Abstract
Effiziente Immunantwort ist abhängig schnelle Mobilisierung von Blut Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Untersuchung Leukozytenmigration in vivo ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Basis der Leukozyten transendotheliale Migration und Interaktion mit Gefäßendothel. Ein leistungsfähiger Ansatz beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine in Zellen von Interesse.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Bildgebung Monozyten und Neutrophilen im CX 3 CR1 gfp / wt-Maus iv mit orangefarbenen Farbstoff markierten Neutrophilen mit einem invertierten konfokalen Mikroskop injiziert. Zeitraffer-Filme gesammelt von 30 Minuten bis zu mehreren Stunden der Bildgebung ermöglicht die Analyse von Leukozyten-Verhalten in Mesenterialvenen unter beiden stationären und entzündlichen Erkrankungen. Wir beschreiben auch die Schritte, um vor Ort zu induzieren Entzündung der Blutgefäße mit TLR2 / TLR1 Agonist Pam3SK4 und Überwachung der subsequent Rekrutierung von Neutrophilen und Monozyten.
Die vorgestellte Technik kann auch verwendet werden, um andere Populationen von Leukozyten zu überwachen und zu untersuchen, Moleküle mit anderen Reizen oder transgenen Mäusen in Leukozytenrekrutierung oder Menschenhandel in Verbindung gebracht werden.
Introduction
Neutrophilen und Monozyten sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die kontinuierlich im Blut zirkulieren. Nach Verletzung oder Infektion, Entzündungssignale induzieren Leukozyten-Diapedese in beschädigte und infizierten Geweben, die hierin Initiieren eine zelluläre Immunantwort 1-3. Die Schnelligkeit der Mobilisierung von Leukozyten bestimmt das positive Ergebnis der Immunantworten. Diese komplizierte Prozesse stützen sich auf spezifische Moleküle (zB Selectine, Endothel-gebundenen Chemokine) auf der entzündeten Endothel vorhanden, die für die Einrichtung von Klebe Kontakte zwischen zirkulierenden Leukozyten und dem Endothel 1-3 .Um Erkenntnisse über die Moleküle in der Leukozyten beteiligt Hilfe bekommen Einstellungskaskade ist es wichtig, um die Kinetik der Zellrekrutierung zu visualisieren und das Verhalten der einzelnen Zelle / Population verfolgen. Eine wirksame Methode beinhaltet Intravitalmikroskopie an transgenen Mäusen, fluoreszierende Proteine in Zellen von Interesse.
Inhalt "> Bis heute wurden mehrere Ansätze mit Intravitalmikroskopie, um Bild entwickelt das Gefäßsystem 4,5. So wurde beispielsweise bildgebende Ohr Dermis Gefäßsystem oder Mesenterialvenen von Intravital konfokale Mikroskopie verwendet, um das Verhalten der Mäuse-Patrouillen Ly6C niedrigen Monozyten und menschliche identifizieren CD14 dim CD16 + Monozyten auf der luminalen Seite der Blutgefäße unter stationären Bedingungen 6-8. Die Maus Cremaster Gefäßmodell wird häufig verwendet, um das Verhalten von Neutrophilen oder entzündlichen Ly6C Hoch Monozyten unter entzündlichen oder ischämischen Bedingungen in transgenen Mäusen zu überwachen. In der Fall wird Cremaster über intrascrotal Injektion von IL1β, CCL2, TNFß oder fMLP stimuliert. Nach 2-4 Stunden, Gewebe werden dann chirurgisch nach außen verlagert und durch Intravitalmikroskopie 9-11 analysiert konfokalen.Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um Monozyten und Neutrophile gleichzeitig mit jedem Monitorinvertierten Fluoreszenz konfokalen Mikroskop. Außerdem Details unserer Methode zur Darstellung von demselben Schiff vor (Beharrungszustand) und nach Entzündungen und wie man die Kinetik der Rekrutierung von Leukozyten zu folgen. Zu diesem Zweck verwenden wir die CX 3 CR1 gfp / wt-Maus, deren Monozyten exprimieren eGFP, IV mit einem orangen Farbstoff-markierten Maus-Neutrophilen injiziert. Unter Verwendung eines invertierten konfokalen Mikroskop ist es möglich, (1) zu verfolgen und zu analysieren, die Patrouillen Ly6C niedrigen Monozyten unter stationären Bedingungen und (2), um die Einstellung beider Monozyten und Neutrophilen im gleichen Gefäß nach dem lokale Entzündung zu folgen. Hier schaffen wir die entzündlichen Erkrankungen mit Hilfe der TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 12. Darüber hinaus können solche Bildern dienen, die die Rolle von spezifischen Molekülen von Interesse in den verschiedenen Schritten der Leukozytenrekrutierung Kaskade bestimmen, ob auf bestimmten Knock-out-Mäusen oder in Gegenwart eines blockierenden Antikörpern 6,9,13 geführt.
