Abstract
Эффективное иммунный ответ зависит от быстрой мобилизации лейкоцитов крови к месту инфекции или травмы. Исследуя миграцию лейкоцитов в естественных условиях имеет решающее значение для понимания молекулярной основы лейкоцитов трансэндотелиальной миграции и взаимодействия с сосудистого эндотелия. Один мощный подход предполагает прижизненный микроскопии на трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках интерес.
Здесь мы приводим протокол для визуализации моноцитов и нейтрофилов в CX 3 CR1 GFP / мас мыши IV введенного с оранжевыми красителя помечены нейтрофилов с инверсной конфокальной микроскопии. Покадровой фильмы собрались от 30 мин до нескольких часов визуализации позволяют анализировать поведение лейкоцитов в брыжеечных вен под обеих стационарных и воспалительных состояний. Мы также описать шаги, чтобы побудить локально судно воспаление крови с TLR2 / TLR1 агониста Pam3SK4 и контролировать subsequeнт набор нейтрофилов и моноцитов.
Представленная методика может также использоваться для мониторинга других популяций лейкоцитов и исследовать молекулы, замешанных в лейкоцитов или торговли, используя другие стимулы или трансгенных мышей.
Introduction
Нейтрофилов и моноцитов в клетки врожденной иммунной системы, которые непрерывно циркулируют в крови. После травмы или инфекции, воспалительные сигналы вызывают лейкоцитов диапедез в поврежденные и инфицированные ткани, в данном инициирования клеточного иммунного ответа 1-3. Быстрота мобилизации лейкоцитов определяет положительный результат иммунных реакций. Эти сложные процессы зависят от специфических молекул (например, Селектины, эндотелий-хемокинов связаны), присутствующих на воспаленной эндотелия, которые помогают для создания липких контактов между циркулирующих лейкоцитов и эндотелия 1-3 .Чтобы получить представление о молекулах, участвующих в лейкоцитарной кадровое каскада, важно, чтобы визуализировать кинетику набора клеток, а также отслеживать поведение каждой клеточной популяции /. Эффективным методом прижизненной микроскопии включает на трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках, представляющих интерес.
Содержание "> На сегодняшний день, несколько подходов с использованием прижизненной микроскопии были разработаны для изображения сосудистой 4,5. Например, визуализация уха дермы сосудистой или брыжеечных вен прижизненной конфокальной микроскопии был использован для определения поведения патрулирования мышиный Ly6C низких моноцитов и человека CD14 + CD16 тусклым моноциты на стороне просвета кровеносных сосудов в стационарных условиях 6-8. Сосудистая мышиная модель кремастер часто используется для наблюдения за поведением нейтрофилов или воспалительных Ly6C высоких моноцитов при воспалительных или ишемических состояний у трансгенных мышей. В том, что так, кремастер стимулируется с помощью внутримошоночной инъекции IL1β, CCL2, TNFβ или ФМЛФ. После 2-4 часов, затем ткани хирургическим выводили и проанализированы прижизненной конфокальной микроскопии 9-11.Следующий протокол описывает метод мониторинга моноцитов и нейтрофилов в то же время с любымперевернутый флуоресцентной конфокальной микроскопии. Кроме того, наш метод подробно описано, как изображение и тот же сосуд раньше (стационарный режим) и после воспаления и, как следовать кинетики лейкоцитов. Для этой цели мы используем CX 3 CR1 GFP / вес мыши, чей моноциты экспрессируют EGFP, вводили IV с оранжевым красителем мышиных нейтрофилов помечены. С использованием инвертированного конфокальной микроскопии, можно (1) для отслеживания и анализа патрулирование Ly6C низкие моноциты в стационарных условиях и (2), чтобы следовать набору обоих моноцитов и нейтрофилов в том же сосуде после местного воспаления. Здесь мы создаем воспалительных заболеваний с помощью агониста TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Кроме того, такие изображения могут помочь определить роль специфических молекул, представляющих интерес в различных этапах лейкоцитов каскада если осуществляется на определенных нокаут-мышей, или в присутствии блокирующих антител 6,9,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры животных были проведены в соответствии с институциональной Комитетом по этике уходу за животными в Женеве, Швейцарии и кантона ветеринарии. Номер разрешения GE / 63/14.
1. Подготовка Единой клеточной суспензии из костного мозга
- Жертва мыши (8-12 недель) путем смещения шейных позвонков. Стерилизовать задние ноги с 70% этанола. Удалить кожу от задних ног.
