Abstract
Resposta imunitária eficaz é dependente rápida mobilização de leucócitos do sangue para o local da infecção ou lesão. Investigar a migração de leucócitos in vivo é essencial para compreender a base molecular da migração transendotelial de leucócitos e a interacção com o endotélio vascular. Uma poderosa abordagem envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse.
Aqui apresentamos um protocolo para monócitos de imagem e neutrófilos no CX 3 CR1 gfp / p iv rato injetado com neutrófilos marcados com corante laranja com um microscópio confocal invertido. Filmes de lapso de tempo recolhidas a partir de 30 minutos a várias horas de imagens permitem a análise do comportamento de leucócitos nas veias mesentérica em ambas as condições estaduais e inflamatórias estáveis. Nós também descrevem os passos para induzir localmente inflamação dos vasos sanguíneos com TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 e monitorar o subsequeNT recrutamento de neutrófilos e monócitos.
A técnica apresentada pode também ser utilizado para monitorizar outras populações de leucócitos e as moléculas implicadas na investigar o recrutamento de leucócitos ou o tráfico que utilizam outros estímulos ou ratinhos transgénicos.
Introduction
Os neutrófilos e os monócitos são células do sistema imune inato que continuamente circulam no sangue. Após a lesão ou infecção, os sinais inflamatórios induzir diapedese de leucócitos em tecidos danificados e infectadas, aqui iniciar uma resposta imune celular 1-3. A rapidez da mobilização de leucócitos determina o resultado positivo das respostas imunes. Estes processos intrincados contar com moléculas específicas (por exemplo, selectinas, quimiocinas vinculado do endotélio) presentes no endotélio inflamado que ajudam para o estabelecimento de contactos adesivas entre leucócitos circulantes e do endotélio 1-3 .Para obter insights sobre as moléculas implicadas na leucócitos recrutamento cascata, é importante para visualizar a cinética do recrutamento de células e para controlar o comportamento de cada célula / população. Um método eficaz envolve microscopia intravital em ratinhos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse.
conteúdo "> Até à data, várias abordagens utilizando microscopia intravital foram desenvolvidos para a imagem da vasculatura 4,5. Por exemplo, a imagem latente da derme ou veias da orelha vasculatura mesentéricos por microscopia confocal intravital foi usada para identificar o comportamento de patrulha Ly6C murino e humano monócitos baixos CD14 dim CD16 + monócitos no lado luminal dos vasos sanguíneos sob condições de estado estacionário 6-8. O modelo de vasculatura do mouse cremaster é muitas vezes usado para monitorar o comportamento dos neutrófilos ou monócitos Ly6C inflamatória elevadas em condições inflamatórias ou isquêmicas em ratinhos transgénicos. Nesse caso, cremaster é estimulada através de injecção intrascrotal de IL1β, CCL2, TNFp ou fMLP. Depois de 4/2 hora, os tecidos são então exteriorizado e analisados por microscopia confocal intravital 9-11 cirurgicamente.O protocolo seguinte descreve um método para monitorizar monócitos e neutrófilos, ao mesmo tempo com qualquerinvertido de fluorescência confocal. Além disso, o nosso método fornece detalhes sobre como imagem do mesmo navio antes (condição de estado estacionário) e, após a inflamação e como seguir a cinética do recrutamento de leucócitos. Para este fim, usamos o CX 3 CR1 rato gfp / peso, cujo monócitos expressam eGFP, iv injetado com uma laranja neutrófilos murino marcadas com corante. Utilizando um microscópio invertido confocal, é possível (1) para monitorizar e analisar os monócitos patrulha Ly6C baixas sob condições de estado estacionário e (2) para seguir o recrutamento de monócitos e neutrófilos no mesmo vaso, após a inflamação local. Aqui nós criamos as condições inflamatórias usando o agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Além disso, tal imagem pode ajudar a determinar o papel de moléculas específicas de interesse nos vários passos da cascata de recrutamento de leucócitos se realizada em ratinhos knock-out específicas ou na presença de anticorpos bloqueadores 6,9,13.