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Protocol
HINWEIS: Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der institutionellen Ethikkommission der Animal Care in Genf, die Schweiz und die kantonalen Veterinäramt durchgeführt. Zulassungsnummer GE / 63/14.
1. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus dem Knochenmark
- Sacrifice Maus (8-12 Wochen alt) durch Genickbruch. Sterilisieren Sie die Hinterbeine mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Haut vor den Hinterbeinen.
- Sezieren Maus Oberschenkelknochen und Schienbeinknochen und Gewebe zu entfernen von den Beinen mit einem Skalpell. Beine mit 90% Ethanol und Ort Spülen in eine Kulturschale mit PBS gefüllt.
- Unter dem Kultur Kapuze, sauberen Tuch ab Oberschenkelknochen und Schienbeine mit einem Skalpell und separatem am Kniegelenk. Abgeschnitten jedes Ende der Knochen.
- Flush Knochenmark aus jedem Knochen Verwendung einer 23G Nadel und einer 1 ml Spritze mit Präparationsmedium (Phenolrot-freiem DMEM / F12, 1% Rattenserum) gefüllt ist, in einen 50 ml Schneckenrohr. Stören Zellaggregate durch zart Passage durch die 23G needle und eine 1 ml-Spritze. Bringen Gesamtvolumen auf 25 ml mit Präparationsmedium.
- Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C. Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml Lyse der roten Blutkörperchen RBLC Puffer (8,3 g NH 4 Cl, 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), vollständig auf 1 l mit destilliertem Wasser, das Filter von 0,22 um) in einem 15 ml Schraubenrohr. Inkubieren Sie 30 Sekunden auf Eis.
- 10 ml Herstellungsmedium und Zentrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendieren in 2 ml Herstellungsmedium.
2. Neutrophilen-Anreicherung durch negative Selektion
- Fügen Sie 150 ul Maus-Neutrophilen-Anreicherungscocktail (Zellisolation Plattform-Kit wie EasySep). Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min.
- 10 ml Phenolrot-freiem DMEM. Kehren Sie sofort und Zentrifuge 250 xg, 3 min, 4 ° C.
- Überstand verwerfen. Pellet in 1,75 ml Herstellungsmedium in 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen. Fügen Sie 250 ul Biotin Auswahl Cocktail. Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min.
- Mischen Sie den magnetischen Partikeln (aus der Zellisolation Plattform-Kit) für 30 Sekunden, um Partikel zu resuspendieren. Gib 500 & mgr; l magnetischen Teilchen an Zellen in Suspension. Mischen und Inkubation auf Eis für 10 min.
- Das Röhrchen wird in den Magneten. 3 min warten.
- Kehren Sie die Magneten auf eine neue 5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen, um die gewünschten unmarkierten Zellen zu sammeln. Nehmen Sie nicht den letzten Tropfen hängen in der Röhre. Unerwünschte Zellen wird in dem Rohr innerhalb des Magneten bleibt. Entsorgen Sie diesen Schlauch in einem biohazard Abfälle.
- Setzen Sie die neue Röhre in den Magneten. 3 min warten.
