Abstract
Respuesta inmune eficiente depende de la rápida movilización de leucocitos de la sangre al sitio de la infección o lesión. La investigación de la migración de leucocitos in vivo es crucial para entender la base molecular de la migración transendotelial de leucocitos y la interacción con el endotelio vascular. Un enfoque poderoso implica microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés.
Aquí se presenta un protocolo para los monocitos de imágenes y neutrófilos en el CX 3 CR1 gfp / peso iv ratón inyectado con neutrófilos marcado tinte de color naranja con un microscopio confocal invertido. Películas Time-lapse recogidos de 30 minutos a varias horas de imágenes de permitir el análisis del comportamiento de leucocitos en las venas mesentéricas, tanto en condiciones de estado estacionario e inflamatorias. También describe los pasos para inducir localmente inflamación de los vasos de sangre con TLR2 / TLR1 agonista Pam3SK4 y supervisar el subsequent reclutamiento de neutrófilos y monocitos.
La técnica presentada también se puede utilizar para controlar otras poblaciones de leucocitos e investigar moléculas implicadas en el reclutamiento de leucocitos o el tráfico que utilizan otros estímulos o ratones transgénicos.
Introduction
Los neutrófilos y los monocitos son las células del sistema inmune innato que circulan continuamente en la sangre. Tras la lesión o infección, inducen señales inflamatorias diapedesis de leucocitos en los tejidos dañados y infectadas, en el presente documento iniciar una respuesta inmune celular a 1-3. La rapidez de la movilización de leucocitos determina el resultado positivo de las respuestas inmunes. Estos procesos complejos se basan en moléculas específicas (por ejemplo, selectinas, quimiocinas endotelio unida) presentes en el endotelio inflamado que ayudan para el establecimiento de contactos adhesivas entre leucocitos circulantes y el endotelio 1-3 .Para obtener ideas sobre las moléculas implicadas en los leucocitos cascada de reclutamiento, es importante para visualizar la cinética de reclutamiento de células y para rastrear el comportamiento de cada célula / población. Un método eficaz consiste en microscopía intravital en ratones transgénicos que expresan las proteínas fluorescentes en las células de interés.
contenido "> Hasta la fecha, varios enfoques mediante microscopía intravital se desarrollaron para la imagen de la vasculatura 4,5. Por ejemplo, se utilizó la imagen de la dermis del oído vasculatura o venas mesentéricas por microscopía confocal intravital para identificar el comportamiento de patrullaje de Ly6C murino monocitos bajos y humana CD14 dim monocitos CD16 + en el lado luminal de los vasos sanguíneos en condiciones de estado estacionario 6-8. El modelo vasculatura cremáster ratón se utiliza a menudo para monitorear el comportamiento de neutrófilos o monocitos Ly6c inflamatoria altos en condiciones inflamatorias o isquémicas en ratones transgénicos. En ese caso, cremáster se estimula a través de la inyección de intraescrotal IL1β, CCL2, TNFß o fMLP. Después de 2-4 horas, tejidos se exteriorizan y se analizaron por microscopía confocal intravital 9-11 quirúrgicamente.El siguiente protocolo describe un método para monitorear monocitos y neutrófilos, al mismo tiempo con cualquierde fluorescencia invertida microscopio confocal. Por otra parte, nuestro método detalla cómo reproducir el mismo recipiente antes (condición de estado estable) y después de la inflamación y cómo seguir la cinética de reclutamiento de leucocitos. Para este fin, se utiliza el CX 3 CR1 ratón gfp / peso, cuya monocitos expresar eGFP, iv inyectado con una naranja neutrófilos murinos marcados con colorante. El uso de un microscopio confocal invertido, es posible (1) para rastrear y analizar los monocitos bajos Ly6c patrullaje bajo condiciones de estado estacionario y (2) para seguir el reclutamiento de monocitos y neutrófilos ambos en el mismo recipiente después de la inflamación local. Aquí creamos las condiciones inflamatorias mediante el agonista TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Además, tal formación de imágenes puede ayudar a determinar el papel de las moléculas específicas de interés en las diversas etapas de la cascada de reclutamiento de leucocitos si se realiza en ratones knock-out específicas o en presencia de anticuerpos bloqueantes 6,9,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Los procedimientos en animales se realizaron de acuerdo con el Comité de Ética Institucional de Cuidado de Animales en Ginebra, Suiza y la Oficina Veterinaria Cantonal. Número de Autorización de GE / 63/14.