- Рассеките из бедра мыши и большеберцовые кости и удалить ткань с ног с помощью скальпеля. Промыть ноги с 90% -ным этанолом и поместить в культуральную чашку, наполненную PBS.
- Под капот культуры, чистой ткани из бедра и большеберцовые кости с помощью скальпеля и отдельный на коленном суставе. Отрежьте конец каждого из костей.
- Флеш костного мозга от каждой кости с использованием 23G иглу и шприц 1 мл, наполненную подготовки среды (без фенолового красного DMEM / F12, 1% сыворотки крыс), в 50 мл винт трубы. Лишить клеточных агрегатов деликатно пассажей через пе 23GEdle и 1 мл шприца. Доведите общий объем до 25 мл препарата среде.
- Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл красных кровяных клеток Лизис RBLC буфера (8,3 г NH 4 Cl, 1 г NaHCO 3, 1 мл ЭДТА (100 мМ), полное до 1 л дистиллированной водой, фильтруют 0,22 мкм) в 15 мл винт трубы. Выдержите 30 сек на льду.
- Добавить 10 мл препарата среды и центрифуги 250 мкг, 5 мин, 4 ° C. Удалите супернатант и ресуспендируют в 2 мл препарата среде.
2. нейтрофилов Обогащение негативный отбор
- Добавить 150 мкл мыши коктейль обогащения нейтрофилов (клеток изоляции комплект платформы, такие как EasySep). Смешайте и инкубировать на льду в течение 10 мин.
- Добавьте 10 мл фенола красного свободной DMEM. Инверсия раз и центрифуги 250 мкг, 3 мин, 4 ° С.
- Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1,75 мл препарата среды в 5 мл полистирола с круглым дном пробирки. Добавить 250 мкл Биов коктейль Selection. Смешайте и инкубировать на льду в течение 10 мин.
- Vortex магнитных частиц (от платформы набор для выделения клеток) в течение 30 сек ресуспендировать частиц. Добавить 500 мкл магнитных частиц в суспензии клеток. Смешайте и инкубировать на льду в течение 10 мин.
- Поместите пробирку в магнит. Подождите 3 мин.
- Обратить магнит на новый 5 мл полистирола с круглым дном пробирки для сбора нужных немеченые клетки. Не принимайте последнюю каплю висит в трубке. Нежелательных клеток останется в трубке внутри магнита. Откажитесь эту трубку в биологической отходов.
- Поместите новую трубку в магнит. Подождите 3 мин.
- Обратить магнит на новый 15 мл винт трубы для сбора нужных немеченые клетки. Не принимайте последнюю каплю висит в трубке.
- Полный объем до 5 мл с фенолом красным свободного DMEM.
3. Маркировка нейтрофилов
- Добавить 0,5 мкл оранжевой краски, такие как сотовый Tracker Orange (работает концентрация1 мкМ, CMRA - хлорметил-rodol-ацетат, акции 10 мМ в ДМСО). Инкубируют 2 мин при 37 ° С.
- Добавить 2,5 мл препарата среде. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С.
- Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл препарата среде в 1,5 мл пробирку.
- Возьмите аликвоту рассчитывать с гематоцитометр.
- Инкубируйте 5 минут при 37 ° С. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С.
- Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл PBS. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С, чтобы вымыть.
- Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 10х10 6 клеток в 100 мкл PBS. Держите на льду до внутривенной инъекции. Примечание: клетки должны быть IV вводят как можно быстрее. 6-12x10 6 нейтрофилы / мышь обычно получают.
4. Подготовка Мышь прижизненной микроскопии
Примечание:.. Шаг 4,1) и 4,2) должны быть выполнены в начале эксперимента, чтобы избежать длительного времени ожидания меченых нейтрофилов на IC нае.
- Взвесьте CR1 GFP мышь CX 3 (8-12 недель).
- Подготовьте 800 мкл анестетиков (кетамин 60 мг / кг, 4,5 ксилазина мг / кг, acepromazone 1,75 мг / кг в PBS).
- Обезболить мыши. Инъекцией 200 мкл / 20 г мышь. Управление анестезия пальца щипать и проверки дыхания.
- Вводите нейтрофилов (10x10 6 ячеек в 100 мкл PBS) внутривенно, используя боковые вены хвоста или ретро-орбитальной пазухи, в удобное экспериментатора.
- Положите мышь на грелку и защищать глаза глазной гель.
