Abstract
Kvantitativt opfange udviklingsprocesser er afgørende for at udlede mekanistiske modeller og nøgle til at identificere og beskrive mutant fænotyper. Her protokoller præsenteres for udarbejdelsen embryoner og voksne C. elegans dyr til kort- og langsigtede time-lapse mikroskopi og metoder til sporing og kvantificering af udviklingsprocesser. De metoder, der præsenteres er alle baseret på C. elegans stammer rådighed fra Caenorhabditis Genetik Center og på open source-software, der let kan implementeres i alle laboratorier uafhængigt af mikroskopi, der anvendes. En rekonstruktion af en 3D-celle-form model ved hjælp af modellering software israelske forsvarsminister, manuel sporing af fluorescens-mærkede subcellulære strukturer ved hjælp af multi-purpose billede analyseprogram Endrov, og en analyse af kortikal kontraktile flow ved hjælp PIVlab (tidsopløst Digital Particle Billede Velocimetri Værktøj til Matlab) er vist. Det diskuteres, hvordan disse metoder kan også sættes ind to kvantitativt fange andre udviklingsprocesser i forskellige modeller, fx sporing og afstamning celle sporing, sporing af vesikel flow.
Introduction
Med den stadige forbedringer af fluorescerende proteiner, genom teknik, lysmikroskopi, og edb soft- og hardware, er det nu muligt at registrere udviklingen af mange modelorganismer på hidtil uset spatio-temporale opløsning. Dette gør det muligt for forskerne at stille spørgsmål, der ikke kunne løses tidligere eller til at gense kendte udviklingsprocesser for at søge efter oversete aspekter. Denne udvikling har udløst inden for kvantitative udviklingsmæssige biologi, som sigter mod at omdanne kvalitative, uformelle modeller i kvantitative modeller af grundige målinger og statistiske analyser.
Sporing celler og subcellulære strukturer har gjort det muligt at udlede kvantitative modeller for fosterudvikling, nervesystem aktivitet, eller celledeling 1-12. Ved at spore celledeling rester i den tidlige udvikling af C. elegans embryo, kunne vi for nylig afsløre, at de følger en stereoindtastet sti og udgør et vigtigt polariserende faktorer 13,14.
Her bliver protokoller præsenteres der gør kvantitativ udviklingsmæssige biologi tilgange tilgængelig for ikke-eksperter. Fokus ligger på tre straight-forward, frit tilgængelige værktøjer, der er implementeres i ethvert laboratorium, der har adgang til standard konfokal mikroskopi og computere. Disse omfatter en protokol til at generere 3D-celle figurer, en protokol til at spore celle division rester, og en protokol til kvantitativt at beskrive kortikale actomyosin dynamik. Nematoden C. elegans anvendes som et eksempel tilfældet, men de metoder og værktøjer, der gennemgås her, er velegnet til en række spørgsmål inden for andre biologiske modeller, f.eks dyrkede celler, vævseksplantater, organoids eller sfæroider, andre embryoner osv
Generelt nogle af analyserne er vist her, kan også udføres med den populære open source værktøj ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; eller Fiji, Den 'batterier' version af ImageJ, http://fiji.sc/Fiji), for hvilke mange plugins til forskellige kvantitative analyser er tilgængelige. Men de programmer, diskuteret her er designet til at løse specifikke problemer.
For det første israelske forsvarsminister, en billedbehandling, modellering og display suite kan bruges til 3D rekonstruktioner af serielle sektioner fra elektronmikroskopi eller lysmikroskopi 15. Israelske forsvarsminister indeholder også værktøjer til visning af 3D data fra hvilken som helst orientering. For det andet Endrov, et Java-program designet til at udføre billedanalyse, databehandling, og kommentering af netværk eller spor (bl.a.) på grundlag af en udvidet plugin arkitektur, med ImageJ plugin kompatibilitet 16. Den indeholder over 140 billeder-behandling, og en Extensible brugergrænseflade, hvor model og rådata vises separat. Dens kildekode kan findes på https://github.com/mahogny/Endrov. For det tredje, PIVlab, en MATLAB værktøj til digital partikel billedet Velocimetry, der giver brugeren mulighed for at kvantitativt og kvalitativt analysere partikelstrømmen felter 17. Brugen af denne programmer kræver en Matlab licens, der omfatter Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab er et program designet til kvantitativt at beskrive flow. Den beregner hastigheden distribution, størrelsesorden, vorticity, divergens, eller snitte inden billedfiler par eller serier. Til dette, er det cross-korrelerer små områder af billeder (kaldet "afleveringer" i protokollen sektionen) af et billede par for at udlede den mest sandsynlige partikel forskydning. Denne krydskorrelation giver et korrelation matrix, der kan analyseres i rummet eller frekvensdomænet under anvendelse af enten direkte krydskorrelation eller hurtig Fourier transformation (FFT), henholdsvis.