1. Preparación de una suspensión de células individuales a partir de médula ósea
- Sacrificio del ratón (8-12 semanas de edad) por dislocación cervical. Esterilizar patas traseras con etanol al 70%. Retire la piel de las patas traseras.
- Diseccionar fémures y tibias del ratón y eliminar el tejido de las piernas con un bisturí. Enjuague piernas con etanol al 90% y el lugar en una placa de cultivo lleno de PBS.
- Bajo el capó cultura, pañuelo de papel limpio de fémur y la tibia con un bisturí y se separan en articulación de la rodilla. Cortar los extremos de los huesos.
- Médula ósea Flush de cada hueso utilizando una aguja 23G y una jeringa de 1 ml llena con medio de preparación (fenol DMEM / F12 sin rojo, 1% de suero de rata), a unos 50 ml tornillo tubo. Interrumpir agregados celulares por delicadeza pases a través de la ne 23Gedle y una jeringa de 1 ml. Traiga volumen total de 25 ml con medio de preparación.
- Centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. Sobrenadante Descartar. Pellet Resuspender en 1 ml de glóbulos rojos tampón de lisis RBLC (8,3 g NH 4 Cl, 1 g de NaHCO 3, 1 ml de EDTA (100 mM), completa a 1 litro con agua destilada, filtro de 0,22 micras) en unos 15 ml tornillo tubo. Incubar 30 segundos en hielo.
- Añadir 10 ml de medio de preparación y centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender en 2 ml de medio de preparación.
2. neutrófilos Enriquecimiento por selección negativa
- Añadir 150 l de ratón cóctel enriquecimiento de neutrófilos (kit de plataforma de aislamiento de células tales como EasySep). Mezclar e incubar en hielo durante 10 min.
- Añadir 10 ml de fenol DMEM libre de rojo. Invertir una vez y centrifugar 250 xg, 3 min, 4 ° C.
- Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet en 1,75 ml de medio de preparación en 5 ml de poliestireno ronda tubos de fondo. Añadir 250 l BiotCóctel en Selección. Mezclar e incubar en hielo durante 10 min.
- Vortex las partículas magnéticas (del kit de plataforma de aislamiento de células) durante 30 segundos para volver a suspender las partículas. Añadir 500 partículas magnéticas mu l a la suspensión celular. Mezclar e incubar en hielo durante 10 min.
- Coloque el tubo en el imán. Espere 3 min.
- Invertir el imán a un nuevo 5 ml de poliestireno ronda tubos de fondo para recoger las células no marcadas deseadas. No tome la última gota que cuelga en el tubo. Las células no deseadas se mantendrán en el tubo en el interior del imán. Deseche este tubo en un peligros biológicos.
- Coloque el nuevo tubo en el imán. Espere 3 min.
- Invertir el imán a un nuevo tubo de 15 ml de tornillo para recoger las células no marcadas deseadas. No tome la última gota que cuelga en el tubo.
- Volumen completa a 5 ml con rojo fenol libre de DMEM.
3. El etiquetado de los neutrófilos
- Añadir 0,5 l de un tinte de color naranja como la célula Rastreador de Orange (concentración de trabajo1 M, CMRA - clorometil-rodol-acetato, madre 10 mM en DMSO). Incubar 2 minutos a 37 ° C.
- Añadir 2,5 ml de medio de preparación. Centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet en 1 ml de medio de preparación en un tubo de 1,5 ml.
- Tomar una alícuota de contar con hematocitómetro.
- Incubar 5 minutos a 37 ° C. Centrífuga 250 xg, 5 min, 4 ° C.
- Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet en 1 ml de PBS. Centrifugar 250 xg, 5 min, 4 ° C para lavar.
- Sobrenadante Descartar. Resuspender pellet como 10x10 6 células por 100 l de PBS. Mantenga en hielo hasta que la inyección iv. NOTA: Las células tienen que ser iv inyecta lo más rápidamente posible. 6-12x10 6 neutrófilos / ratón se obtienen por lo general.
4. Preparación del ratón por Microscopia intravital
NOTA:.. Paso 4.1) y 4.2) se debe realizar al comienzo del experimento para evitar tiempo de espera prolongado de los neutrófilos marcados en icmi.
- Pese la CX 3 CR1 ratón gfp (8-12 semanas de edad).
- Preparar 800 l de anestésicos ketamina (60 mg / kg, xilazina 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg en PBS).
- Anestesiar el ratón. Ip inyección con 200 l / 20 g de ratón. Anestesia de control por los pies pellizcos y marcando la frecuencia respiratoria.
- Inyectar neutrófilos (10x10 6 células en 100 l de PBS) por vía intravenosa utilizando las venas de la cola laterales o del seno retro-orbital, a conveniencia del experimentador.
- Ponga el ratón en el cojín de calefacción y proteger los ojos con el gel ocular.
- Un cubreobjetos de vidrio (35 mm de diámetro) se coloca en una placa de cultivo tisular de 10 cm, que tiene un agujero de diámetro 30 mm. Uso de aceite es mantener la placa de cultivo de tejido en contacto con el cubreobjetos.
- Incisión en la piel del abdomen con unas tijeras para exponer el peritoneo. Incisión en el peritoneo con tijeras para exponer intestino.
- Añadir 200 l de PBS (pre-calentada a 37 ° C) en el pcavidad eritoneal. Tome el ratón en la mano y ponlo boca abajo, de modo que el intestino se sale de la cavidad peritoneal con una suave presión. Coloque el ratón en la placa de cultivo tisular.
- Deroll suavemente el intestino con bastoncillos de algodón esterilizado en el cubreobjetos con el fin de exponer los vasos mesentéricos.
- Cortar pañuelos de papel en bandas y mojar con 37 ° C PBS calentado. Inmovilizar el intestino con las piezas de pañuelos de papel para disminuir los movimientos resultantes de la peristalsis.
- Coloque la placa de cultivo de tejidos y el ratón dentro de la cámara de termostato 37 ° C en el escenario de la bandeja a medida del microscopio invertido. Introducir una jeringa que contiene anestésicos sc en la pata trasera. NOTA: Además, el ratón puede recibir oxígeno (0,5 L / min) con una máscara.
- Ratón de control para la anestesia por pellizco del dedo del pie y el control de la frecuencia respiratoria cada 30 min. Si es necesario, proporcionar un impulso de anestésicos (20 l) para mantener adecuadamente la anestesia. NOE: El secado de la vasculatura debe ser evitado. Por lo tanto, su humedad se mantiene mojando regularmente los pañuelos de papel utilizados para inmovilizar el intestino con 37 ° PBS calentado-C.
5. Medición de neutrófilos y monocitos Comportamiento en buques inflamadas in vivo utilizando Microscopia intravital
- Láseres Set de 488- y 561- en la potencia más baja necesaria para evitar fototoxicidad inducida por láser. En nuestros experimentos, es inferior a 0,5%. La intensidad de las buenas prácticas agrarias en monocitos y tinte de color naranja en los neutrófilos es tan brillante que normalmente 0,3% es suficiente. NOTA: Esto representa una potencia láser de 0,15 a 0,25 mW con nuestro sistema.
- Adquirir imágenes de 512 x 512 píxeles (es decir, 635 micras) en 2,2 segundos con un agujero de alfiler abierto con el objetivo seco del microscopio invertido 20X. Use un z-profundidad entre 10 y 20 micras, que asegura la señal suficiente con las potencias bajas láser.
