Abstract
Effektiv immunresponsen er avhengig av rask mobilisering av blodleukocytter til stedet for infeksjon eller skade. Gransker leukocyttmigrasjon in vivo er avgjørende for å forstå den molekylære grunnlaget for leukocytter transendothelial migrasjon og samhandling med vaskulær endotel. En kraftig tilnærming innebærer intramikroskopi på transgene mus som uttrykker fluorescerende proteiner i celler av interesse.
Her presenterer vi en protokoll for bildebehandling monocytter og nøytrofile i CX 3 CR1 GFP / wt mus iv injisert med oransje fargemerkede nøytrofile med en invertert konfokal mikroskop. Time-lapse filmer samlet fra 30 min til flere timer med bildebehandling tillate analyse av leukocytter atferd i tarmens blodårer under begge stabile og betennelsestilstander. Vi beskriver også fremgangsmåten for å lokalt indusere blodåre betennelse med TLR2 / TLR1 agonist Pam3SK4 og overvåke subsequent rekruttering av nøytrofile granulocytter og monocytter.
Den presenterte teknikken kan også brukes til å overvåke andre populasjoner av leukocytter og undersøke molekyler involvert i leukocytt rekruttering eller trafficking ved hjelp av andre stimuli eller transgene mus.
Introduction
Nøytrofiler og monocytter er celler i det medfødte immunsystem som kontinuerlig sirkulerer i blodet. Ved skade eller infeksjon, betennelsessignaler indusere leucocyte diapedese inn skadet og infisert vev, heri initiere en cellulær immunrespons 1-3. Hurtighet av leukocytter mobilisering bestemmer positive utfallet av immunresponser. Disse intrikate prosesser er avhengige av spesifikke molekyler (f.eks selectins, endotel-bundet chemokiner) til stede på den betente endotelet som bidrar til etablering av selvklebende kontakter mellom sirkulerende leukocytter og endotelet 1-3 .For få innsikt i molekylene innblandet i leukocytter rekruttering kaskade, er det viktig å visualisere de kinetikken til celle rekruttering og å spore oppførselen til hver celle / populasjon. En effektiv metode omfatter intravital mikroskopi på transgene mus som uttrykker fluorescerende proteiner i celler av interesse.
innhold "> Til dags dato, ble flere tilnærminger som bruker intramikroskopi utviklet til bilde blodkar 4,5. For eksempel ble avbildning av øret dermis blodkar eller mesenteriets vener av intra konfokalmikroskopi brukes til å identifisere patruljering oppførselen murine Ly6C lave monocytter og menneskelig CD14 dim CD16 + monocytter på den luminale siden av blodårer under stabile betingelser 6-8. Musen cremaster vaskulaturen modell blir ofte brukt til å overvåke virkemåten av nøytrofiler eller inflammatorisk Ly6C høye monocytter henhold inflammatoriske eller ischemiske tilstander i transgene mus. I denne tilfellet er cremaster stimuleres via intrascrotal injeksjon av IL1β, CCL2, TNFå eller fMLP. Etter 2-4 timer, vev blir deretter kirurgisk exteriorized og analysert av intra konfokalmikroskopi 9-11.Følgende protokoll beskriver en metode for å overvåke monocytter og nøytrofiler på samme tid med en hvilken som helstinvertert fluorescens konfokalmikroskop. Videre detaljer vår metode hvordan bildet det samme fartøyet før (steady state tilstand) og etter betennelse og hvordan de skal følge kinetikken av leukocytt rekruttering. Til dette formålet bruker vi CX 3 CR1 GFP / wt mus, hvis monocytter uttrykke EGFP, iv injisert med en oransje fargemerkede murine nøytrofile. Ved hjelp av en invertert konfokalmikroskop, er det mulig (1) for å spore og analysere patruljer Ly6C lave monocytter under stabile tilstandsbetingelser, og (2) for å følge rekruttering av både monocytter og nøytrofile i samme beholder etter lokal betennelse. Her skaper vi de betennelsestilstander ved hjelp av TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12. Videre kan en slik avbildning med på å bestemme rollen til spesifikke molekyler av interesse i de forskjellige trinnene av leukocytt-rekruttering kaskade hvis utført på bestemte knock-out-mus, eller i nærvær av blokkerende antistoffer 6,9,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Animal prosedyrer ble utført i samsvar med Institutional Etisk komité Animal Care i Genève, Sveits og Cantonal Veterinary Office. Autorisasjonsnummer GE / 63/14.