Udstyret bruges her er et inverteret mikroskop udstyret med en Nipkow (spinning) disk, en EMCCD, 488 og 561 nm standard fast-state lasere og 20x luft eller 40x eller 60x planen / Apochromat olie- eller vand-nedsænkning målsætninger. Det er imidlertid også muligt at udføre time-lapse billeddannelse med andre billeddannende modaliteter, fx punkt-, linie- eller plade-scanning laserbaseret mikroskopi, multi-foton mikroskopi, samt epi-fluorescensmikroskopi kombineret med udfoldning eller struktureret belysning. Fordelen ved at anvende en Nipkow disk system er den ekstremt hurtige billedoptagelse, især hvis en streaming-mode (kontinuerlig bevægelse og scanning af objektet i z dimension) er tilgængelig. Derudover, for at forbedre opløsning, en 1,5-fold forstørrelsesglas extender foran EMCCD anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af C. elegans Embryoner for Time-lapse mikroskopi hjælp Microbeads
- Overfør drægtige voksne orme ved anvendelse af en orm pick (platintråd) i en dråbe M9 buffer og rense ud bakterier ved først kraftigt omrøring og derefter overføre hvert orm til et tilstødende dråbe M9 hjælp øje lash monteret på en tandstikker / pipettespids eller brug en spids glaskapillar.
- Fortynd dispersion indeholdende de 20 um diameter polystyrenperler 10-fold i M9-puffer (1 L M9 buffer indeholder 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, og efter autoklavering (20 min, 120 ° C), der tilsættes yderligere 1 ml af en 1 M MgSO4-opløsning).
- Lav en mundpipette fra enhver form for tynd glaskapillar (f.eks Smeltepunkt kapillærer eller kapillærer anvendes til at trække injektionsnåle), en nogenlunde 0,5 m langt stykke af gummi, silikone eller lignende materiale slange (ideelt transparent), en 200 pipipettespids, låget på en 200 pi PCR-rør, et hydrofobt filter til små sprøjter (f.eks. en 0,2 til 0,45 um porestørrelse og 15-50 mm i diameter Nylon, PTFE eller et lignende materiale filter), og en 1000 pi pipettespids . Denne type mundpipette sikrer, at ingen biologisk materiale kan komme i kontakt med eksperimentatoren.
- Saml pipetten ved at indsætte 200 pi pipettespids med spidsen først i slangen og sæt den med låget af et PCR-rør, som har en central perforering, der matcher diameteren af kapillarrør anvendes. En meget bemærkes syl eller præparatet nål kan anvendes til at frembringe perforeringen.
- Tegn en tynd kapillarrør og indsætte det i perforeringen. Sæt filteret ind i den anden ende af røret og indsætte en 1000 pi pipettespids som mundstykke (figur 1).
- Dissekere drægtige voksne ved at skære orme på tværs ved vulva med en ren barberblad eller skalpel.
BEMÆRK: Normalt vil mange embryoner være expulsed efter opskæring. Men hvis tidlige embryoner er nødvendige, de nogle gange nødt til at blive frigivet fra kroppen ved hjælp af et øje lash eller spidse nål. - Pipette en dråbe af den fortyndede polystyren perle spredning (~ 4 pi) på en 24x60 mm dækglas og overføre embryoer ind i dette slip fra munden pipette.
- Placer forsigtigt en lille (fx 18x18 eller 20x20 mm) dækker glas på toppen af drop og sørg dråben har helt spredt ud.
BEMÆRK: Faldet skal også være lille nok til ikke at røre kanterne af det lille dæksel glas. - Forsegl mount med flydende vaseline. Tilføj en dråbe fordybelse olie på 24x60 mm dækglasset side og gå videre til den "Time-lapse Microscopy" sektionen.