NOTA: Por lo general, realizamos experimentos con un z-profundidad entre 12 y 1656; m. En el caso de cifras presentadas y películas, el Z-profundidad es de 20 micras. Contraste de fase permite la identificación de las paredes endoteliales y las imágenes se realiza en las venas mesentéricas. Dado que las células que patrullan mueven muy lentamente con una velocidad de 5 a 10 micras de / min 6, la grabación de un campo de interés cada 20 seg es satisfactoria. Con los ajustes descritos, la etapa motorizada permite la grabación de hasta 7 campos de interés al mismo tiempo. - Coloca el ratón y los vasos mesentéricos en la cámara de termostato del microscopio se les permite recuperarse de la preparación durante 30 minutos antes de la adquisición de la primera película. Durante este tiempo, elegir varios campos de interés. Centrarse en la superficie luminal del vaso más cercana al objetivo. Si es necesario, se aprovechan de la leve autofluorescencia del endotelio para ajustar el enfoque.
NOTA: La cirugía durante la preparación del ratón destaca ligeramente el endotelio. En consecuencia, laminados de los neutrófilos y/ o monocitos se pueden observar en la primera después de la preparación del ratón 15 min. - Grabar una primera película de 30 minutos bajo condiciones de estado estacionario, una imagen cada 20 segundos.
NOTA: El software adquiere cada campo de interés en 2,2 segundos y la platina motorizada se mueve automáticamente de un campo a otro. Se remonta a la primera posición dentro de 20 segundos durante los 30 minutos de la película de grabación. - Para iniciar la inflamación de los vasos de la sangre, añadir una gota de 20 l de PBS que contenía 100 mg de TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 12 directamente sobre los vasos fotografiados.
- Controlar el enfoque para cada campo de interés.
NOTA: Durante el curso de adquisición, siempre hay pequeños cambios de enfoque en el eje z. A pesar de 10 a 20 micras z la profundidad, esto puede resultar en una disminución de la intensidad de fluorescencia. Por lo tanto, reorientar manualmente cada campo de interés al final de cada película, si es necesario. Grabar películas durante 30 min períodos y hasta 3 horas paraTal después de la iniciación de la inflamación. - Al final del experimento, sacrificar ratón anestesiado por dislocación cervical.
6. Generación de archivos de película y Seguimiento de leucocitos
NOTA: El software de adquisición de Nikon genera .nd2 archivos, pero el siguiente procedimiento sería similar con otro software y marcas.
- Exportar archivos como serie tiff.
- Ir al software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importe la serie tiff. Cada canal como un archivo diferente.
- Aplicar un filtro de mediana con un radio de 2,0 píxeles para los canales verde y rojo para reducir el ruido de fondo (Proceso> Filtros> La mediana ...).
- Convertir archivos en binario (Proceso> Binary> Hacer binario). Habilitar el software para calcular el umbral para cada imagen.
- Combinar canales en una sola serie de imágenes (Imagen> Color> Combinar Canales ...). Seleccione los monocitos en el gradon canal, los neutrófilos en el canal rojo y la luz transmitida en el canal gris.
- Convertir imágenes apiladas en colores RGB (Imagen> Color> pila para RGB).
- Guardar archivo como .avi
- Los datos se importan y se compilan en el software Imaris (Bitplane). Los movimientos de los monocitos y los neutrófilos son entonces rastreados mediante el Asistente de Seguimiento Spot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El manuscrito describe un protocolo optimizado para controlar fácilmente el comportamiento de los monocitos y neutrófilos en las venas mesentéricas de ratones anestesiados en tiempo real. El uso de una cámara termostatizada-C 37 ° es obligatoria para mantener la temperatura del ratón y también debido al movimiento dependiente de la temperatura de los leucocitos. Preparación del ratón se muestra en la Figura 1. La Figura 2 muestra toda la zona visto bajo el microscopio. Luz transmitida permite la identificación de las venas mesentéricas (flecha roja) y arterias (flecha azul).