- Стакан покровное (диаметр 35 мм) помещают в 10 см блюдо культуры ткани, которая имеет 30 мм отверстие диаметром. Использование масла для поддержания блюдо культуры ткани в контакте с покровным.
- Надрезать кожи живота с ножницами, чтобы разоблачить брюшины. Надрезать брюшины ножницами, чтобы разоблачить кишечник.
- Добавить 200 мкл PBS (предварительно нагревают при 37 ° С) в рeritoneal полости. Возьмите мышь в руке и поверните его лицом вниз, так что кишечник выходит из брюшной полости с нежным давлением. Наведите в культуре ткани блюдо.
- Аккуратно deroll кишечник с стерилизованных ватные палочки на покровное для того, чтобы разоблачить сосудов брыжейки.
- Вырезать бумажные салфетки в полосах и влажный их 37 ° C нагретого PBS. Остановите кишечник с кусочками бумажных салфеток, чтобы уменьшить движения, вытекающие из перистальтики.
- Поставьте блюдо культуры тканей и мышь внутри камеры 37 термостатируемом ° C на заказ стадии трее инвертированного микроскопа. Ввести шприц, содержащий анестетики подкожно в заднюю ногу. Примечание: Кроме того, мышь может получать кислород (0,5 л / мин) с маской.
- Управление мышь для анестезии палец щипать и проверки частоты дыхания каждые 30 мин. При необходимости, доставить заряд анестетиков (20 мкл), чтобы должным образом поддерживать анестезию. НЕЕ: Сушка сосудистой следует избегать. Таким образом, его влажность поддерживается регулярно смачивая бумажные салфетки, используемые для иммобилизации кишечника с 37 ° С-подогретое PBS.
5. Измерение нейтрофилов и моноцитов Поведение в воспаленных сосудов в Vivo помощью прижизненной микроскопии
- Набор лазеры 488- 561- и по самой низкой мощности, необходимой, чтобы избежать лазерного индуцированных фототоксичность. В наших экспериментах, это меньше, чем 0,5%. Интенсивность GFP в моноцитов и оранжевого красителя в нейтрофилов так ярко, что, как правило, 0,3% достаточно. Примечание: Это представляет собой мощность лазера 0,15 до 0,25 МВт с нашей системы.
- Получение изображений по 512 х 512 пикселей (т.е. 635 мкм) в 2,2 сек с открытым отверстием, используя 20X сухой цели инвертированного микроскопа. Используйте Z-глубину от 10 до 20 мкм, что обеспечивает устойчивый сигнал с низким лазерных полномочий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно проводят эксперименты с г-глубине между 12 до 1656; м. В случае, представленных фигур и фильмы, Z-глубина 20 мкм. Фазового контраста позволяет идентифицировать эндотелиальных стен и изображений осуществляется на мезентериальных вен. Так, патрулирующие клетки перемещаются довольно медленно со скоростью 5-10 мкм / мин 6, записи поле интереса каждые 20 сек удовлетворительное. С описанных настроек, моторизованная этап позволяет записывать до 7 областях, представляющих интерес в то же время. - Наведите и сосудов брыжейки в термостат камеры микроскопа позволит им оправиться от подготовки в течение 30 мин до приобретения первого фильма. В течение этого времени, выбрать несколько полей, представляющих интерес. Фокус на поверхности просвета сосуда, ближайшей к цели. При необходимости, воспользоваться небольшим автофлуоресценции эндотелия, чтобы установить фокус.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое при подготовке мыши слегка подчеркивает эндотелий. Следовательно, прокатки нейтрофилов и/ или моноциты могут наблюдаться в первые 15 мин следующей подготовки мыши. - Запишите первый фильм в течение 30 мин в стационарных условиях, одно изображение каждые 20 сек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение приобретает каждое поле интереса 2.2 сек и моторизованный этап автоматически перемещается из одной области в другую. Она восходит к первой позиции в 20 сек в течение 30 мин записи фильма. - Чтобы инициировать воспаление кровеносных сосудов, добавить каплю 20 мкл PBS, содержащего 100 мкг TLR2 / TLR1 агонистом Pam3CSK4 12 непосредственно на отображаемого сосудов.
- Управление фокус для каждой из сфер интересов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приобретения, всегда есть небольшие изменения фокуса на оси. Несмотря Z-глубины 10-20 мкм, это может привести к снижению интенсивности флуоресценции. Таким образом, вручную переориентировать каждое поле интереса в конце каждого фильма, если это необходимо. Записывайте фильмы за 30 мин периодов и до 3 часов вТаль после начала воспаления. - В конце эксперимента, пожертвовать наркозом мыши цервикальным сдвигом.