2. Udarbejdelse af Voksen C. elegans Dyr for Time-lapse mikroskopi hjælp Nanobeads
BEMÆRK: Generelt protokollen til montering voksne dyr er en tilpasning af protokollen fra ref. 18.Med denne protokol, er det muligt at udføre langsigtet time-lapse konfokal mikroskopi af voksne dyr.
- Der fremstilles en 1,5% (w / v) agarose opløsning i M9-puffer, kog (1 min, 100 ° C i vandbad eller mikrobølge). Anvendelsen af højere koncentrationer af agarose ikke anbefales, da dette kan føre til ekstrudering af tarmen og / eller dele af gonaderne.
- Stick ned 2-3 lag tape på to objektglas hver. Placer et dias uden bånd mellem de to dias med tape.
- Brug en pipettespids og placere en dråbe af den varme agaroseopløsning i centrum af den midterste slide. Hurtigt placere andet dias på drop så det understøttes af båndlagene på hver side. Dette vil skabe en rund og flad agar pad på omkring 10 mm i diameter.
- Sætte en dråbe 100 nm perleopløsning (ufortyndet, som er 2,6% (w / v)) på puden. Overfør 1-10 rengøres voksne orme i dråbe med en orm pick. Seal med 18x18 mm dækglas og vaseline som forklaret i Protocol 1.
3. Time-lapse mikroskopi
- Put en dråbe fordybelse olie på mikroskopobjektglasset eller dækglasset sandwich. Brug brightfield ved lav forstørrelse (5x eller 10x objektiver) for at finde prøven.
BEMÆRK: Begræns eksponering for blåt lys så meget som muligt (især for C. elegans embryoner), f.eks, brug ikke epi-fluorescens mikroskopi for at finde / fokusere præparatet men brug brightfield stedet. - Skift til højere forstørrelse (40x eller 60x mål), bringe prøven i fokus (enten centrale plan eller top / bund fly af prøven, afhængigt af købet softwaren).
- Indstil prøveudtagning intervaller til 30 fly ved 1 um afstand indspillet hver 1min. Hvis en automatiseret xy- eller xyz-stadie er tilgængelig, kan optages flere pletter i en session. Skift til fluorescens billeddannelse og kontrollere fokus igen.
BEMÆRK: Prøv at undgå at bruge høje laser beføjelser, hellere bruge lidt længere eksponeringstiderved meget lave intensiteter. Mål erhvervet billeder med det samme, enten i billedet erhvervelse program eller i ImageJ at undgå mætning, hvilke afgrøder dynamikken spænder og betyder også overdreven stråling. - Start optagelse af time-lapse-serie.
BEMÆRK: For at udelukke at analysere artefakter, start med lange (3-10 min) tidsintervaller mellem prøve scanning og gradvist øge tidsmæssige prøvetagning til de ønskede intervaller. Udviklingsmæssige timing samt slutpunkter i begge tilfælde bør svare, når du udfører en statistisk analyse. Desuden er det ofte nødvendigt at vurdere fototoksicitet og overlevelsesrater. Derfor gendanne prøven fra mount efter langsigtede time-lapse mikroskopi og kontrollere, om de fortsætter med at leve udvikle /.
4. rekonstruere et 3D Cell Shape model med israelske forsvarsminister
BEMÆRK: israelske forsvarsminister software er tilgængelig fra Den israelske forsvarsminister webside: http://bio3d.colorado.edu/imod/. Installationen af softwaren er beskrived der. Når du bruger Windows OS, en Unix toolkit skal installeres, som også kan findes som en pakke på israelske forsvarsminister webside. Desuden er der en udmærket kompileret 3dmod introduktion til rådighed på israelske forsvarsminister webside (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).
- Åbn Unix shell og skriv "against". Den israelske forsvarsminister vindue vil åbne. Vælg filen med de rå data (ideelt set en stablet tif eller lignende), hvorfra man kan generere en 3D-model.
- Find bunden og toppen af objekterne i Zap-vinduet ved hjælp af oplysningerne vinduet (op & ned rulle værktøj).
- Begynd spore celle skitserer. Det er vigtigt, at hver celle er et formål. Begynd med den øverste plan hver celle og skabe den første kontur der ved hjælp af oplysningerne vinduet. Rul ned i z og skabe en ny kontur for hver z-planet.