- Kehren Sie die Magneten auf ein neues 15 ml Schraubenrohr, um die gewünschten unmarkierten Zellen zu sammeln. Nehmen Sie nicht den letzten Tropfen hängen in der Röhre.
- Komplette Volumen auf 5 ml mit Phenolrot-freiem DMEM.
3. Kennzeichnung von Neutrophilen
- Mit 0,5 ul einer orangen Farbstoff wie Zell Tracker Orange (Arbeitskonzentration1 & mgr; M, CMRA - Chlormethyl-Rodol-Acetat, Lager 10 mM in DMSO). Inkubieren 2 min bei 37 ° C.
- In 2,5 ml Herstellungsmedium. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C.
- Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml Herstellungsmedium in einem 1,5-ml-Röhrchen.
- Einen aliquoten mit Zählkammer zählen.
- Inkubiere 5 min bei 37 ° C. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C.
- Überstand verwerfen. Pellet in 1 ml PBS. Zentrifuge 250 · g, 5 min, 4 ° C zu waschen.
- Überstand verwerfen. Pellet als 10x10 6 Zellen pro 100 & mgr; l PBS. Halten Sie auf Eis, bis iv Injektion. HINWEIS: Die Zellen werden iv injiziert, so schnell wie möglich. 6-12x10 6 Neutrophile / Maus sind in der Regel erhalten.
4. Maus Vorbereitung Intravitalmikroskopie
HINWEIS:.. Schritt 4.1) und 4.2) sollte zu Beginn des Experiments durchgeführt, um längere Wartezeit von markierten Neutrophilen zu vermeiden ice.
- Wiegen Sie die CX 3 CR1 GFP-Maus (8-12 Wochen alt).
- Vorzubereiten 800 ul von Anästhetika (Ketamin 60 mg / kg, Xylazin 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg in PBS).
- Anesthetize Maus. Injektion ip mit 200 & mgr; l / 20 g Maus. Steuer Anästhesie durch Zehen Kneifen und durch Überprüfung der Atemfrequenz.
- Injizieren Neutrophilen (10x10 & sup6; Zellen in 100 ul PBS) intravenös über die laterale Schwanzvene oder den retro-orbitalen Sinus, auf den Komfort des Experimentators.
- Setzen Sie die Maus auf Heizkissen und die Augen mit Augen Gel schützen.
- Ein Deckglas (35 mm Durchmesser) wird in einem 10 cm Gewebekulturschale, die einen Durchmesser von 30 mm Loch setzen. Verwendung Öl wird der Gewebekulturschale in Kontakt mit dem Deckglas zu erhalten.
- Einzuschneiden Bauchhaut mit einer Schere, um das Bauchfell aus. Einzuschneiden Peritoneum mit einer Schere auf Darm freizulegen.
- Zugeben von 200 & mgr; l PBS (auf 37 ° C vorgewärmt) in die peritoneal Höhle. Nehmen Sie die Maus in der Hand und drehen Sie sie nach unten, so dass der Darm steigt aus der Bauchhöhle mit einem sanften Druck. Platzieren Sie die Maus in der Gewebekulturschale.
- Deroll vorsichtig den Darm mit sterilisierten Wattestäbchen auf das Deckglas, um die Mesenterialgefäße aussetzen.
- Schneiden Sie Papiertaschentücher in Bands und benetzen sie mit 37 ° C erhitzt PBS. Immobilisieren den Darm mit den Stücken von Papiertaschentüchern, um die Bewegungen von Peristaltik resultierenden verringern.
- Legen Sie die Gewebekulturschale und die Maus in den 37 ° C temperiert Kammer auf die maßgeschneiderten Fach Stufe der inversen Mikroskop. Einführung einer Spritze mit Betäubungsmittel sc in das Hinterbein. HINWEIS: Zusätzlich kann die Maus Sauerstoff (0,5 L / min) mit einer Maske erhalten.
- Kontroll-Maus für die Anästhesie durch Zehen kneifen und die Kontrolle der Atemfrequenz alle 30 min. Bei Bedarf liefern einen Schub von Anästhetika (20 ul) auf die Anästhesie richtig pflegen. NICHTE: Das Trocknen des Gefäßsystems zu vermeiden. Daher ist seine Feuchtigkeit durch regelmäßige Benetzung der verwendet wird, um den Darm mit 37 ° C wärmten PBS immobilisieren Papiertaschentücher gehalten.