6. Формирование файлов фильмов и слежения лейкоцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение Nikon приобретение генерирует .nd2 файлы, но следующая процедура будет похожа с другим программным обеспечением и брендов.
- Экспорт файлов в формате TIFF, как серии.
- Перейти к ПО ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj). Импорт серии TIFF. Каждый канал в другой файл.
- Нанесите медианный фильтр с радиусом 2.0 пикселя из за зеленого и красного каналов, чтобы уменьшить фоновый шум (процесс> Фильтры> Медиана ...).
- Преобразование файлов в двоичный (Process> Binary> Сделать Binary). Включение программного обеспечения для расчета порога для каждого изображения.
- Слияние каналов в одной серии изображений (Image> Color> Merge Channels ...). Выберите моноцитов в Greeп канала, нейтрофилы в красном канале и проходящего света в сером канале.
- Преобразование сложены изображений в RGB цвета (изображение> Цвет> Стек для RGB).
- Сохранить файл как .avi
- Данные импортируются и составлен в программном обеспечении Imaris (битовой плоскости). Движения моноцитов и нейтрофилов затем отслеживается с помощью мастера отслеживания пятна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рукопись описывает оптимизированный протокол легко контролировать поведение моноцитов и нейтрофилов в брыжеечных вен наркозом мышей в режиме реального времени. Использование 37 ° C-термостатированный камеры является обязательным для поддержания температуры мыши, а также из-за зависящей от температуры движения лейкоцитов. Подготовка мыши отображается на рисунке 1. Рисунок 2 показывает всю площадь видел под микроскопом. Проходящий свет позволяет идентифицировать брыжеечных вен (красная стрелка) и артериях (синяя стрелка).
Лечение полученных изображений с ImageJ программного обеспечения генерируется видеофайлов, таких как кино 1 и кино 2. Рисунок 3 показывает различные этапы обработки изображений для первого момента времени фильм 1. Фильм 1 показывает патрулирование Ly6C низких моноцитов в стационарных условиях , как и ранее деописано 6,8,14 то время как все нейтрофилы циркулируют в кровотоке. Нет нейтрофилов не патрулирует эндотелия стенки. Фильм 2 показывает ту же область интересов 90 мин после добавления TLR2 / TLR1 агониста Pam3CSK4 к локально инициировать воспаление. В этом случае, нейтрофилов и моноцитов в массовом работу с эндотелиальной стенки, что они сканируют тщательно. Важно отметить, что добавление агониста TLR вызывает изменения в ширине эндотелия и, следовательно, изменяет фокус оси. Таким образом, основное внимание необходимо тщательно контролировать после добавления агониста. Сбор данных в программном обеспечении (Imaris битовой плоскости) позволяет отслеживать отдельные лейкоцитов с помощью мастера отслеживания пятна. Рисунок 4 показывает точные трек пути моноцитов (зеленый) и нейтрофилов (красный), патрулирующих вдоль эндотелия. Данные получены из анализа Movie 2, т.е. 90 мин после начала инфlammation. Отслеживание лейкоцитов путей могут быть экспортированы в формат TIFF файлы или XLS файлов, чтобы получить различные статистические данные, такие как длина трека, перемещение, продолжительность или скорость.
Эта техника предлагает хороший способ контролировать поведение моноцитов и нейтрофилов в то же время, до и после воспаления. Это можно проследить набор этих клеток на эндотелиальных овертайме стены. Потеря фокуса на оси или даже X / Y смещение может произойти как следствие кишечных движений, которые губят эксперимент. Фильм 3 иллюстрирует такой неудачной подготовку и приобретение.
Рисунок 1. Подготовка мыши.
Черные стрелки указывают PBS-смоченной ткани, используемый для иммобилизации кишечника. Белый стрелка указывает на 10 см культуре ткани блюдо. Т указывает на заказ этап алюминия лоток, который соответствует в микроскоп. Брыжеечный кровеносные сосуды красиво подвергается в центре на покровное. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. ветви брыжеечных вен и артерий.
