تكون مشابهة مع البرامج وغيرها من العلامات التجارية.
- ملفات التصدير، سلسلة شجار.
- الذهاب إلى يماغيج البرمجيات (http://rsb.info.nih.gov/ij/). استيراد سلسلة شجار. كل قناة كملف مختلفة.
- تطبيق عامل تصفية المتوسط مع دائرة نصف قطرها 2.0 بيكسل للقنوات خضراء وحمراء للحد من الضوضاء الخلفية (عملية> مرشحات> الوسيط ...).
- تحويل الملفات إلى ثنائي (عملية> ثنائي> تقديم ثنائي). تمكين البرنامج لحساب عتبة لكل صورة.
- دمج القنوات في سلسلة صورة واحدة (صورة> اللون> القنوات دمج ...). حدد حيدات في الجشعن القناة، والعدلات في القناة الحمراء والضوء النافذ في قناة الرمادية.
- تحويل الصور مكدسة إلى ألوان RGB (صورة> اللون> كومة إلى RGB).
- حفظ الملف كما افي
- يتم استيراد البيانات وتجميعها في Imaris البرمجيات (Bitplane). ثم يتم تعقب تحركات حيدات والعدلات باستخدام معالج تتبع بقعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف المخطوطة بروتوكول الأمثل لمراقبة بسهولة سلوك حيدات والعدلات في عروق المساريقي الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي. استخدام الغرفة 37 درجة مئوية thermostated هو إلزامي للحفاظ على درجة حرارة الماوس، وكذلك نتيجة لحركة تعتمد درجة حرارة من الكريات البيض. يتم عرض إعداد الماوس في الشكل 1. الشكل 2 يوضح كل منطقة المشاهدة تحت المجهر. الضوء المرسل يسمح بتحديد الأوردة المساريقي (السهم الأحمر) والشرايين (السهم الأزرق).
معالجة الصور المكتسبة مع يماغيج البرمجيات إنشاء ملفات الفيلم، مثل فيلم (1) وفيلم 2 الشكل 3 يعرض الخطوات المختلفة لمعالجة الصور لنقطة لأول مرة من فيلم 1. ويظهر الفيلم 1 الدوريات من Ly6C حيدات منخفضة في ظل ظروف مستقرة كما نزع سابقامكتوب 6،8،14 في حين أن جميع العدلات تدور في مجرى الدم. لا العدلة وتقوم بدوريات في جدار البطانية. فيلم 2 يظهر نفس المجال من الفائدة 90 دقيقة بعد إضافة TLR2 / TLR1 ناهض Pam3CSK4 لبدء محليا الالتهاب. في هذه الحالة، يتم تجنيد العدلات وحيدات على نطاق واسع إلى جدار البطانية، التي تفحص بدقة. ومن المهم أن نلاحظ أن إضافة ناهض TLR يؤدي الى تغييرات في عرض البطانة ويغير محور محور Z بالتالي. ولذلك، يجب التحكم التركيز بعناية بعد إضافة ناهض. تجميع البيانات في Imaris البرمجيات (Bitplane) يسمح للتتبع من الكريات البيض الفردية باستخدام معالج تتبع بقعة الشكل 4 يوضح مسارات المسار الدقيق للحيدات (الخضراء) والعدلات (الحمراء) التي تقوم بدوريات على طول البطانة. ويتم الحصول على البيانات من تحليل الفيلم 2، أي 90 دقيقة بعد بدء الوقود النووي المشعlammation. تتبع مسارات الكريات البيض يمكن تصديرها كملفات شجار أو ملفات XLS إلى الحصول على إحصاءات مختلفة مثل طول المسار، والتشريد، والمدة أو السرعة.
هذه التقنية توفر طريقة لطيفة لمراقبة سلوك حيدات والعدلات في نفس الوقت قبل وبعد الالتهاب. فمن الممكن أن تتبع توظيف هذه الخلايا على الجدار الإضافي البطانية. فقدان التركيز على المحور Z أو حتى س / ص النزوح يمكن أن تحدث نتيجة لحركات الأمعاء التي تدمر التجربة. الفيلم 3 يوضح هذا النوع من التحضير الفاشلة والاستحواذ.