- Gør det samme for så mange celler som nødvendigt at modellere i 3D. Glem ikke at oprette et nyt objekt, når du starter med en ny celle.
NOTE: Der er mange forskellige måder for kontur opsporing og flere nyttige plugins. Besøg israelske forsvarsminister webside og online tutorials for detaljer. I det viste tilfælde her, er standardindstillingen blevet anvendt. - Åbn "Model View" vinduet for at inspicere de objekter og deres konturer.
- I "Model View" værktøjslinjen vælge "Rediger" - "objekter". Respektive redigeringsvinduet åbnes.
- At modellere celler som fyldte og lukkede objekter, vælg "Mesh" som "Draw Datatype" og "Fill" som "Tegning Style". Klik på "Meshing" i rulle valg nederst til venstre i vinduet. Kontrollér indstillingen "Cap" i udvælgelsen nederst til højre. Tjek så mange objekter som nødvendigt, og klik på "Mesh alle". Programmet vil generere faste genstande fra stakke af konturer. Z-prøveudtagning faktor kan justeres ved at ændre "Z-skala" i "Vis" vinduet.
- Flyt / rotere 3D målsætt ("Rediger" - "Vis") og gemme snapshots eller film ("File" - "Snap Tiff som ..." eller "Film / Montage").
5. Tracking fluorescensmærkede konstruktioner med Endrov
BEMÆRK: For at spore celledeling rester, skal du bruge en stamme med en membran markør nukleare eller plasma for celle identifikation (f.eks H2B, PH-PLC-d1) og en celledeling rest markør (f.eks nmy-2, ZEN-4 ). Membranen markør nukleare eller plasma er vigtigt at bestemme, hvilken celle arver celledeling rest.
- For hurtig lastning og brugervenlighed, rådata skal konverteres til et TIFF-fil (fx i ImageJ). Dernæst at åbne Endrov og indlæse filen analyseres ved at vælge "Indlæs fil" fra fil-menuen. Klik på "2D seeren" ikonet på værktøjslinjen.
- Juster histogrammet ved at klikke på "Fit rækkevidde" ikonet (det blå ikon nederst i højre hjørnepå skærmen Endrov). Indstil XYZ opløsning ved at gå til "Data" - "filnavn" - "Imageset" - "Kanal" - "Set XYZ-opløsning". Indtast værdier for X, Y og Z, fx 5, 5, 1, hvis X og Y opløsning er 0,2 um og prøve hver 1 um i Z.
- Til udfyldelse kerner, flytte til planet af renter og klik på "2D viewer". Vælg "Lineage" fra dropdown menuen og vælg "Ny afstamning".
- Ved at klikke og trække på kernen, kan det mærkes. For at nævne kernen, højreklik og vælg "Omdøb partikel" fra rullemenuen. For at øge eller mindske diameteren af cirkelen, skal du trække pilen ikon, der vises til venstre for den markerede cirkel. For at markere centrale plan af kernen, klik på højre ikon. Når du bruger en plasmamembran markør, kan en stor kugle drages der vil dække det meste af cellen.
- For at fortsætte i tid og fly, skal du vælge "Frame" og "Z"muligheder nederst værktøjslinje. Efter går videre til næste tidspunkt, justere positionen eller størrelsen af cirklen, der markerer kernen i overensstemmelse hermed. Gentag dette, indtil de sporede celle skel.
- Når der er en celledeling, markere datter kerner og skifte til "Lineage viewer". Dette kan vælges ved at klikke på "Windows" ikonet på den øverste værktøjslinje. Markér alle tre kerner samtidig, gå til "Lineage" i den øverste værktøjslinje, og vælg "Associate forælder".
- Når celle sporing er færdig, skal du skifte til den kanal, der markerer celledeling rest til sporing. For at skifte kanal, skal du klikke på filnavnet på den nederste venstre hjørne af værktøjslinjen. Celledelingen rest (eller en anden struktur) kan spores som beskrevet ovenfor for kernen.
- Når du vender tilbage til softwaren efter lukketid, er det nødvendigt at gå til "2D Viewer" - "Lineage" - "Rediger", og til at klikke på afstamning nummer, der vil blive redigeret.