5. Messung der Neutrophilen und Monozyten Verhalten in Entzündete Gefäße in vivo unter Verwendung von Intravitalmikroskopie
- Set Laser 488- und 561- auf dem niedrigsten Leistungs notwendig, laserinduzierte Phototoxizität zu vermeiden. In unseren Versuchen ist es niedriger als 0,5%. Intensität der GFP in Monozyten und orangen Farbstoff in Neutrophilen ist so hell, dass in der Regel 0,3% ist genug. ANMERKUNG: Dies entspricht einer Laserleistung von 0,15 bis 0,25 mW mit unserem System.
- Erwerben Sie Bilder von 512 x 512 Pixeln (dh 635 & mgr; m) in 2,2 sec mit einem offenen Lochblende unter Verwendung der 20X Trockenziel der inversen Mikroskop. Verwenden Sie einen z-Tiefe zwischen 10 bis 20 um, die eine ausreichende Signal mit den niedrigen Laserleistungen gewährleistet.
HINWEIS: Wir in der Regel führen Experimente mit einem z-Tiefe zwischen 12 und 1656; m. Im Falle der dargestellten Zahlen und Filme, die z-Tiefe 20 um. Phasenkontrast ermöglicht die Identifizierung von endothelialen Wandungen und Abbilden auf Mesenterialvenen geführt. Seit patrouillieren Zellen bewegen ganz langsam mit einer Geschwindigkeit von 5 bis 10 & mgr; m / min 6, Aufzeichnung eines Interessengebiet alle 20 sec ist zufriedenstellend. Mit den beschriebenen Einstellungen, ermöglicht es dem Motortisch die Aufnahme von bis zu 7 Interessengebieten gleichzeitig. - Platzieren Sie die Maus und die Mesenterialgefäße in der Thermostatkammer des Mikroskops werden es ihnen ermöglichen, von der Vorbereitung für 30 Minuten vor dem Erwerb des ersten Films zu erholen. Während dieser Zeit, wählen Sie mehrere Felder in der Umgebung. Konzentrieren sich auf die luminale Oberfläche des Behälters in der Nähe des Ziels. Falls erforderlich, die Vorteile der leichten Autofluoreszenz des Endothels, um den Fokus einzustellen.
HINWEIS: Chirurgie während der Maus Vorbereitung etwas betont die Endothel. Folglich rollt von Neutrophilen und/ oder Monozyten in den ersten 15 Minuten nach der Zubereitung der Maus beobachtet werden. - Nehmen Sie einen ersten Film für 30 min unter stationären Bedingungen, ein Bild alle 20 sec.
Hinweis: Die Software übernimmt jedes Interessengebiet in 2,2 s und die Motortisch fährt automatisch von einem Feld zum anderen. Es geht während der 30 min der Aufzeichnungsfilm zurück in die erste Position innerhalb von 20 sec. - Zur Entzündung der Blutgefäße zu initiieren, einen Tropfen von 20 ul PBS, das 100 ug TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 12 direkt auf die abgebildeten Gefäße.
- Steuern Sie den Fokus für jedes Feld von Interesse.
Hinweis: Im Verlauf der Übernahme, es gibt immer geringfügige Änderungen des Fokus auf der z-Achse. Trotz der 10-20 um z-Tiefe kann dies zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität führen. Daher manuell jedes Interessengebiet am Ende jedes Films zu konzentrieren, wenn nötig. Nehmen Sie die Videos für 30 Minuten-Zeiträumen und bis zu 3 h auftal nach Beginn der Entzündung. - Am Ende des Experiments zu opfern anästhesierten Maus durch zervikale Dislokation.
6. Generierung von Filmdateien und Verfolgung von Leukozyten
HINWEIS: Die Nikon Erfassungssoftware erzeugt .nd2-Dateien, aber die folgende Vorgehensweise wäre ähnlich mit anderer Software und Marken sein.