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Protocol
NOTA: os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética Institucional Animal Care, em Genebra, Suíça e Veterinário Cantonal. Número de autorização GE / 63/14.
1. Preparação de uma suspensão de células isoladas a partir da medula
- Sacrifício rato (8-12 semanas de idade) por deslocamento cervical. Esterilizar patas traseiras com etanol 70%. Retire a pele das pernas traseiras.
- Dissecar fêmures e tíbias do mouse e remover o tecido de pernas com um bisturi. Lavar os pés com etanol 90% e coloque em um prato de cultura cheio com PBS.
- Sob o capô cultura, tecido limpo de o fémur ea tíbia, com um bisturi e separada na articulação do joelho. Cortar cada extremidade dos ossos.
- Lavar medula óssea a partir de cada osso, utilizando uma agulha de 23G e uma seringa de 1 ml cheio com meio de preparação (sem vermelho de fenol DMEM / F12, 1% de soro de rato), para um tubo de 50 ml de parafuso. Disrupt agregados celulares por delicadamente passaging através do ne 23Gedle e uma seringa de 1 ml. Levar o volume total a 25 ml com meio de preparação.
- Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C. Sobrenadante de descarte. Pelete ressuspender em 1 ml de glóbulos vermelhos de tampão de lise RBLC (8,3 g de NH 4 Cl, 1 g de NaHCO 3, 1 ml de EDTA (100 mM), completar para 1 L com água destilada, filtro de 0,22 um) em uma de 15 ml de parafuso tubo. Incubar 30 segundos em gelo.
- Adicionar 10 ml de meio e centrifuga-se a preparação de 250 x g, 5 min, 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de meio de preparação.
2. Neutrófilos Enriquecimento por selecção negativa
- Adicionar 150 mL de Rato neutrófilos enriquecimento cocktail (kit plataforma de isolamento de células, tais como EasySep). Misturar e incubar em gelo durante 10 min.
- Adicionar 10 ml de fenol vermelho DMEM livre. Inverter e centrifugar uma vez a 250 x g, 3 minutos, 4 ° C.
- Sobrenadante de descarte. Pellet ressuspender em 1,75 ml de meio de preparação em 5 ml de poliestireno rodada tubos de fundo. Adicionar 250 ul BiotCocktail na Seleção. Misturar e incubar em gelo durante 10 min.
- Vortex as partículas magnéticas (do kit de isolamento de células de plataforma) durante 30 segundos para ressuspender as partículas. Adicionar 500 ul de partículas magnéticas a suspensão de células. Misturar e incubar em gelo durante 10 min.
- Colocar o tubo em o íman. Espere 3 min.
- Inverter o ímã em um novo 5 ml de poliestireno rodada tubos de fundo para recolher as células não marcadas desejados. Não tome a última gota pendurada no tubo. As células indesejadas permanecerá no tubo dentro do magneto. Descarte este tubo em um resíduos de risco biológico.
- Coloque o novo tubo no ímã. Espere 3 min.
- Inverter o ímã para um novo 15 ml parafuso tubo para recolher as células não marcadas desejados. Não tome a última gota pendurada no tubo.
- Volume completo até 5 ml com DMEM sem fenol vermelho.
3. Marcação de Neutrófilos
- Adicionar 0,5 mL de um corante laranja, tais como celular Rastreador Orange (concentração de trabalho1 �, CMRA - clorometil- rodol-acetato, estoque 10 mM em DMSO). Incubar 2 min a 37 ° C.
- Adicionar 2,5 ml de meio de preparação. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Sobrenadante de descarte. Pelete Ressuspender em 1 ml de meio de preparação em um tubo de 1,5 ml.
- Tomar uma alíquota de contar com hematocytometer.