1. Utarbeidelse av en enkelt celle Suspensjon fra Bone Marrow
- Sacrifice mus (til 8-12 uker gammel) ved halshugging. Sterilisere bakbeina med 70% etanol. Fjern skinnet fra bakbeina.
- Dissekere ut muse lårben og tibias og fjerne vev fra ben med en skalpell. Skyll ben med 90% etanol og sted inn i en kultur tallerken fylt med PBS.
- Under kulturen panseret, rene vev fra lårben og tibias med en skalpell og separat ved kneleddet. Skjær av hver ende av bein.
- Flush benmarg fra hvert ben ved anvendelse av en 23G nål og en 1 ml sprøyte fylles med fremstillingen medium (fenolrødt-fritt DMEM / F12, 1% rotteserum), inn i et 50 ml rør skrue. Forstyrre celle aggregater av delikat aging gjennom 23G neEdle og en 1 ml sprøyte. Bring totalt volum til 25 ml med medium preparatet.
- Sentrifuger 250 xg, 5 min, 4 ° C. Kast supernatant. Resuspender pellet i 1 ml Red Blood Cell Lysis RBLC buffer (8,3 g NH4CI, 1 g NaHCO3, 1 ml EDTA (100 mM), fullstendig til 1 liter med destillert vann, filtrerer 0,22 um) i en 15 ml skru rør. Inkuber 30 sekunder på is.
- Tilsett 10 ml av preparatet medium og sentrifuger 250 xg, 5 min, 4 ° C. Kast supernatant og resuspender i 2 ml forberedelse medium.
2. Neutrofil berikelse av negativ seleksjon
- Legg 150 ul Mouse nøytrofile berikelse cocktail (celle isolasjon plattform kit som EasySep). Bland og inkuber på is i 10 min.
- Tilsett 10 ml fenol rød fri DMEM. Invert gang og sentrifuger 250 xg, 3 min, 4 ° C.
- Kast supernatant. Resuspender pellet i 1,75 ml medium preparatet i 5 ml polystyren rundbunnede rør. Tilsett 250 ul Bioti Utvalg Cocktail. Bland og inkuber på is i 10 min.
- Vortex de magnetiske partikler (fra celleisolasjon plattformen kit) i 30 sekunder for å resuspendere partiklene. Legg 500 mL magnetiske partikler til cellesuspensjon. Bland og inkuber på is i 10 min.
- Plasser røret i magneten. Vent 3 min.
- Snu magnet på en ny 5 ml polystyren rund bunn rør for å samle de ønskede umerkede celler. Ikke ta den siste dråpe hengende i røret. Uønskede celler vil forbli i røret inne i magneten. Kast dette røret inn i en biologisk avfall.
- Plasser det nye røret inn i magneten. Vent 3 min.
- Snu magnet på en ny 15 ml skru rør for å samle de ønskede umerkede celler. Ikke ta den siste dråpe hengende i røret.
- Komplett volum til 5 ml med fenolrød gratis DMEM.
3. Merking av Neutrofiler
- Legg 0,5 mL av en oransje fargestoff som Cell Tracker Orange (jobber konsentrasjon1 pM, CMRA - klormetyl-rodol-acetat, lager 10 mM i DMSO). Inkuber 2 min ved 37 ° C.
- Legg 2,5 ml av preparatet medium. Sentrifuger 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Kast supernatant. Resuspender pellet i 1 ml forberedelse medium i et 1,5 ml rør.