- Export-Dateien als TIFF-Serie.
- Zum ImageJ Software (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Importieren Sie das tiff-Serie. Jeder Kanal als eine andere Datei.
- Tragen Sie eine Medianfilter mit einem Radius von 2,0 Pixel für den grünen und roten Kanälen, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren (Process> Filter> Median ...).
- Dateien zu konvertieren in binäre (Process> Binary> Make Binary). Kann die Software den Schwellenwert für jedes Bild zu berechnen.
- Merge-Kanälen zu einem Bild-Serie (Bild> Farbe> Merge Kanäle ...). Wählen Sie die Monozyten im green-Kanal, die Neutrophilen im roten Kanal und das durchgelassene Licht in der Grau Kanals.
- Konvertieren gestapelten Bildern in RGB-Farben (Bild> Farbe> Stapeln zu RGB).
- Datei speichern unter .avi
- Die Daten werden importiert und in Imaris Software (Bitplane) zusammengestellt. Bewegungen von Monozyten und Neutrophile werden dann mit Hilfe der Spot-Tracking-Wizard verfolgt.
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Representative Results
Das Manuskript beschreibt ein optimiertes Protokoll einfach das Verhalten von Monozyten und Neutrophilen in den Mesenterialvenen der narkotisierten Mäusen in Echtzeit überwachen. Die Verwendung eines 37 ° C-thermostatisierten Kammer ist obligatorisch, um die Temperatur der Maus erhalten und auch aufgrund der temperaturabhängigen Bewegung der Leukozyten. Vorbereitung der Maus ist in Abbildung dargestellt 1. Abbildung 2 zeigt die ganze Fläche unter dem Mikroskop zu sehen. Durchlicht ermöglicht die Identifizierung von Mesenterialvenen (roter Pfeil) und Arterien (blauer Pfeil).
Die Behandlung der aufgenommenen Bilder mit ImageJ Software generiert Film-Dateien, wie zB Video 1 und Video 2. Abbildung 3 zeigt die verschiedenen Schritte der Bildverarbeitung zum ersten Mal Punkt Film 1. Film 1 zeigt die Patrouillen der Ly6C niedrigen Monozyten unter stationären Bedingungen Wie zuvor debeschrieben 6,8,14 während alle Neutrophilen werden in den Blutkreislauf zirkulieren. Kein Neutrophilen patrouilliert die endotheliale Wand. Movie 2 zeigt die gleiche Interessengebiet 90 Minuten nach der Zugabe des TLR2 / TLR1 Agonist Pam3CSK4 um Entzündung lokal zu initiieren. In diesem Fall werden die Neutrophilen und Monozyten massiv auf die endotheliale Wand, die sie genau abzutasten rekrutiert. Es ist wichtig anzumerken, dass die Zugabe eines TLR Agonisten induziert Veränderungen in Endothel Breite und folglich ändert sich die Schwerpunkte der Z-Achse. Daher sollte der Schwerpunkt genau nach der Zugabe des Agonisten gesteuert werden. Zusammenstellung von Daten in Imaris Software (Bitplane) ermöglicht die Verfolgung einzelner Leukozyten unter Verwendung des Spot-Tracking-Wizard. Abbildung 4 zeigt den genauen Spurpfade von Monozyten (grün) und Neutrophilen (rot) patrouillieren entlang des Endothels. Die Daten werden aus der Analyse der Film 2, dh, 90 min nach dem Beginn der inf erhalten,lammation. Tracking von Leukozyten-Pfade können als TIFF-Dateien oder xls-Dateien, um verschiedene Daten wie Streckenlänge, Verschiebung, Dauer oder Geschwindigkeit zu erhalten exportiert werden.
Diese Technik bietet eine schöne Möglichkeit, das Verhalten von Monozyten und Neutrophilen zur gleichen Zeit vor und nach der Entzündung zu überwachen. Es ist möglich, die Rekrutierung dieser Zellen auf der endothelialen Wand Überstunden zu verfolgen. Verlust des Fokus auf der z-Achse oder x / y-Verschiebung kann als Folge von Darmbewegungen, die das Experiment ruinieren auftreten. Movie 3 zeigt eine solche fehlgeschlagen Herstellung und Erfassung.