- Incubar 5 min a 37 ° C. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Sobrenadante de descarte. Ressuspender o sedimento em 1 ml de PBS. Centrifugar a 250 xg, 5 min, 4 ° C para lavar.
- Sobrenadante de descarte. Ressuspender o granulado como 10x10 6 células por 100 ul de PBS. Manter em gelo até injeção iv. NOTA: as células têm de ser injectados iv tão rapidamente quanto possível. 6-12x10 6 neutrófilos / rato são normalmente obtidos.
4. Rato Preparação para Microscopia intravital
NOTA:.. Etapa 4.1) e 4.2) deve ser realizada no início da experiência para evitar tempo de espera prolongado de neutrófilos marcados na ICe.
- Pesar o CX 3 CR1 rato gfp (8-12 semanas de idade).
- Preparar 800 ul de anestésicos (cetamina 60 mg / kg, xilazina 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg em PBS).
- Anestesiar mouse. Ip injeção com 200 mL / 20 g de rato. Anestesia controle por toe beliscar e verificando a freqüência respiratória.
- Injectar neutrófilos (10x10 6 células em 100 ul de PBS) por via intravenosa na veia da cauda usando laterais ou do seio retro-orbital, para a conveniência do experimentador.
- Coloque o mouse sobre almofada de aquecimento e proteger os olhos com gel ocular.
- Uma lamela de vidro (35 mm de diâmetro) é colocado em cerca de 10 cm prato de cultura de tecido, que tem um orifício de diâmetro de 30 mm. O uso de óleo é o de manter a placa de cultura de tecido em contacto com a lamela.
- Inciso pele abdominal com uma tesoura para expor o peritônio. Inciso peritônio com uma tesoura para expor intestino.
- Adicionar 200 ul de PBS (pré-aquecida a 37 ° C) para a pcavidade eritoneal. Leve o mouse na mão e transformá-lo virado para baixo, de modo que o intestino fica fora da cavidade peritoneal com uma pressão suave. Posicione o mouse na placa de cultura de tecidos.
- Gentilmente deroll intestino com cotonetes esterilizados para a lamela, a fim de expor os vasos mesentéricos.
- Corte lenços de papel em bandas e os molhe com 37 ° C aquecida PBS. Imobilizar o intestino com os pedaços de tecidos de papel para reduzir os movimentos resultantes do peristaltismo.
- Coloque o prato de cultura de tecidos e o rato dentro da câmara termostatizada 37 ° C para o palco bandeja feito por encomenda do microscópio invertido. Introduzir uma seringa contendo anestésicos sc na pata traseira. NOTA: Para além disso, o rato pode receber oxigénio (0,5 L / min) com uma máscara.
- Controle do mouse para anestesia por beliscar dedo do pé e verificar a freqüência respiratória a cada 30 min. Se necessário, fornecer um impulso de anestésicos (20 l) para manter adequadamente anestesia. NÃOE: A secagem da vasculatura deve ser evitada. Por isso, a sua humidade é mantida por molhagem regularmente os lenços de papel usados para imobilizar o intestino com 37 ° C aqueceu-PBS.
5. Medição de neutrófilos e monócitos Comportamento no Vessels inflamadas in vivo utilizando Microscopia intravital
- Definir lasers para 488- 561- e com o menor poder necessário para evitar fototoxicidade induzida por laser. Nas nossas experiências, é inferior a 0,5%. Intensidade da GFP em monócitos e corante laranja em neutrófilos é tão brilhante que geralmente 0,3% é suficiente. NOTA: Isto representa uma potência de laser de 0,15-0,25 mW com o nosso sistema.
- Adquirir imagens de 512 x 512 pixels (ou seja, 635 um) em 2,2 segundos com uma pinhole aberto usando o 20X objetivo seco do microscópio invertido. Usar uma profundidade Z entre 10 e 20 um, que garante um sinal suficientemente com as baixas potências de laser.