- Ta en delmengde å telle med hematocytometer.
- Inkuber 5 min ved 37 ° C. Sentrifuger 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Kast supernatant. Resuspender pellet i 1 ml PBS. Sentrifuger 250 xg, 5 min, 4 ° C for å vaske.
- Kast supernatant. Resuspender pellet som 10x10 6 celler per 100 mL PBS. Hold på is inntil iv injeksjon. MERK: Cellene må være iv injiseres så raskt som mulig. 6-12x10 6 nøytrofile / mus er vanligvis oppnås.
4. Mouse Forberedelse til intraMikros
MERK:.. Trinn 4.1) og 4.2) bør utføres ved begynnelsen av forsøket for å unngå lengre ventetid på merket nøytrofile på ice.
- Veie CX 3 CR1 GFP mus (til 8-12 uker gamle).
- Forbered 800 ul av anestetika (ketamin 60 mg / kg xylazin, 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg i PBS).
- Anesthetize mus. Injeksjon ip med 200 mL / 20 g mus. Kontroll anestesi ved tå klemming og ved å sjekke lufthastighet.
- Injisere nøytrofile (10x10 6 celler i 100 mL PBS) intravenøst ved hjelp av sidehale vener eller retro-orbital sinus, på bekvemmeligheten av eksperimentator.
- Sett musen på varmeputen og beskytte øynene med okulær gel.
- Et dekkglass (35 mm diameter) blir satt i en 10 cm vevskulturskål, som har en 30 mm diameter hull. Bruk olje er å opprettholde vevskulturskål i kontakt med dekkglasset.
- Incise abdominal hud med saks for å avsløre bukhinnen. Incise peritoneum med saks for å avsløre tarmen.
- Tilsett 200 ul PBS (pre-oppvarmet ved 37 ° C) inn i peritoneal hulrom. Ta musen i hånden og slå den med ansiktet ned, slik at tarmen kommer ut av bukhulen med et lett trykk. Plasser musen i vevskulturskål.
- Forsiktig deroll tarmen med steriliserte bomull knopper på dekkglass for å eksponere de tarmens fartøy.
- Skjær papir vev i band og våt dem med 37 ° C oppvarmet PBS. Immobilisere tarmen med bitene av papir vev for å redusere bevegelsene skyldes peristaltikk.
- Sett vevskulturskål og musen inne i 37 ° C termostat kammer på skreddersydde skuffen stadium av invertert mikroskop. Innføre en sprøyte som inneholder bedøvelse sc inn i bakbenet. NB: I tillegg kan mus motta oksygen (0,5 l / min) med en maske.
- Kontroll mus for anestesi ved tå klemming og sjekker lufthastigheten hvert 30 min. Hvis det er nødvendig, gi en boost av bedøvelse (20 mL) for å vedlikeholde anestesi. IKKEE: Tørking av blodkar bør unngås. Derfor er dens fuktighet opprettholdes ved regelmessig fukting av papirhåndklær som benyttes for å immobilisere tarmen med 37 ° C varme-PBS.
5. Måling Neutrofil og Monocyte Opptreden i Betente Vessels In Vivo bruker intraMikros
- Set lasere til 488 og 561- på det laveste strøm nødvendig for å unngå laser-indusert fototoksisitet. I våre eksperimenter, er det mindre enn 0,5%. Intensiteten av GFP i monocytter og oransje fargestoff i nøytrofile er så lys som vanligvis 0,3% er nok. MERK: Dette representerer en lasereffekt på 0,15 til 0,25 mW med vårt system.
- Hente bilder på 512 x 512 piksler (dvs. 635 mikrometer) i 2,2 sek med en åpen pinhole med 20X tørr Målet med invertert mikroskop. Bruk en z-dybde mellom 10 til 20 mikrometer, som sikrer tilstrekkelig signal med lav laser krefter.