6. Analyse Kortikal Actomyosin Flow med PIVlab
BEMÆRK: PIVlab er en frit tilgængelig software fra: http://pivlab.blogspot.de/; Det kan gøres gældende inde fra Matlab kommandolinje miljø ved at skrive PIVlab_GUI. Når du arbejder med PIVlab, anbefales det at gemme billedet serien i en separat mappe.
- Start en ny session fra "menuen Filer". Indlæs billedfilerne ved at klikke på "Indlæs billeder" knappen.
- Vælg sekventering stil 1-2, 2-3, ... og navigere til den mappe, der indeholder sekvensen af ønskede billeder. Vælg de billeder, og klik på knappen "Tilføj" og import.
- Gå til "Analyser indstillinger" og vælg "Undtagelser (ROI, Mask)". Alternativt kan du trykke på "Ctrl + E". Brug knappen "Draw maske (er) for aktuelle ramme" for at inaktivere uønskede del af billedet / s (dvs., området uden embryo).
- Vælg "PIV indstillinger" frabout de "Analyser indstillinger" menuen. Alternativt kan du trykke på "Ctrl + S". Vælg "FFT vinduet deformation" som den ønskede PIV algoritme.
BEMÆRK: Fast Fourier transformation (FFT) reducerer den beregningsmæssige omkostninger, men anbefales kun signalet er langt over støj og hvis forskydningen af de undersøgte partikler ikke overstiger halvdelen af pass-området analyseret (se 6.5). - Indtast følgende værdier for de tre afleveringer, som er det område, forhør for intensitet kryds korrelation mellem efterfølgende billeder: Pass 1: Interrogation areal på 64 pixels med et trin på 32. Pass 2: Interrogation areal på 32 pixel med et trin på 16 . Vælg "lineær" fra Window deformation drop down menuen. Vælg Gaussisk 2 * 3-punkts metode til sub-pixel forskydning estimering.
- Vælg "Analyser" fra Analyse-menuen, og brug knappen "Analyser alle rammer" for at begynde en analyse.
- Til efterbehandling vælge "vektor validering" fra "; Post behandling "menuen og indstil standardafvigelsen (STDAFV) filter tærskel til 7 og gælder for alle rammer.
- Vælg "Udlede parametre / ændre data" fra "Plot" menuen. Vælg "Vektorer [px / ramme]" fra dropdown-menuen. Juster glathed af vektorer og højpasfilter og gælder for alle rammer.
- For at beregne gennemsnitlige vektorer af alle rammer, angive de "Brugt frames" til 1: ende og klik på "Beregn gennemsnitlige vektorer" knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved at bruge protokoller 2, 3 og 4, time-lapse imaging af gonaderne i vildtype C. elegans voksne udføres (stamme OD58 (unc-119 (ED3) III ltIs38 [pAA1, pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), der udtrykker en membran markør fra en germline promotor ). Med fokus på turn af gonaderne, er en 3D-model af kønsceller genereret fra mikroskopi data (figur 2). Denne model gør det muligt at analysere ændringer i cellestørrelse, mens celler transit danner den distale til den proximale arm, afslører organiseringen af skaft og størrelsen af kontakterne i individuelle celler til skaft (se også http: //www.wormatlas. org / hermafrodit / kim% 20line / Germframeset.html).
Dernæst protokoller 1, 3 og 5 er anvendt til at udføre langvarig time-lapse mikroskopi af C. elegans embryoner (stamme CHP52 som er en krydsning af stammen RW10226 (unc-119 (ED3) III itIs37 [pie-1p :: mCherry :: H2B :: pie-1 3'UTR + unc-119 (+)]; stIs10226 [his-72-promotorenHIS-24 :: mCherry translationel fusion med lad-858 3'UTR + unc-119 (+)]) og stamme LP162 (nmy-2 (cp13 [nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). I denne stamme, er det muligt at følge både kerner (gennem mCherry-histon fusionsproteiner) og celledeling rester (gennem genomisk modificerede ikke-muskel myosin II sted, hvor en GFP er blevet integreret i rammen gennem CRISPR / Cas9 teknologi 19 ) samtidigt ved brug af to-farve time-lapse mikroskopi (figur 3, venstre paneler). Modellerne opnået ved lineaging begge strukturer i Endrov viser den tidligere beskrevne stereotype mønster af celledeling rest arv 13,14. Desuden giver de lineaging data, sporene for hver celle og celledeling rest (figur 3, højre paneler) og tidspunktet for celledeling rest persistens (baseret på nmy-2 GFP -signal) samt korrelation til cellen division timing kan fås (<strong> Figur 4, vist for ABA kun afstamning). Ved brug af en plasmamembran markør derudover er det også muligt at observere tidspunkt i celledeling rest internalisering.