NOTA: Nós geralmente realizar experimentos com um z-profundidade entre 12 a 1656; m. No caso de filmes e figuras apresentadas, a profundidade Z é de 20 uM. O contraste de fase permite a identificação de paredes endoteliais e formação de imagens é executada no mesentério. Dado que as células de patrulha em se movem lentamente com uma velocidade de 5-10 uM / min 6, a gravação de um campo de interesse cada 20 segundos é satisfatória. Com as configurações descritas, o estágio motorizado permite a gravação de até 7 campos de interesse, ao mesmo tempo. - Colocar o rato e os vasos mesentéricos termostato na câmara do microscópio são lhes permitir recuperar a partir da preparação durante 30 minutos antes da aquisição do primeiro filme. Durante este tempo, escolher vários domínios de interesse. Concentre-se na superfície luminal do vaso para o objectivo mais próximo. Se necessário, aproveitar o ligeiro auto-fluorescência do endotélio para ajustar o foco.
NOTA: A cirurgia durante a preparação do mouse ligeiramente salienta o endotélio. Consequentemente, rolando de neutrófilos e/ ou monócitos pode ser observado na primeira a seguir à preparação de 15 min rato. - Grave um primeiro filme durante 30 minutos sob condições de estado estacionário, uma imagem a cada 20 segundos.
NOTA: O software adquire cada campo de interesse em 2.2 segundos e o estágio motorizado move-se automaticamente de um campo para o outro. Ele vai voltar para a primeira posição no prazo de 20 segundos, durante os 30 minutos do filme gravação. - Para iniciar a inflamação dos vasos sanguíneos, adicionar uma gota de 20 ul de PBS contendo 100 ug de TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 12 directamente sobre os vasos trabalhada.
- Controlar o foco para cada área de interesse.
NOTA: Durante o curso de aquisição, há sempre pequenas alterações de concentração no eixo z. Apesar do 10-20 jiM z profundidade, isto pode resultar num decréscimo da intensidade de fluorescência. Portanto, reorientar manualmente cada campo de juros no final de cada filme, se necessário. Grave filmes durante 30 min-períodos e até 3 horas paraTal após o início da inflamação. - No final da experiência, o sacrifício do rato anestesiado por deslocamento cervical.
6. Geração de arquivos de filme e Rastreamento de leucócitos
NOTA: O software de aquisição Nikon gera .nd2 arquivos, mas o procedimento a seguir seria semelhante com outros softwares e marcas.
- Ficheiros de exportação como a série de tiff.
- Ir para software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importar a série de tiff. Cada canal como um arquivo diferente.
- Aplicar um filtro mediano com um raio de 2,0 pixel para os canais verde e vermelho para reduzir o ruído de fundo (Processo> Filtros> medianos ...).
- Converta arquivos em binário (Processo> binário> Faça binário). Para ativar o software para calcular o limite para cada imagem.
- Mesclar canais em uma série de imagens (Imagem> Cor> Mesclar Canais ...). Selecione os monócitos no green canal, os neutrófilos no canal vermelho e da luz transmitida no canal cinza.
- Converta imagens empilhados em cores RGB (Imagem> Cor> pilha para RGB).
- Salve o arquivo como .avi
- Os dados são importados e compilado no software Imaris (Bitplane). Movimentos de monócitos e neutrófilos são, então, rastreados usando o Assistente de Rastreamento Spot.
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Representative Results
O manuscrito descreve um protocolo optimizado para controlar facilmente o comportamento dos monócitos e neutrófilos no mesentério de ratos anestesiados em tempo real. A utilização de uma câmara de 37 ° C-termostatizada é obrigatório para manter a temperatura do rato e também devido à temperatura de movimento dependentes dos leucócitos. Preparação do rato é apresentada na Figura 1. A Figura 2 mostra toda a área visto ao microscópio. Luz transmitida permite a identificação das veias mesentérica (seta vermelha) e artérias (seta azul).