الشكل 1. إعداد ماوس.
السهام السوداء تشير إلى الأنسجة PBS مبلل تستخدم لشل حركة الأمعاء. رأس السهم الأبيض يشير إلى صحن الثقافة 10CM الأنسجة. T يدل على الألومنيوم حسب الطلب المرحلة علبة التي تناسبها في المجهر. المساريقي تتعرض الأوعية الدموية بشكل جيد في المركز على ساترة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الفروع من الأوردة والشرايين المساريقي.
ومخيط صور (20 × 10) التي اتخذت مع الهدف 10X لتشكل صورة واحدة كبيرة من المساحة المتاحة. ثم يتم اختيار العديد من المجالات التي تهم مراقبة حركة الكريات البيض مع الهدف 20X. السهم الأحمر يشير إلى الوريد المساريقي. السهم الأزرق يشير إلى الشريان المساريقي. السهم الأخضر يشير إلى الأنسجة الدهنية المحيطة السفن. في منطقة مظلمة على جانبي نتائج الصورة من وجود نسيج مبلل تستخدم لشل حركة الأمعاء. يمثل شريط النطاق الأبيض 1 مم.ك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. معالجة الصور مع يماغيج.
ويوضح الخطوات المختلفة لمعالجة الصور عن الصورة الأولى من فيلم 1. الأخضر (حيدات) والأحمر (العدلات) قنوات يتم معالجتها بشكل منفصل. للبيانات الخام الأصلية (A)، يتم تطبيق مرشح الوسط (B) ومن ثم تحويلها إلى صورة ثنائية (C). يتم دمج (D) القنوات إلى الصورة النهائية. خطوط خضراء أو حمراء لوحظ في البيانات الخام هي الخلايا التي تتحرك بسرعة بحيث المجهر ليست قادرة على اكتساب بالكامل لهم. يمثل شريط النطاق الأبيض 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. الفردية مسارات الكريات البيض.
تتم معالجة مسارات حيدات (A) والعدلات (B) التي تقوم بدوريات في البطانة مع Imaris البرمجيات (Bitplane). يمثل شريط النطاق الأبيض 40 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1. الكريات البيضاء مسح الجدار البطانية في حالة مستقرة. وفي حالة مستقرة، Ly6C حيدات منخفضة بدوريات في البطانة. العدلات تنتشر وفقا لتدفق الدم. العدلات باللون الأحمر وحيدات هي باللون الأخضر. يمثل مقياس شريط 50 ميكرون. ولدت مع الهدف 20X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.
جنرال الكتريك = "دائما"> 
2: الكريات البيضاء مسح الجدار البطانية بعد التهاب TLR2 بوساطة حقل نفس الاهتمام كما هو الحال في فيلم 1. يبدأ الفيلم 90 دقيقة بعد إضافة 20 ميكرولتر من PBS تحتوي على 100 ميكروغرام من Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 ناهض) مباشرة على السفينة. حيدات تجنيد والعدلات والمسح بدقة الجدار البطانية. العدلات باللون الأحمر وحيدات هي باللون الأخضر. يمثل مقياس شريط 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.
فيلم 3: النتائج التي تم الحصول عليها من إعداد الماوس غير صحيح حركات السفن التي تم الحصول عليها عندما التخدير أو تجميد الأمعاء غير صحيحة. يمثل مقياس شريط 50 ميكرون.و = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المنهجيات وصفها في هذه المخطوطة توفر نهجا ثابتا لدراسة الوحيدات والسلوك العدلة بكفاءة في عروق المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة.
الخطوة الحاسمة لإعداد هو الشلل في الأمعاء مع الأنسجة PBS المبللة. إذا أجريت بشكل صحيح، تتعرض الأوعية المساريقي لطيف على ساترة عن الحصول على الصور. وهذا يتيح اختيار العديد من المجالات التي تهم مراقبة سلوك الكريات البيض في الأوردة المساريقي.