Изображения (20 х 10), принятые с целью 10X были сшиты для представлять одно большое изображение имеющейся площади. Некоторые поля, представляющие интерес, то выбрали для мониторинга движения лейкоцитов с целью 20X. Красная стрелка указывает на брыжеечной вены. Синяя стрелка указывает на брыжеечной артерии. Зеленая стрелка указывает на жировую ткань, окружающую сосуды. Темная область на сторонах результатов изображения от наличия смоченной тканью используется для иммобилизации кишечника. Шкалы Белый представляет 1 мм.К "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Обработка изображений с ImageJ.
Различные этапы обработки изображений показано на первом изображении кино 1. Зеленые (моноцитов) и красных (нейтрофилов) каналов обрабатываются отдельно. К исходному исходных данных (А), медианный фильтр применяется (В), а затем преобразуется в двоичное изображение (C). (D) каналы объединяются в конечном изображении. Зеленые или красные линии, наблюдаемые в исходных данных являются клетки, которые движутся так быстро, что микроскоп не в состоянии полностью их приобрести. Шкалы Белый представляет 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Индивидуальныйлейкоцитов треки.
Следы моноцитов (А) и нейтрофилов (В), патрулирующих эндотелий обрабатываются с Imaris Software (битовой плоскости). Шкалы Белый представляет 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1. Лейкоциты сканирование эндотелия стенки в устойчивом состоянии. В стационарном состоянии, Ly6C низкие моноциты патрулировать эндотелий. Нейтрофилы циркулирующих в соответствии с потоком крови. Нейтрофилы в красный и моноциты в зеленый цвет. Масштабная линейка составляет 50 мкм. Сгенерировано с целью 20X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть это видео.
GE = "всегда"> 
2:. Лейкоциты сканирования эндотелиальных стенках после TLR2-опосредованного воспаления же области интереса, как в видео 1. Фильм начинается 90 мин после добавления 20 мкл PBS, содержащего 100 мкг Pam3CSK4 (агонист TLR2 / TLR1) непосредственно на судне. Нанятые моноцитов и нейтрофилов придирчиво сканирования эндотелия стенки. Нейтрофилы в красный и моноциты в зеленый цвет. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть это видео.
Фильм 3: Результаты, полученные из-за неправильной подготовки мыши Движения судов, полученных при анестезии или иммобилизация кишечника неверны.. Масштабная линейка составляет 50 мкм.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методологии, описанные в этой рукописи обеспечить последовательный подход, чтобы эффективно изучить моноцитов и нейтрофилов в поведение брыжеечных вен в стационарных и воспалительных состояний.
Решающим шагом в подготовке является иммобилизация кишечника с PBS, контактирующих с тканями. Если выполнены должным образом, мезентериальных сосудов красиво выставлены на покровное для получения изображения. Это позволяет выбрать из нескольких областях, представляющих интерес для мониторинга поведения лейкоцитов в брыжеечных вен.
Наш протокол предусматривает экстериоризации мезентериальных сосудов перед началом экспериментов, позволяя (1) непосредственно вызвать воспаление на контролируемых сосудов, и (2), чтобы записать первые моменты времени после стимуляции и (3), чтобы следить за кинетики набор лейкоцитов и их поведение в том же сосуде до и после индукции воспаления.
Мы Transfэр нейтрофилы очищают из мышиного костного мозга одного и того же генетического фона, а не из крови, как все больше клетки могут быть получены от каждого животного (6-12x10 6 против 0.5-2x10 6 / мышь). Если использование нейтрофилов крови, является предпочтительным, и тот же протокол может быть осуществлено для очистки клеток.
В прижизненной визуализации, визуализации сосудистой включена в проходящем свете, в случае брыжеечных сосудов. Кроме того, люминесцентные антитела против PECAM1 (клон 390) или люминесцентные высокой молекулярной декстран (70kDa или 2 MDA) 6,14 может быть введен IV обнаружить сосудистую. Например, внутри мошонки инъекции 3 мкг анти-PECAM1 (клон 390), как сообщается, позволит обнаружения сосудистой с низким фоном и не повлияет на активность лейкоцитов в кремастер модели 9. По сравнению с проходящем свете, использование флуоресцентными антителами или красители частности предусматривает возможность 3D-реконструкция vasculature, но канал пожертвовал своей маркировке и увеличивается время измерения. Проходящий свет достаточно в mesenter модели благодаря прозрачности сосудистой, как описано здесь. Напротив, флуоресцентный маркировки сосудистую является обязательным в ухо дермы или непрозрачных органов.