Abbildung 1. Maus Vorbereitung.
Schwarze Pfeile zeigen PBS benetzten Gewebe verwendet werden, um den Darm zu immobilisieren. Weiß Pfeilspitze zeigt die 10 cm Gewebekulturschale. T gibt die Aluminium maßgeschneiderte Fach Bühne, die in das Mikroskop passt. Mesenterialen Blutgefäße sind schön in der Mitte auf dem Deckglas ausgesetzt sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Zweige der mesenterialen Venen und Arterien.
Bilder (20 x 10) mit einer 10X-Objektiv aufgenommen wurden genäht, um ein großes Bild der verfügbaren Fläche zu bilden. Mehrere Interessengebiete werden dann ausgewählt, um Leukozyten-Bewegung mit einem 20x-Objektiv zu überwachen. Der rote Pfeil zeigt eine mesenterica. Der blaue Pfeil zeigt eine Mesenterialarterie. Der grüne Pfeil zeigt die um die Gefäße Fettgewebe. Der dunkle Bereich an den Seiten der Bildergebnisse aus dem Vorhandensein von benetzten Gewebe verwendet, um den Darm zu immobilisieren. Weiß Maßstab stellt 1 mm.k "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Bildverarbeitung mit ImageJ.
Die unterschiedlichen Schritte der Bildverarbeitung für das erste Bild des Films 1. Green (Monozyten) und Rot (Neutrophile) Kanäle separat verarbeitet dargestellt. Den ursprünglichen Rohdaten (A) wird ein Medianfilter angewendet (B) und dann in ein binäres Bild (C) umgewandelt. (D) Die Kanäle werden in eine endgültige Bild zusammengeführt. In Rohdaten beobachtet grüne oder rote Linien sind Zellen, die sich so schnell bewegt, dass das Mikroskop nicht in der Lage, vollständig zu erwerben ihnen sind. Weiß Skala Balken stellt 40 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. IndividuelleLeukozyten-Tracks.
Tracks von Monozyten (A) und Neutrophilen (B) patrouillieren die Endothel sind mit Imaris Software (Bitplane) verarbeitet. Weiß Skala Balken stellt 40 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1. Leukozyten Scannen des endothelialen Wand im stationären Zustand. Im eingeschwungenen Zustand Ly6C niedrigen Monozyten patrouillieren das Endothel. Neutrophile werden nach der Blutfluss zirkuliert. Neutrophile sind in rot und Monozyten sind in grün. Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m. Mit dem 20x-Objektiv erzeugt werden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
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. 2: Leukozyten Abtasten der endothelialen Wand nach TLR2-vermittelten Entzündung elbe Feld von Interesse, wie in Film 1. Film beginnt 90 min nach der Zugabe von 20 ul PBS enthaltend 100 ug Pam3CSK4 (TLR2 / TLR1 Agonist) direkt auf das Gefäß. Rekrutierte Monozyten und Neutrophile werden akribisch Scannen des endothelialen Wand. Neutrophile sind in rot und Monozyten sind in grün. Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
Movie 3: Ergebnisse von falschen Maus Herstellung anfallenden Bewegungen von Schiffen erhalten, wenn Anästhesie oder Ruhigstellung des Darmes sind falsch.. Maßstabsbalken entspricht 50 & mgr; m.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53314/Movie3.avi" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
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Discussion
Die in dieser Handschrift beschriebenen Methoden bieten einen konsistenten Ansatz für Monozyten und Neutrophilen Verhalten effizient studieren in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Erkrankungen.
Der entscheidende Schritt der Herstellung ist die Immobilisierung des Darms mit PBS-befeuchtete Tücher. Wenn sie richtig durchgeführt wird, werden Mesenterialgefäße schön auf dem Deckglas für die Bildaufnahme ausgesetzt ist. Dies ermöglicht die Auswahl von mehreren Bereichen von Interesse Leukozyten Verhalten in Mesenterialvenen überwachen.