بروتوكول لدينا ينطوي على أمور ظاهرية الأوعية المساريقي قبل بدء التجارب، وتمكين (1) للحث مباشرة التهاب في الأوعية رصدها، و (2) لتسجيل نقاط زمنية مبكرة بعد التحفيز و (3) لمتابعة حركية تجنيد الكريات البيض وسلوكهم في السفينة نفسها قبل وبعد تحريض من الالتهابات.
نحن transfإيه طهروا العدلات من نخاع عظام الفئران من الخلفية الجينية نفسها وليس من الدم والمزيد من الخلايا يمكن الحصول على حيوان الواحد (6-12x10 6 مقابل 0.5-2x10 6 / الماوس). إذا ويفضل استخدام العدلات الدم، نفس البروتوكول يمكن القيام بها لتنقية الخلايا.
في مجال التصوير حيوي داخلي، يتم تمكين التصور من الأوعية الدموية التي كتبها ضوء تنتقل في حالة الأوعية المساريقي. بدلا من ذلك، يمكن أن الأجسام المضادة الفلورسنت ضد PECAM1 (استنساخ 390) أو الفلورسنت الجزيئي عالية ديكستران الوزن (70kDa أو 2 MDA) 6،14 يكون الرابع حقن للكشف عن الأوعية الدموية. على سبيل المثال، أفيد حقن داخل الصفن من 3 ميكروغرام المضادة للPECAM1 (استنساخ 390) لتمكين الكشف عن الأوعية الدموية مع خلفية منخفضة وعدم يؤثر على نشاط الكريات البيض في نموذج المشمرة 9. بالمقارنة مع الضوء المرسل، واستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت أو الأصباغ يدخل أبرزها إمكانية إعادة الإعمار 3D من vasculature، ولكن التضحية قناة لوضع العلامات، ويتم زيادة اكتساب الوقت. الضوء النافذ كافية في النموذج mesenter بفضل الشفافية في الأوعية الدموية، كما هو موضح هنا. على العكس من ذلك، وضع العلامات الفلورية من الأوعية الدموية إلزامي في الأدمة الأذن أو أجهزة مبهمة.
لا يمكن أن يتحقق الكشف السكان من الكريات البيض باستخدام الحيوانات المعدلة وراثيا التي تظهر مضان الذاتية في أنواع معينة من الخلايا (وحيدات معادل 3 CR1 EGFP / وزن 6 أو cd115 CFP 15 أو cd68 GFP 16؛ وحيدات والعدلات اليس EGFP 9؛ والصفائح الدموية cd41 YFP 17) . على الرغم من أن يتم التعبير عن CX3CR1 في جميع حيدات وبعض مجموعات فرعية من الخلايا القاتلة الطبيعية وT، ومعادل 3 CR1 EGFP / وزن الماوس المثير للاهتمام أن نميز بين التهاب Ly6C <سوب> حيدات العالية التي تظهر أقل مضان GFP من Ly6C المقيمين حيدات منخفضة 6. كما CD115 غير محدد من خط الوحيدات، وMacBlue الماوس cd115 CFP هو نموذج مثير للاهتمام. ومع ذلك فإنه ليس من الممكن التمييز بين Ly6C عالية وLy6C حيدات منخفضة.
بديل على الفئران المعدلة وراثيا الفلورسنت هو حقن الرابع من الأجسام المضادة الفلورسنت لتسمية السكان من الكريات البيض في الوقت الحقيقي. على سبيل المثال، وحيدات يمكن أن توصف مع مكافحة CD115 (استنساخ AFS98)، العدلات مع مكافحة Ly6G (استنساخ 1A8) والصفائح الدموية مع anti-CD49b (استنساخ HMα2). بشكل عام، كل هذه الأجسام المضادة تستنزف في الجرعات العالية. ولذلك، ينبغي استخدامها بحذر لفترة قصيرة من الزمن وعلى مستويات منخفضة. وتجدر الإشارة إلى أنه حتى في جرعة منخفضة، لا يمكن استبعاد تأثير على وظيفة خلايا بها. تجربة شخصية مع كميات منخفضة (1-2 ميكروغرام) تمكن من وضع العلامات CD115 + مونocytes والعدلات Ly6G + دون استنزاف (بيانات غير منشورة).