MERK: Vi pleier å utføre eksperimenter med en z-depth mellom 12 til 1656; m. I tilfelle av presenterte tall og filmer, er z-dybde 20 um. Fasekontrast tillater identifisering av endoteliale veggene og avbildning er utført på mesenteriale årer. Siden patruljerer celler flytte ganske langsomt med en hastighet på 5-10 mikrometer / min 6, spiller inn en interessefelt hvert 20 sek er tilfredsstillende. Med de beskrevne innstillinger, kan den motordrevne fasen opptak av opp til 7 interessefelt samtidig. - Plasser musen og mesenteriske fartøy i termostat kammer av mikroskopet er tillate dem å gjenopprette fra forberedelsene til 30 min før oppkjøpet av den første filmen. I løpet av denne tiden, velger flere felt av interesse. Fokus på den luminale overflate av beholderen som er nærmest målet. Hvis nødvendig, dra nytte av svak auto-fluorescens av endotelet å sette fokus.
MERK: Kirurgi under muse forberedelse streker litt endotelet. Følgelig rullende av nøytrofile og/ eller monocytter kan observeres i de første 15 min etter mus fremstillingen. - Spill en første filmen i 30 minutter under stabile forhold, ett bilde hvert 20. sekund.
MERK: Programvaren henter hvert interessefelt i 2,2 sek og den motoriserte scenen flyttes automatisk fra ett felt til et annet. Det går tilbake til første posisjon innen 20 sekunder i løpet av 30 minutter av opptaket filmen. - Å initiere blodåre betennelse, tilsett en dråpe 20 mL PBS som inneholder 100 mikrogram av TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 direkte på avbildes fartøy.
- Styre fokus for hvert felt av interesse.
MERK: I løpet av oppkjøpet, er det alltid små endringer med fokus på z-aksen. Til tross for den 10-20 um z-dybde, kan dette resultere i en reduksjon av fluorescens intensitet. Derfor manuelt refokusere hver interessefelt på slutten av hver film, hvis det er nødvendig. Ta opp filmer i 30 min-perioder og opp til 3 timer tiltal etter oppstart av betennelse. - Ved slutten av eksperimentet, ofre bedøvet mus ved cervikal dislokasjon.
6. generasjon av videofiler og sporing av Leukocytter
MERK: Nikon oppkjøpet programvare genererer .nd2 filer, men følgende fremgangsmåte vil være lik med annen programvare og merkevarer.
- Eksportere filer som tiff-serien.
- Gå til ImageJ programvare (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importere tiff-serien. Hver kanal som en annen fil.
- Påfør et medianfilter med en radius på 2,0 pixel for de grønne og røde kanaler for å redusere bakgrunnsstøy (Process> Filtre> Median ...).
- Konvertere filer til binære (Process> Binary> Gjør Binary). Aktivere programvaren for å beregne terskelen for hvert bilde.
- Flett kanaler inn ett bilde serie (Bilde> Farge> Merge kanaler ...). Velg monocytter i green-kanal, neutrofilene i den røde kanal og det utsendte lyset i grå kanal.
- Konverter stablet bilder til RGB-farger (Bilde> Farge> Stable til RGB).
- Lagre filen som .avi
- Dataene er importert og samlet i Imaris programvare (bitplan). Bevegelser av monocytter og nøytrofile deretter spores ved hjelp av Spot Tracking Wizard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manuskriptet beskriver en optimalisert protokoll enkelt overvåke oppførselen til monocytter og nøytrofile i mesenteriske årer av bedøvede mus i sanntid. Bruken av en 37 ° C-termostatert kammer er obligatorisk for å opprettholde temperaturen av musen, og også på grunn av den temperaturavhengige bevegelser av leukocytter. Fremstilling av muse blir vist i figur 1. Figur 2 viser alle området sett under mikroskopet. Overført lys gjør identifisering av mesenteriske vener (rød pil) og arterier (blå pil).