Endelig ved at anvende protokoller 1, 3 og 6, kortsigtet time-lapse mikroskopi med høj tidsmæssig opløsning (5s intervaller mellem optagelse af en z-stak) af cortical ikke-muskel myosin II (nmy-2 GFP) udføres. Fokus her ligger på forskellene i dynamikken i kortikal polariserende flow ved at sammenligne denne strøm mellem vildtype og embryoner RNAi-forarmet for Rho GTPase aktiverende protein RGA-3 20,21. Svarende til nylige observationer 22, strømme i vildtype embryoner overvejende langs den lange akse af embryonet (figur 5, venstre paneler), mens strømmen i RGA-3 RNAi embryo er vinkelret på denne akse. Dette er indlysende fra overlejring på hinanden følgende tidspunkter eller fra PIV analyser (figur 5, bundpaneler).
At observere disse forskelle, er det vigtigt at vælge en sampling interval, så kortikale flow-partikler kan løses entydigt for nøjagtig fortolkning af data. Mindre tidsintervaller (≤5 SEC) anbefales for at undgå store forskydninger og manglende vektorer. Forespørgselssignalet Vinduet skal være stort nok til at rumme størrelsen af partikler, der skal analyseres (corticale granuler). Overlapning mellem tilstødende afhøringsmetoder vinduer gør det muligt at reducere vektor afstand og dermed øger antallet af vektorer i nettet.
Figur 1. Montering en mund pipette Venstre:. Dele kræves for at samle en mund pipette med filter. Til højre:. Det samlede pipette venligstklik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. En 3D-model af gonaderne svingregionen Øverst til venstre:. 3D-projektion af et enkelt tidspunkt fra time-lapse mikroskopi data. Top midten og højre: 3D-modeller af de mikroskopi data. Nederst:. Nærmere oplysninger om celle-skaft kontakter Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Sporing af kerner og celledeling rester Venstre:. 3D-fremskrivninger fra time-lapse mikroskopi data. Midt: Snapshots af den opnåede spore både kerner (farvede kugler) og celledeling rester (grå kugler) model. Til højre: Snapshotsfra celledeling rest tracking. Stierne til resterne er også vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Cell og celledeling rest slægter for ABA sublineage. Afstamninger fra et repræsentativt foster er vist. Celledelinger er markeret med firkanter. Hver flueben svarer til 1 min. Celledelingen rester blev opkaldt efter de døtre, der opstår fra divisionen, i hvilken den rest genereres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Analyse af kortikal kontraktile flow med PIV Top:. 3D projektion stills fra time-lapse mikroskopi, der skildrer start (første række) og slutningen (anden række) af tiden vinduet bruges til at beregne vektoren feltet med PIVlab. Den tredje række af paneler viser overlejring af alle tidspunkter af tiden vinduet. Nederst:. Vektorfelter opnået ved PIVlab Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1 -. Relateret til figur 2. En 3D-model af gonade svingregionen Videoen starter med at rulle gennem hele stakken af fly, der anvendes til segmentet cellerne. Bagefter et 3D maksimale fremspring af stablen vises, efterfulgt af 3D segementation model roterer omkring x- og y-akserne (med og uden den segmenterede gonade s skaft).