Unser Protokoll beinhaltet die Entäußerung des Mesenterialgefäße vor Beginn der Experimente, so dass (1), um direkt zu induzieren Entzündung auf den überwachten Schiffe, und (2), um die frühen Zeitpunkten nach der Stimulation aufzuzeichnen und (3) im Anschluss an die Kinetik Rekrutierung von Leukozyten und deren Verhalten in dem gleichen Gefäß vor und nach Induktion der Entzündung.
Wir TRANSFer Neutrophilen gereinigt von Maus-Knochenmark aus dem gleichen genetischen Hintergrund und nicht aus dem Blut, da mehr Zellen pro Tier (6-12x10 6 vs 6 0.5-2x10 / Maus) gewonnen werden. Wenn die Nutzung Blutneutrophilen bevorzugt ist, kann dasselbe Protokoll für Zellreinigung durchgeführt werden.
Im intravital Bildgebung, ist die Visualisierung des Gefäßsystems durch das übertragene Licht in dem Fall Mesenterialgefäße aktiviert. Alternativ können fluoreszierende Antikörper gegen PECAM1 (Klon 390) oder fluoreszierende Molekulargewicht Dextran hohen (70kDa oder 2 MDA) 6,14 iv injiziert, um das Gefäßsystem zu erkennen. So wurde zum Beispiel intra-Hoden Injektion von 3 & mgr; g anti-PECAM1 (Klon 390) berichtet, Gefäßerkennung mit niedrigen Hinter ermöglichen und nicht an Leukozyten-Aktivität in der Cremaster-Modell 9 beeinflussen. Verglichen mit Durchlicht, die Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern oder Farbstoffe die Möglichkeit, 3D-Rekonstruktion des Vascu ua vorgesehen,gesetzgeber, aber ein Kanal zur Gewährleistung der Kennzeichnung getötet und die Erfassungszeit erhöht wird. Durchlicht ist in den mesenter Modell dank der Transparenz des Gefäßsystems aus, wie hier beschrieben. Im Gegenteil, ist die Fluoreszenzmarkierung des Gefäßsystems in der Ohr Dermis oder opak Organe zwingend.
Der Nachweis von Leukozyten-Populationen können mit transgenen Tieren, die endogene Fluoreszenz in spezifischen Zelltypen aufweisen (; Monozyten und Neutrophilen Lys eGFP 9; und Thrombozyten CD41 YFP 17 Monozyten CX 3 CR1 eGFP / wt 6 oder CD115 CFP 15 oder CD68 gfp 16) erreicht werden, . Obwohl CX3CR1 in allen Monozyten und einigen Untergruppen von T-Zellen, NK und cr1 eGFP / wt-Maus ausgedrückt, der CX-3 ist interessant, zwischen entzündlichen Ly6C <zu unterscheidensup> Hoch Monozyten, die weniger GFP-Fluoreszenz als Wohnsitz Ly6C niedrigen Monozyten 6 aufweisen. Wie CD115 ist spezifisch der Monozyten-Linie ist die MacBlue Maus CD115 GFP ein interessantes Modell. Es ist jedoch nicht möglich, Ly6C hohen und niedrigen Ly6C Monozyten unterscheiden.
Eine Alternative zu transgenen Mäusen ist die Fluoreszenz iv Injektion von fluoreszierenden Antikörpern, um die Populationen von Leukozyten in Echtzeit zu markieren. Zum Beispiel können Monozyten mit anti-CD115 (Klon AFS98), Neutrophile mit Anti-Ly6G (Klon 1A8) und Plättchen mit anti-CD49b (Klon HMα2) markiert werden. Im allgemeinen sind alle diese Antikörper in hohen Dosen abbau. Daher sollten sie mit Vorsicht zu kurzen Zeitraum von Zeiten und in geringen Mengen verwendet werden. Es sollte beachtet werden, dass auch bei niedriger Dosierung, eine Auswirkung auf die Zellfunktion kann nicht ausgeschlossen werden kann. Persönliche Erfahrung mit geringen Mengen (1-2 ug) ermöglicht die Etikettierung von CD115 + monocytes und Ly6G + Neutrophilen ohne Depletion (Daten nicht veröffentlicht).