Behandling av oppkjøpte bilder med ImageJ programvare generert filmfiler, for eksempel Movie 1 og Movie 2. Figur 3 viser de ulike trinnene i bildebehandling for første gang poenget med filmen en. Movie 1 viser patruljering av Ly6C lave monocytter under stabile forhold Som tidligere DErisses 6,8,14 mens alle nøytrofile er sirkulerer i blodet. Ingen nøytrofile celler er patruljer endotelial veggen. Film 2 viser det samme felt av interesse 90 minutter etter tilsetningen av TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 å initiere lokale betennelser. I dette tilfellet er nøytrofile granulocytter og monocytter massivt rekruttert til endotel-veggen, som de skanne omhyggelig. Det er viktig å merke seg at tilsetning av en TLR-agonist induserer endringer i endotel bredde og dermed endrer fokus for z-aksen. Derfor bør fokus kontrolleres nøye etter tilsetning av agonisten. Sammenstilling av data i Imaris programvare (bitplan) gjør at sporing av individuelle leukocytter ved hjelp av Spot Tracking Wizard. Figur 4 viser de eksakte sporveier av monocytter (grønn) og nøytrofile (rød) patruljerer langs endotelet. Dataene oppnådd fra analysen av filmen 2, dvs. 90 minutter etter initiering av inflammation. Sporing av leukocytter stier kan eksporteres som tiff filer eller xls-filer for å få ulike statistikker som sporlengde, fortrengning, varighet eller hastighet.
Denne teknikken gir en fin måte å overvåke oppførselen til monocytter og nøytrofile på samme tid før og etter betennelse. Det er mulig å spore rekrutteringen av disse cellene i det endoteliale veggen overtid. Tap av fokus på z-aksen eller til og med x / y forskyvning kan oppstå som en konsekvens av tarmbevegelser som ødelegger forsøket. Movie 3 illustrerer en slik mislyktes forberedelse og oppkjøp.
Figur 1. Mouse forberedelse.
Sorte piler indikerer PBS-fuktet vev benyttes for å immobilisere tarmen. Hvit pilspiss indikerer 10cm vevskulturskål. T angir aluminium skreddersydde brett stadium som passer inn i mikroskopet. Mesenterisk blodkar er pent eksponert i sentrum på dekkglass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. grener av mesenteriske vener og arterier.
Bilder (20 x 10) tatt med en 10X objektiv ble sydd utgjøre et stort bilde av tilgjengelig areal. Flere interessefelt blir deretter valgt å overvåke leukocytt bevegelse med en 20X objektiv. Den røde pilen indikerer en mesenteriske blodåre. Den blå pilen indikerer en mesenteriske arterie. Den grønne pilen indikerer fettvev rundt skipene. Det mørke området på sidene av bilde seg fra tilstedeværelsen av fuktede vev benyttes for å immobilisere tarmen. Hvit skala bar representerer 1 mm.k "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Bildebehandling med ImageJ.
De ulike trinnene i bildebehandling er illustrert for det første bildet av Movie 1. Green (monocytter) og røde (nøytrofile) kanaler behandles separat. Til de opprinnelige rå-data (A) blir en medianfilter anvendt (B) og deretter omdannet til et binært bilde (C). (D) Kanaler er slått sammen til et endelig bilde. Grønne eller røde linjer observert i rådata er celler som beveger seg så fort at mikroskop er ikke i stand til helt skaffe dem. Hvit skala bar representerer 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Individuellleukocytter spor.