Tratamento de imagens adquiridas com arquivos de filme ImageJ software gerado, como Filme 1 e Filme 2. Figura 3 mostra as diferentes etapas de processamento de imagem para o primeiro ponto de tempo de filme 1. Filme 1 mostra o patrulhamento de Ly6C baixos monócitos em condições de estado estacionário , conforme anteriormente descrito 6,8,14 Considerando que todos os neutrófilos estão circulando na corrente sanguínea. Não é de neutrófilos que patrulha parede endotelial. Filme 2 mostra a mesma área de interesse 90 min após a adição do TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 localmente iniciam a inflamação. Neste caso, os neutrófilos e os monócitos recrutados são massivamente para a parede endotelial, que se digitalizar meticulosamente. É importante notar que a adição de um agonista dos TLR induz mudanças na largura e, consequentemente, altera endotélio o foco do eixo z. Portanto, o foco deve ser cuidadosamente controlada, após a adição do agonista. Compilação de dados em software Imaris (Bitplane) permite o acompanhamento de leucócitos individuais usando o Assistente de Rastreamento Spot. A Figura 4 mostra os caminhos de trilha exatas de monócitos (verde) e neutrófilos (vermelho) que patrulhavam ao longo do endotélio. Os dados são obtidos a partir da análise de Filme 2, isto é, 90 minutos após o início da inflammation. Rastreamento de caminhos de leucócitos podem ser exportados como arquivos TIFF ou arquivos XLS para obter várias estatísticas tais como comprimento da pista, o deslocamento, a duração ou a velocidade.
Esta técnica oferece uma boa maneira de monitorar o comportamento dos monócitos e neutrófilos, ao mesmo tempo, antes e após a inflamação. É possível acompanhar o recrutamento dessas células no overtime parede endotelial. Perda de foco no eixo z ou mesmo x / y deslocamento pode ocorrer como conseqüência dos movimentos intestinais que estragam o experimento. Filme 3 ilustra tal preparação falhou e aquisição.
Figura 1. rato preparação.
Setas pretas indicam tecido PBS-humedecido usado para imobilizar o intestino. Seta branca indica o 10 centímetros de cultura de tecidos prato. T indica o estágio de bandeja feita sob encomenda de alumínio que se encaixa no microscópio. Mesentérica vasos sanguíneos são bem exposta no centro da lamela. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. As sucursais das veias e artérias mesentéricas.
Imagens (20 x 10) tiradas com uma objectiva 10X foram costurados para constituir uma grande imagem da área disponível. Vários campos de interesse são escolhidos para controlar o movimento de leucócitos com um objetivo 20X. A seta vermelha indica uma veia mesentérica. A seta azul indica uma artéria mesentérica. A seta verde indica que o tecido adiposo em torno dos vasos. A área escura sobre os lados dos resultados de imagem da presença de tecido humedecido usado para imobilizar o intestino. Barra de escala branca representa 1 mm.k "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Processamento de imagem com ImageJ.
As diferentes etapas de processamento de imagem são ilustrados para a primeira imagem do filme 1. Verde (monócitos) e (neutrófilos) canais vermelho são processados separadamente. Para os dados em bruto originais (A), um filtro de média é aplicada (B) e, em seguida, convertido para uma imagem binária (C). (D) Os canais são mescladas em uma imagem final. Linhas de verde ou vermelho observadas em dados brutos são células que estão em movimento rápido de modo que o microscópio não é capaz de adquiri-los totalmente. Barra de escala branca representa 40 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Pessoafaixas de leucócitos.