Tratamiento de imágenes adquiridas con archivos de película ImageJ software generado, como la película 1 y Movie 2. Figura 3 muestra los diferentes pasos de procesamiento de imágenes para el primer punto de la película de tiempo 1. Película 1 muestra el patrullaje de Ly6C monocitos bajos en condiciones estables , como previamente desdescribe 6,8,14 mientras que todos los neutrófilos están circulando en el torrente sanguíneo. No neutrófilos está patrullando la pared endotelial. Película 2 muestra el mismo campo de interés de 90 minutos después de la adición del TLR2 / TLR1 agonista Pam3CSK4 para iniciar localmente inflamación. En este caso, neutrófilos y monocitos son reclutados masivamente a la pared endotelial, que se escanean meticulosamente. Es importante señalar que la adición de un agonista de TLR induce cambios en la anchura de endotelio y, por consiguiente altera el foco del eje z. Por lo tanto, el enfoque debe ser controlada cuidadosamente después de la adición del agonista. Recopilación de datos en el software Imaris (Bitplane) permite el seguimiento de los leucocitos individuales utilizando el Asistente de seguimiento Spot. La figura 4 muestra los caminos de pista exactos de monocitos (verde) y neutrófilos (rojo) que patrullaban a lo largo del endotelio. Los datos se obtienen a partir del análisis de la película 2, es decir, 90 min después de la iniciación de inflammation. Seguimiento de trayectorias de leucocitos se puede exportar como archivos TIFF o archivos xls de obtener varias estadísticas tales como longitud de la pista, el desplazamiento, la duración o la velocidad.
Esta técnica ofrece una buena manera de controlar el comportamiento de los monocitos y neutrófilos al mismo tiempo, antes y después de la inflamación. Es posible rastrear el reclutamiento de estas células en el tiempo extra de la pared endotelial. La pérdida de enfoque en el eje z o incluso x / y desplazamiento puede ocurrir como consecuencia de los movimientos intestinales que arruinan el experimento. Película 3 ilustra esta preparación y adquisición fallado.
Figura 1. Preparación del ratón.
Las flechas negras indican el tejido humedecido-PBS utilizado para inmovilizar el intestino. Punta de flecha blanca indica la placa de cultivo tisular de 10 cm. T indica la etapa bandeja de aluminio a medida que encaja en el microscopio. Mesentérica vasos sanguíneos están muy bien expuestos en el centro en el cubreobjetos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Las ramas de las venas y arterias mesentéricas.
Imágenes (20 x 10) tomadas con un objetivo 10X se cosen para constituir un solo gran imagen de la superficie disponible. Varios campos de interés son entonces elegidos para vigilar el movimiento de leucocitos con un objetivo 20X. La flecha roja indica una vena mesentérica. La flecha azul indica una arteria mesentérica. La flecha verde indica que el tejido adiposo que rodea los vasos. El área oscura en los lados de los resultados de imagen procedentes de la presencia de tejido humedecido utiliza para inmovilizar el intestino. Barra blanca escala representa 1 mm.k "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Tratamiento de imágenes con ImageJ.
Las diferentes etapas de procesamiento de imágenes se ilustran por primera imagen de la película 1. Verdes (monocitos) y (neutrófilos) canales rojo se procesan por separado. Para los datos en bruto original (A), se aplica un filtro de mediana (B) y luego se convierte en una imagen binaria (C). (D) Los canales se combinan en una imagen final. Líneas verdes o rojos observados en los datos brutos son células que se mueven tan rápido que el microscopio no es capaz de adquirirlas en su totalidad. Barra blanca escala representa 40 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. individualpistas de leucocitos.