Obwohl das Modell des Gehör Dermis Gefäßsystem ist nicht-invasiv, wie das Ohr unberührt, ist die Tiefe der Ohr Dermis ein Anliegen, was es macht ein Modell besser geeignet für 2-Photonen-Mikroskopie 13. Darüber hinaus ist es nicht möglich, das Gefäß in den Gehörmodell direkt stimulieren, ohne physisch stören die Herstellung.
Unser Protokoll kann mit jedem invertierten konfokalen Mikroskop eingesetzt werden. Da Scangeschwindigkeit und Laserleistung sind maschinenabhängig, den Erwerb eines Rahmens (512 x 512 Pixel, dh 635 & mgr; m) an einem einzigen z-Ebene erfordert etwa 2,2 sec mit unseren Einstellungen für die Galvanoscanner der Nikon A1R. Leider begrenzt dieser geringen Geschwindigkeit die Möglichkeit der Aufnahme vierdimensionalen Filme Mesenterialvenen ohne Qualitätsverlust. Die Resonanzscanner des A1R bietet eine hohe Erfassungsgeschwindigkeit, obwohl dieQualität von Bildern stark reduziert (Hintergrund gegenüber bestimmten Signal) für unsere Experimente mit dem CX 3 CR1 gfp / wt-Maus. Es sollte nicht vergessen, die Laser sind bei weniger als 0,5% (<0,25 mW) eingestellt, Phototoxizität und Bleich vermeiden gehalten werden.
Woodfin et al geschafft, Filme in 4D (60 Z-Stapel-Bildern in 40 sec) der Cremaster Venolen mit einem Leica TCS SP5-9 zu erwerben. Wie die Autoren Bildwerte von 20-40 & mgr; m im Durchmesser, sind sie wahrscheinlich weniger empfindlich gegenüber Änderungen im Fokus als in unserem Modell (Überwachung der Mesenterialvenen von 200-400 um). Bei der Abbildung lebendem Gewebe, die Kontrolle der Fokus ist das wichtigste Anliegen, das die Möglichkeit, einen einzigartigen Film über mehrere Stunden aufzeichnen einschränkt. Wir sind der Ansicht, dass die Aufnahme von Filmen dauerhafte 30 Minuten (oder 45 Minuten) ist die praktischste im mesenterialen Modell.
Die Zugabe von TLR-Agonisten verändert die Gefäßweite und somit den Fokus. Folglich,es ist sehr schwierig für Bild richtig ersten 10-15 Minuten nach der Stimulation, bis die Schiffe zu stabilisieren.
Eine weitere Einschränkung ist die Dauer des Experiments. Wegen der Schwierigkeit, die Maus richtig über einen langen Zeitraum anästhesiert aufrechtzuerhalten, ist es schwierig, Bild mehr als 4 h nach der Entzündung. Die Verwendung von anderen Anästhetika, wie kontinuierliche Isofluran Einatmen, könnte eine Option sein (obwohl von uns nicht getestet).
In alten Mäusen (über 16 Wochen alt), erhöhte Menge an Fettablagerungen um die Gefäße zu verringern, die Qualität der Visualisierung der Mesenterialgefäße. Daher ist es besser, Experimente mit 8-12 Wochen alten Mäusen ausgeführt.
Diese Technik kann mit der iv-Injektion von Antikörpern gegen interessierende Moleküle blockieren oder verarmen bestimmten Leukozyten-Populationen, so dass die Bedeutung von Molekülen in die Rekrutierung von Leukozyten oder Verhalten impliziert bestimmt werden kann kombiniert werden. Hinzu kommt noch,andere Leukozytenuntergruppen können mit anderen transgenen Maus-Stämme, fluoreszierende Proteine in Zellpopulationen von Interesse verfolgt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| Tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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