Faixas de monócitos (A) e neutrófilos (B) que patrulham o endotélio são processados com Imaris Software (Bitplane). Barra de escala branca representa 40 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1. Os leucócitos digitalizando parede endotelial no estado estacionário. No estado estacionário, Ly6C baixas patrulha monócitos ao endotélio. Os neutrófilos são circulante de acordo com o fluxo de sangue. Os neutrófilos são em vermelho e monócitos estão em verde. A barra de escala representa 50 um. Gerado com o objetivo 20X. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
ge = "always"> 
2:. Leucócitos digitalizar parede endotelial após a inflamação mediada por TLR2-mesmo campo de interesse como no filme 1. Filme começa 90 minutos após a adição de 20 ul de PBS contendo 100 ug de Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 agonista) directamente para o navio. Monócitos e neutrófilos recrutados são meticulosamente digitalizar a parede endotelial. Os neutrófilos são em vermelho e monócitos estão em verde. A barra de escala representa 50 um. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
Filme 3: Os resultados obtidos desde a preparação incorreta do mouse movimentos dos navios obtidos quando a anestesia ou imobilização do intestino estão incorretas.. A barra de escala representa 50 um.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" target = "_ blank"> Clique aqui para ver este vídeo.
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Discussion
As metodologias descritas neste manuscrito fornecer uma abordagem consistente para estudar de forma eficiente monócitos e comportamento de neutrófilos nas veias mesentérica, em condições de estado estacionário e inflamatórias.
O passo crucial da preparação é a imobilização de tecidos do intestino com PBS-humedecidos. Se realizada corretamente, vasos mesentéricos são bem expostos na lamela para aquisição de imagem. Isso permite a seleção de vários domínios de interesse para monitorar o comportamento de leucócitos nas veias mesentérica.
Nosso protocolo envolve a exteriorização de vasos mesentéricos antes do início das experiências, permitindo (1) para induzir directamente a inflamação nos vasos monitorizados, e (2) para gravar os pontos de tempo iniciais após a estimulação e (3) para acompanhar a cinética de o recrutamento de leucócitos e o seu comportamento no mesmo recipiente, antes e após a indução da inflamação.
Nós transfer neutrófilos purificado a partir de medula óssea de murídeo de o mesmo fundo genético e não a partir de sangue à medida que mais células podem ser obtidas por animal (6-12x10 6 vs 0.5-2x10 6 / ratinho). Se a utilização de neutrófilos do sangue é o preferido, o mesmo protocolo pode ser realizado para a purificação de células.
Na geração de imagens intravital, a visualização da vascularização é ativado por luz transmitida no caso de vasos mesentéricos. Alternativamente, os anticorpos fluorescentes contra PECAM1 (clone 390) ou dextrano fluorescente elevado peso molecular (70 kDa ou 2 MDa) 6,14 IV pode ser injectado para detectar a vasculatura. Por exemplo, a injeção intra-escrotal de 3 ug anti-PECAM1 (clone 390) foi relatado para permitir a detecção vasculatura com baixo fundo e não para afetar a atividade dos leucócitos no modelo cremaster 9. Em comparação com a luz transmitida, a utilização de anticorpos fluorescentes ou corantes nomeadamente introduz a possibilidade de reconstrução 3D da vasculature, mas um canal é sacrificado para a sua rotulagem e o tempo de aquisição é aumentada. Luz transmitida é suficiente no modelo mesenter graças à transparência da vasculatura, conforme descrito aqui. Pelo contrário, a marcação fluorescente da vasculatura é obrigatório na derme da orelha ou órgãos opacos.
A detecção de populações de leucócitos pode ser conseguida utilizando animais transgénicos que exibem fluorescência endógena em tipos específicos de células (monócitos Cx 3 CR1 eGFP / p 6 ou CFP 15 ou CD68 GFP 16 CD115; monócitos e neutrófilos Lys eGFP 9; e plaquetas CD41 YFP 17) . Embora CX3CR1 é expressa em todos os monócitos e alguns subconjuntos de células NK e T, Cx 3 CR1 eGFP / rato em peso é interessante para distinguir entre Ly6C inflamatória <sup> altos monócitos que apresentam menos de fluorescência da GFP do que Ly6C residente baixos monócitos 6. Como CD115 é específico da linha monocítica, o MacBlue rato CD115 PCP é um modelo interessante. No entanto, não é possível distinguir Ly6C alta e baixa Ly6C monócitos.