على الرغم من أن نموذج الأوعية الدموية الأدمة الأذن هو غير الغازية مثل الأذن هي لم تمس، وعمق الأدمة الأذن هو مصدر قلق، مما يجعلها نموذجا أكثر ملاءمة ل2 الفوتون المجهري 13. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس من الممكن لتحفيز مباشرة السفينة في نموذج الأذن من دون إزعاج جسديا التحضير.
بروتوكول لدينا يمكن تطبيقها مع أي المجهر متحد البؤر مقلوب. منذ سرعة المسح الضوئي والليزر السلطة هي التي تعتمد على الآلة، والحصول على إطار واحد (512 X 512 بكسل، أي 635 ميكرون) في واحدة ض الطائرة يتطلب ما يقرب من 2.2 ثانية مع إعدادات لدينا للماسح GALVANO من نيكون A1R. للأسف، هذه السرعة المنخفضة تحد من إمكانية تسجيل الأفلام رباعية الأبعاد من الأوردة المساريقي دون فقدان الجودة. الماسح الضوئي الرنين للA1R يوفر سرعة عالية الاستحواذ، على الرغم من أنيتم خفض جودة الصور بقوة (الخلفية مقابل إشارة معينة) لتجاربنا مع CX 3 CR1 GFP / وزن الماوس. يجب أن يوضع في الاعتبار أن يتم تعيين الليزر في أقل من 0.5٪ (<0.25 ميغاواط) لتجنب الضيائية والتبييض.
تمكنت Woodfin آخرون للحصول على الأفلام في 4D (صور 60 ض المكدس في 40 ثانية) من الأوردة المشمرة باستخدام ايكا TCS-SP5 9. كما واضعي قيم الصورة من 20-40 ميكرون في القطر، وأنها ربما أقل حساسية للتغيرات في التركيز مما كانت عليه في نموذجنا (رصد الأوردة المساريقي من 200-400 ميكرون). عند التصوير الأنسجة الحية، والسيطرة على التركيز هو الشاغل الأهم من ذلك، مما يحد من إمكانية لتسجيل فيلم فريد من نوعه تستغرق عدة ساعات. ونحن نعتبر أن تسجيل الأفلام 30 دقيقة (أو 45 دقيقة) الدائم هو الأكثر عملية في نموذج المساريقي.
إضافة منبهات TLR يغير عرض السفينة، وبالتالي فإن التركيز. بناء على ذلك،فمن الصعب جدا أن الصورة بشكل صحيح أول دقيقة 10-15 بعد التحفيز حتى تستقر السفن.
قيود أخرى هي مدة التجربة. بسبب صعوبة للحفاظ على الماوس تخدير بشكل صحيح على مدى فترة طويلة من الزمن، فمن الصعب أن الصورة أكثر من 4 ساعات بعد الالتهاب. استخدام المسكنات الأخرى، مثل استنشاق الأيزوفلورين مستمر، قد يكون خيارا (على الرغم من عدم اختباره من قبلنا).
في الفئران من العمر (أكثر من 16 أسبوعا من العمر)، زيادة كمية رواسب الدهون حول الأوعية يقلل من جودة التصور الأوعية المساريقي. ولذلك، فمن الأفضل لتشغيل تجارب على الفئران القديمة أسابيع 8-12.
هذه التقنية يمكن الجمع بين الحقن الرابع من الأجسام المضادة لمنع الجزيئات من الفائدة أو تستنفد السكان الكريات البيض معينة، بحيث يمكن تحديد أهمية جزيئات المتورطين في تجنيد الكريات البيض أو السلوك. بالإضافة إلى ذلك،يمكن تتبع مجموعات فرعية الكريات البيض الأخرى التي تستخدم غيرها من سلالات الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في السكان خلية من الفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