Pistas de monocitos (A) y neutrófilos (B) que patrullaban el endotelio se procesan con Imaris Software (Bitplane). Barra blanca escala representa 40 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1. Leucocitos escaneando la pared endotelial en el estado estacionario. En el estado estacionario, Ly6c monocitos bajos patrullan el endotelio. Los neutrófilos están circulando de acuerdo con el flujo de sangre. Los neutrófilos son en rojo y monocitos están en verde. La barra de escala representa 50 micras. Generado con el objetivo 20X. Haga clic aquí para ver el vídeo.
ge = "always"> 
2:. Leucocitos el escaneo de la pared endotelial después de la inflamación mediada por TLR2 mismo campo de interés como en película 1. película comienza 90 min después de la adición de 20 l de PBS que contenía 100 g de Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 agonista) directamente sobre el recipiente. Monocitos y neutrófilos reclutados están escaneando meticulosamente la pared endotelial. Los neutrófilos son en rojo y monocitos están en verde. La barra de escala representa 50 micras. Por favor haga clic aquí para ver el vídeo.
Movie 3: Los resultados obtenidos de la preparación del ratón incorrecta Movimiento de barcos obtenidos cuando la anestesia o la inmovilización del intestino son incorrectos.. La barra de escala representa 50 micras.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver el vídeo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las metodologías descritas en este manuscrito proporcionan un enfoque coherente para estudiar de manera eficiente los monocitos y el comportamiento de los neutrófilos en las venas mesentéricas bajo condiciones de estado estacionario e inflamatorias.
El paso crucial de la preparación es la inmovilización del intestino con tejidos contacto con el medio PBS. Si se realiza correctamente, los vasos mesentéricos están muy bien expuestos en el cubreobjetos para la adquisición de imágenes. Esto permite la selección de varios campos de interés para monitorear el comportamiento de leucocitos en las venas mesentéricas.
Nuestro protocolo implica la exteriorización de vasos mesentéricos antes del inicio de los experimentos, lo que permite (1) para inducir directamente la inflamación en los vasos monitorizados, y (2) para registrar los puntos de tiempo tempranos después de la estimulación y (3) para el seguimiento de la cinética de reclutamiento de leucocitos y su comportamiento en el mismo recipiente antes y después de la inducción de la inflamación.
Nos transfer neutrófilos purificados a partir de médula ósea murina del mismo fondo genético y no de la sangre a medida que más células pueden obtenerse por animal (6-12x10 6 vs 0.5-2x10 6 / ratón). Si se prefiere el uso de los neutrófilos de la sangre, el mismo protocolo puede llevarse a cabo para la purificación de células.
En intravital de imágenes, la visualización de la vasculatura está activado por la luz transmitida en el caso de los vasos mesentéricos. Alternativamente, los anticuerpos fluorescentes contra PECAM1 (clon 390) o dextrano de alto peso molecular fluorescente peso (70 kDa o 2 MDa) 6,14 pueden ser inyectados iv para detectar la vasculatura. Por ejemplo, se informó de inyección intra-escrotal de 3 g anti-PECAM1 (clon 390) para permitir la detección vasculatura con bajo fondo y no afectar a la actividad de leucocitos en el modelo cremáster 9. En comparación con la luz transmitida, el uso de anticuerpos o colorantes fluorescentes introduce en particular la posibilidad de la reconstrucción en 3D de la Vasculatura, pero un canal se sacrifica a su etiquetado y se aumenta el tiempo de adquisición. Luz transmitida es suficiente en el modelo mesenter gracias a la transparencia de la vasculatura, como se describe aquí. Por el contrario, el marcaje fluorescente de la vasculatura es obligatorio en la dermis del oído u órganos opacos.
La detección de las poblaciones de leucocitos se puede lograr utilizando animales transgénicos que exhiben fluorescencia endógena en tipos específicos de células (monocitos Cx 3 CR1 eGFP / p 6 o CFP 15 o CD68 gfp 16 CD115; monocitos y neutrófilos Lys eGFP 9; y plaquetas CD41 YFP 17) . Aunque CX3CR1 se expresa en todos los monocitos y algunos subconjuntos de células NK y T, el CX 3 CR1 eGFP / peso ratón es interesante para distinguir entre inflamatoria Ly6C <sup> altos monocitos que presentan menos fluorescencia de GFP que Ly6C residente bajas monocitos 6. Como CD115 es específico de la línea monocítica, el MacBlue ratón CD115 PPC es un modelo interesante. Sin embargo, no es posible distinguir Ly6c alto y Ly6c monocitos bajos.