Uma alternativa para ratinhos transgénicos fluorescentes é a injecção intravenosa de anticorpos fluorescentes para marcar as populações de leucócitos em tempo real. Por exemplo, monócitos pode ser marcado com anticorpo anti-CD115 (clone AFS98), neutrófilos com anti-Ly6G (clone 1A8) e plaquetas com anti-CD49b (clone HMα2). Em geral, todos estes anticorpos são empobrecimento em dose elevada. Por isso, eles devem ser utilizados com precaução por curto período de tempo e em níveis baixos. Deve notar-se que, mesmo a dose baixa, um impacto sobre a função das células não pode ser excluída. A experiência pessoal com quantidades baixas (1-2 ug) permite a rotulagem de CD115 + monocytes e neutrófilos sem depleção Ly6G + (dados não publicados).
Embora o modelo da vasculatura derme ouvido é não-invasivo como a orelha é intocável, a profundidade da derme de ouvido é uma preocupação, o que o torna um modelo mais adequado para a microscopia de dois fótons de 13. Além disso, não é possível estimular directamente o recipiente no modelo de orelha sem perturbar fisicamente a preparação.
Nosso protocolo pode ser aplicado com qualquer microscópio confocal invertido. Como a velocidade de varredura e potência do laser são dependentes da máquina, a aquisição de um quadro (512 x 512 pixels, ou seja, 635 mm) em um único plano z requer aproximadamente 2,2 seg com as nossas definições para o scanner galvano da Nikon A1R. Infelizmente, esta baixa velocidade limita a possibilidade de gravar filmes de quatro dimensões de veias mesentéricas sem perda de qualidade. O scanner de ressonância do A1R oferece uma alta velocidade de aquisição, embora oqualidade das imagens é fortemente reduzida (fundo contra sinal específico) para as nossas experiências com o CX 3 CR1 gfp / p mouse. Deve ser mantido em mente que os lasers são fixados a inferior a 0,5% (<0,25 mW) para evitar a fototoxicidade e branqueamento.
Woodfin et al conseguiu adquirir filmes em 4D (imagens 60 z-stack em 40 seg) de venules cremaster usando uma Leica TCS SP5-9. Como os autores valores de imagem de 20-40 um de diâmetro, que são provavelmente menos sensível às mudanças no foco do que no nosso modelo (monitorização de mesentério de 200-400 um). Quando imagiologia tecido vivo, controle de foco é a preocupação mais importante, o que restringe a possibilidade de gravar um filme original que durou várias horas. Consideramos que a gravação de filmes com duração de 30 minutos (ou 45 minutos) é o mais prático no modelo mesentérica.
A adição de agonistas TLR altera a largura vaso e, portanto, o foco. Consequentemente,é muito difícil de imagem correctamente a primeira 10-15 min após a estimulação dos vasos até estabilizar.
Outra limitação é a duração da experiência. Devido à dificuldade de manter o rato anestesiado adequadamente ao longo de um longo período de tempo, é difícil ver a imagem mais do que 4 horas após a inflamação. O uso de outros anestésicos, tais como a inalação de isoflurano contínua, pode ser uma opção (embora não testado por nós).
Em ratos velhos (com mais de 16 semanas de idade), o aumento da quantidade de depósitos de gordura em torno dos vasos diminuir a qualidade de visualização dos vasos mesentéricos. Portanto, é melhor executar as experiências com ratinhos de 8-12 semanas de idade.
Esta técnica pode ser combinada com a injecção intravenosa de anticorpos para bloquear moléculas de interesse ou empobrecem dadas populações de leucócitos, de modo a que a importância das moléculas implicadas no recrutamento de leucócitos ou comportamento pode ser determinada. Adicionalmente,outros subconjuntos de leucócitos pode ser rastreado usando outras linhagens de camundongos transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em populações de células de interesse.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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