Spor av monocytter (A) og nøytrofile (B) patruljerer endotelet behandles med Imaris programvare (bitplan). Hvit skala bar representerer 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie 1. Leukocytter skanning endothelial veggen ved steady state. Ved steady state, Ly6C lave monocytter patruljere endotelet. Neutrofiler er sirkulert i henhold til blodstrømmen. Nøytrofile er i rødt og monocytter er i grønt. Scale bar representerer 50 mikrometer. Generert med 20X objektiv. Klikk her for å se denne videoen.
ge = "always"> 
2:. Leukocytter skanning av endotelial veggen etter TLR2-mediert betennelse Samme felt av interesse som i filmen 1. Film begynner 90 minutter etter tilsetning av 20 pl PBS inneholdende 100 ug Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 agonist) direkte på fartøyet. Rekruttert monocytter og nøytrofile er omhyggelig skanne endothelial veggen. Nøytrofile er i rødt og monocytter er i grønt. Scale bar representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se denne videoen.
Movie 3: Resultater oppnådd av feil mus forberedelse Bevegelser av fartøy som oppnås når anestesi eller immobilisering av tarmen er feil.. Scale bar representerer 50 mikrometer.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" target = "_ blank"> Klikk her for å se denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som er beskrevet i dette manuskriptet gi en konsistent tilnærming til effektivt studere monocytt- og nøytrofile atferd i tarmens blodårer under stabile og betennelsestilstander.
Det avgjørende skritt av preparatet er immobiliseringen av tarmen med PBS-fuktede vev. Hvis det utføres riktig, blir mesenteriske fartøy pent eksponert på dekkglass for bildeopptak. Dette gjør at utvalget av flere felt av interesse å overvåke leukocytt atferd i tarmens blodårer.
Vår protokoll involverer exteriorization av mesenteriske fartøy før starten av forsøkene, slik at (1) for direkte å fremkalle inflammasjon på de overvåkede fartøy, og (2) for å registrere de tidlige tidspunkter etter stimulering og (3) for å følge opp kinetikken rekrutteringen av leukocytter og deres oppførsel i den samme beholderen før og etter induksjon av betennelsen.
Vi Overfer nøytrofile renset fra murine benmarg fra samme genetiske bakgrunn og ikke fra blod som flere celler kan fås per dyr (6-12x10 6 vs 0.5-2x10 6 / mus). Ved bruk av blodneutrofiler er foretrukket, kan den samme protokollen bli utført for cellerensing.
I intra avbildning, er visualiseringen av vaskulaturen aktivert av overført lys i tilfellet av mesenteriale fartøy. Alternativt kan fluorescerende antistoffer mot PECAM1 (klone 390) eller fluoriserende høy molekylvekt dekstran (70kDa eller to MDA) 6,14 være iv injisert for å oppdage blodkar. For eksempel ble intra-skrotal injeksjon av 3 ug anti-PECAM1 (klon 390) som er rapportert for å muliggjøre deteksjon blodkar med lav bakgrunn og for ikke å påvirke aktiviteten i leukocytt cremaster modellen 9. Sammenlignet overført lys, bruk av fluorescerende antistoffer eller fargestoffer særlig introduserer muligheten for 3D-rekonstruksjon av vasculature, men en kanal er ofret til sin merking og oppkjøpet tid økes. Fallende lys er tilstrekkelig i mesenter modell takket være åpenhet av blodkar, slik det er beskrevet her. Tvert imot, er fluorescerende merking av blodkar obligatorisk i øret dermis eller ugjennomsiktig organer.
Påvisning av bestander av leukocytter kan oppnås ved bruk av transgene dyr som utviser endogen fluorescens i spesifikke celletyper (monocytter Cx 3 CR1 EGFP / vekt 6 eller cd115 CFP 15 eller cd68 GFP 16; monocytter og nøytrofile Lys EGFP 9, og blodplater cd41 YFP 17) . Selv CX3CR1 er uttrykt i alle monocytter og noen undergrupper av NK og T-celler, CX 3 CR1 EGFP / wt mus er interessant å skille mellom inflammatorisk Ly6C <sup> høye monocytter som viser mindre GFP fluorescens enn bosatt Ly6C lave monocytter 6. Som CD115 er bestemt av monocyttisk linjen, er MacBlue musen cd115 CFP en interessant modell. Men det er ikke mulig å skille Ly6C høy og Ly6C lave monocytter.