Una alternativa a los ratones transgénicos fluorescentes es la inyección iv de anticuerpos fluorescentes para etiquetar las poblaciones de leucocitos en tiempo real. Por ejemplo, los monocitos pueden ser etiquetados con anti-CD115 (clon AFS98), neutrófilos con anti-Ly6G (clon 1A8) y plaquetas con anti-CD49b (clon HMα2). En general, todos estos anticuerpos están agotando a alta dosis. Por lo tanto, deben ser utilizados con precaución por un período breve de veces y en niveles bajos. Cabe señalar que incluso a dosis bajas, un impacto en la función celular no puede ser descartada. La experiencia personal con cantidades bajas (1.2 mg) permite el etiquetado de CD115 + lunocytes y neutrófilos Ly6G + sin agotamiento (datos no publicados).
Aunque el modelo de la vasculatura del oído dermis no es invasivo como el oído está intacta, la profundidad de la dermis del oído es una preocupación, que hace que sea un modelo más adecuado para microscopía 2-fotón 13. Además, no es posible estimular directamente el recipiente en el modelo de oído sin perturbar físicamente la preparación.
Nuestro protocolo se puede aplicar con cualquier microscopio confocal invertido. Puesto que la velocidad de escaneo y la potencia del láser son dependiente de la máquina, la adquisición de un cuadro (512 x 512 píxeles, es decir, 635 m) en un solo plano z requiere aproximadamente 2,2 seg con nuestros ajustes para el escáner galvano de la Nikon A1R. Por desgracia, esta baja velocidad limita la posibilidad de grabar películas de cuatro dimensiones de las venas mesentéricas sin pérdida de calidad. El escáner de resonancia de la A1R ofrece una alta velocidad de adquisición, aunque elcalidad de las imágenes se reduce fuertemente (fondo frente señal específica) para nuestros experimentos con el CX 3 CR1 gfp / peso ratón. Se debe tener en cuenta que los láseres se fijan a inferior al 0,5% (<0,25 mW) para evitar la fototoxicidad y blanqueo.
Woodfin et al logró adquirir películas en 4D (imágenes 60 z-stack en 40 segundos) de vénulas cremaster utilizando una Leica TCS SP5-9. Como los autores valores de la imagen de 20 a 40 micras de diámetro, que probablemente son menos sensibles a los cambios de enfoque que en nuestro modelo (vigilancia de las venas mesentéricas de 200 a 400 micras). Cuando la formación de imágenes de tejidos en directo, control de enfoque es la preocupación más importante, lo que restringe la posibilidad de grabar una película única que dura varias horas. Consideramos que la grabación de películas que duran 30 minutos (o 45 minutos) es el más práctico en el modelo mesentérica.
La adición de los agonistas de TLR altera la anchura recipiente y por lo tanto el enfoque. Por consiguiente,es muy difícil de imagen correctamente los primeros 10-15 min después de la estimulación hasta que los vasos se estabilizan.
Otra limitación es la duración del experimento. Debido a la dificultad para mantener el ratón anestesiado adecuadamente durante un largo período de tiempo, es difícil de imagen más de 4 horas después de la inflamación. El uso de otros anestésicos, tales como la inhalación de isoflurano continua, podría ser una opción (aunque no probado por nosotros).
En los ratones de edad (más de 16 semanas de edad), aumento de la cantidad de depósitos de grasa alrededor de los vasos disminuir la calidad de la visualización de los vasos mesentéricos. Por lo tanto, es mejor llevar a cabo experimentos con ratones de 8-12 semanas de edad.
Esta técnica se puede combinar con la inyección iv de anticuerpos para bloquear moléculas de interés o agotar poblaciones de leucocitos dadas, por lo que la importancia de las moléculas implicadas en el reclutamiento de leucocitos o el comportamiento se puede determinar. Además,otros subconjuntos de leucocitos pueden ser rastreados utilizando otras cepas de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en las poblaciones de células de interés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