Обнаружение популяций лейкоцитов может быть достигнуто с использованием трансгенных животных, которые проявляют эндогенный флуоресценции в конкретных типах клеток (моноцитов СХ 3 CR1 EGFP / мас 6 или cd115 КФП 15 или CD68 GFP 16; моноциты и нейтрофилы Lys EGFP 9; и тромбоциты CD41 YFP 17) , Хотя CX3CR1 выражается во всех моноцитов и некоторых подмножеств NK и Т-клеток, то СХ 3 CR1 EGFP / вес мыши Интересно различие между воспалительным Ly6C <SUP> высокие моноциты, которые проявляют меньше GFP флуоресценции, чем житель Ly6C низких моноцитов 6. Как CD115 специфичен из моноцитов линии, MacBlue мыши cd115 СФП является интересной моделью. Однако это не возможно, чтобы отличить Ly6C высоким и низким Ly6C моноциты.
Альтернативой трансгенных мышей флуоресцентных это внутривенной инъекции флуоресцентными антителами, чтобы маркировать популяции лейкоцитов в реальном времени. Например, моноциты могут быть помечены анти-CD115 (клон AFS98), нейтрофилов с анти-Ly6G (клон 1A8) и тромбоцитов с анти-CD49b (клон HMα2). В общем, все эти антитела слой с высокой дозой. Таким образом, они должны быть использованы с осторожностью в течение короткого промежутка времени и в на низком уровне. Следует отметить, что даже при низкой дозе, воздействие на функции клеток не может быть исключена. Личный опыт с малых количествах (1-2 мкг) позволяет маркировку CD115 + месocytes и Ly6G + нейтрофилы без истощения (данные не опубликованы).
Хотя модель сосудистой уха дермы является неинвазивным, как ухо нетронутым, глубина уха дермы является проблемой, что делает его модель больше подходит для 2-фотонной микроскопии 13. Кроме того, это не возможно, чтобы непосредственно стимулируют судна в модели уха, не нарушая физически подготовку.
Наш протокол может быть применен любой перевернутой конфокальной микроскопии. Так скорость сканирования и мощность лазера являются машинно-зависимые, приобретение одного кадра (512 х 512 пикселей, то есть, 635 мкм) на одном плоскости г требует примерно 2.2 сек с нашими настройками для гальванической сканере Nikon A1R. К сожалению, это низкая скорость ограничивает возможность записи четырехмерные фильмы брыжеечных вен без потери качества. Резонансный сканер из A1R предлагает высокую скорость сбора, хотяКачество изображений сильно снижается (по сравнению фон конкретного сигнала) для наших экспериментов с CX 3 CR1 GFP / мас мыши. Следует иметь в виду, что лазеры, установленной на ниже 0,5% (<0,25 мВт), чтобы избежать фототоксичности и отбеливания.
Вудфин др удалось приобрести фильмы в 4D (изображения 60 г-стека в 40 сек) из кремастер венул с использованием Leica TCS SP5-9. Как отмечают авторы значений Изображение 20-40 мкм в диаметре, они, вероятно, менее чувствительны к изменениям в фокусе, чем в нашей модели (мониторинг мезентериальных вен 200-400 мкм). При визуализации живой ткани, контроль фокуса является наиболее важной задачей, которая ограничивает возможность записывать уникальный фильм прочного несколько часов. Мы считаем, что записи фильмов длительностью 30 мин (или 45 мин) является наиболее практичным в модели брыжеечной.
Добавление агонистов TLR изменяет ширину сосудов и, следовательно, фокус. Вследствие этого,это очень трудно должным образом изображению первой 10-15 мин после стимуляции до сосуды не стабилизируется.
Другим ограничением является продолжительность эксперимента. Из-за трудности поддержания мышь под наркозом образом в течение длительного периода времени, трудно изображения более чем 4 ч после воспаления. Использование других анестетиков, таких как непрерывного ИФ ингаляции, может быть вариант (хотя не проверял нас).
В старых мышей (более 16 недель), увеличение количества жировых отложений вокруг сосудов снизить качество визуализации сосудов брыжейки. Поэтому лучше проводить эксперименты с 8-12-недельных мышей.
Этот метод может быть объединен с внутривенной инъекции антител блокировать интересующих молекул или истощить данные лейкоцитов популяции, так что значение молекул, вовлеченных в лейкоцитов или поведение может быть определено. Дополнительно,другие лейкоцитов подмножеств можно отслеживать с помощью других трансгенных линий мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клеточных популяций интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