Et alternativ til transgene mus fluorescerende er intravenøs injeksjon av fluorescerende antistoffer for å merke populasjoner av leukocytter i sanntid. For eksempel kan monocytter merkes med anti-CD115 (klone AFS98), nøytrofile med anti-Ly6G (klon 1A8) og blodplater med anti-CD49b (klone HMα2). Generelt er alle disse antistoffene reduserende ved høy dose. Derfor bør de brukes med forsiktighet for kort periode ganger og på lave nivåer. Det skal bemerkes at selv ved en lav dose, en effekt på cellefunksjonen, kan ikke utelukkes. Personlig erfaring med lave mengder (1-2 mikrogram) gjør det mulig for merking av CD115 + Manocytes og Ly6G + nøytrofile uten mangel (data ikke publisert).
Selv om modellen av øret dermis blodkar er non-invasiv som øret er urørt, er dybden av øret dermis en bekymring, noe som gjør det til en modell mer egnet for to-foton mikros 13. Dessuten er det ikke mulig direkte å stimulere fartøyet i øret modellen uten å forstyrre fysisk preparatet.
Vår protokollen kan bli anvendt med en hvilken som helst invertert konfokalt mikroskop. Siden skannehastighet og laser makt er maskinavhengig, oppkjøp av en ramme (512 x 512 piksler, dvs. 635 mm) på en enkelt z-planet krever omtrent 2,2 sek med våre innstillinger for galvanoskanner fra Nikon A1R. Dessverre begrenser dette lav hastighet man kan spille inn fire-dimensjonale filmer av mesenteriets vener uten tap av kvalitet. Den resonant scanner av A1R tilbyr en høy anskaffelses hastighet, selv omkvaliteten på bildene er sterkt redusert (bakgrunns versus spesifikk signal) for våre eksperimenter med CX 3 CR1 GFP / wt mus. Det bør være oppmerksom på at lasere er innstilt på lavere enn 0,5% (<0,25 mW) for å unngå fototoksisitet og bleking.
Woodfin et al klart å skaffe filmer i 4D (60 z-stack bilder i 40 sek) fra Cremaster venyler bruker en Leica TCS-SP5 9. Som forfatterne bilde verdier av 20 til 40 mikrometer i diameter, er de sannsynligvis mindre følsom overfor endringer i fokus enn i vår modell (overvåkning av mesenteriale årer av 200-400 nm). Når bildebehandling levende vev, er kontroll av fokus den viktigste bekymring, noe som begrenser muligheten til å ta opp en unik film som varer i flere timer. Vi mener at du tar opp film med varighet 30 min (eller 45 min) er den mest praktiske i mesenteriske modell.
Tilsetningen av TLR-agonister endrer fartøyets bredde og derfor fokus. Følgeligdet er svært vanskelig å avbilde riktig første 10-15 min etter stimulering til fartøyene stabiliseres.
En annen begrensning er varigheten av forsøket. På grunn av vanskeligheter med å opprettholde musen bedøvet riktig over en lang periode, er det vanskelig å avbilde mer enn 4 timer etter betennelse. Bruk av andre anestetika, som kontinuerlig isofluran innånding, kan være et alternativ (men ikke testet av oss).
I gamle mus (over 16 uker gamle), økt mengde av fettlagre rundt fartøyene redusere kvaliteten på visualisering av tarmens fartøy. Derfor er det bedre å kjøre eksperimenter med til 8-12 uker gamle mus.
Denne teknikken kan kombineres med den intravenøse injeksjon av antistoffer for å blokkere molekyler av interesse eller utarme gitte leukocyttpopulasjoner, slik at betydningen av molekyler involvert i leukocytt-rekruttering eller oppførsel kan bestemmes. I tilleggandre leukocytter undergrupper kan spores ved hjelp av andre transgene musestammer som uttrykker fluorescerende proteiner i cellepopulasjoner av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