Video 2 - relaterede til figur 3. Sporing af kerner og celledeling rester Venstre: 3D projektioner fra time-lapse mikroskopi data.. Midten: Modellen fås fra spore både kerner (farvede kugler) og celledeling rester (grå kugler). Til højre: celledeling rester og deres baner. Målestokken = 10 um.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Video 3 - relateret til figur 5. Analyse af cortical kontraktile flow med PIV 3D maksimal projektion time-lapse optagelser af en repræsentativ vildtype og RGA-3 RNAi embryo anvendes til at beregne vektor felt med PIVlab Målestok.. = 10 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gennem objekt sporing i udvikling, især nuklear sporing, har det været muligt at belyse centrale mønsterdannende mekanismer C. elegans embryogenese 1,23,24. Udvidelse denne strategi til højere gennemløb, har det været for nylig muligt at afdække yderligere mønsterdannende regler og foreslå en metode, hvordan man udlede mønster regler de novo 10. For mange mutanter imidlertid de præcise mønsterruller defekter er stadig ukendt. De her beskrevne metoder er redskaber, der kan være medvirkende til deres udredning. Det er vigtigt, er det blevet klart i de senere år, at skønt der mange andre modelsystemer ikke følge en invariant udvikling som C. elegans, objekt sporing og analyse af de kvantitative sporing af data er et afgørende redskab til at identificere udviklingsmæssige mekanismer og mekanismer på sygdom.
De viste metoder er særlig velegnet i en situation, hvor det enten vil være forudfordrende at implementere mere komplekse og / eller selvstændige genereret softwareløsninger, eller simpelthen for dyrt at gennemføre kommercielle software-værktøjer, hhv. Vigtigt er det, de værktøjer, der diskuteres her gør det muligt for forskeren at indlæse og analysere data uafhængigt på hvilket instrument de er blevet registreret. Desuden, hvis der anvendes proprietære billedoptagelse software ImageJ giver Bio-formater plugin, der kan indlæse data i proprietære formater og gemme dem i standard formater (JPEG, TIFF).
Et kritisk trin i alle protokoller der er baseret på tidsforskydningen mikroskopi er at vælge de betingelser ret til at få tilstrækkelig kontrast i mikroskopi billeder, og på samme tid, for at reducere bestråling af prøven. Dette afhænger i høj grad af, hvilken type mikroskop anvendt, og det anbefales generelt at anvende hurtig scanning teknikker såsom spinning disk eller enkelt plan belysning mikroskopi. Specifikt for PIV af kortikale dynamik, ældre versioner af point-scanningmikroskoper kan være for langsom til at tillade indfangning kortikale signaler ved en tilstrækkelig opløsning og hastighed til at udføre gyldige analyser. Det er derfor altid vigtigt at omhyggeligt evaluere stråling og teste levedygtigheden af prøven. Desuden, selv om de protokoller, der diskuteres her bruger micobeads at montere embryoner, er det også muligt at anvende agarose puder, som netop tager lidt mere tid til at forberede, men er billigere og med en vis erfaring lige reproducerbar. Imidlertid bør det understreges, at kombinationen af agarose pad og nanobeads er den overlegne metode til langsigtet immobilisering af voksne orme, da den undgår brugen af et lammende middel, f.eks, levamisol.
Det skal bemærkes, at de værktøjer, der gennemgås her har deres begrænsninger, da de ikke fuldautomatisk udfører dataanalyse. Men for strukturer som celledeling rester, er det ofte svært at identificere en molekylær markør, der kun findes iindehol- denne struktur, som er afgørende for pålidelig sporing. En stor fremtidig udfordring ligger derfor i, herunder funktioner som machine learning og tilpasningsdygtige detektion / segmentering algoritmer i den nemme at bruge og åben adgang software, som vi diskuterer her. Nogle af disse funktioner kan findes i andre softwaremoduler, især software, der kan håndtere gentagne sporing over længere tidsintervaller, eller der kan sammenligne store sæt af sporing data (f.eks StarryNite / AceTree 25 eller Nucleitracker4D 26, som er designet til track kerner hjælp histon-fusionsproteiner eller spindler 27, eller Simi Biocell 28). Disse værktøjer kan være mere kompliceret at gennemføre, når der sigter mod sporing af andre end kerner strukturer. Uanset den særlige struktur, der skal spores, disse programmer er generelt meget hjælpsomme, når store mængder af billeddata vil blive analyseret. Vigtigere er det, der er kompatibilitet mellem de ovennævnte software modules.
Når man arbejder med andre modelsystemer (f.eks fly embryoner, mammale dyrkede celler, etc.), de metoder, der præsenteres her, er også velegnet til at spore ortologe strukturer som beskrevet ovenfor. Endnu vigtigere er, uafhængigt af modelsystemet under undersøgelsen, forskellige subcellulære strukturer, f.eks centrosomer, nucleoli, mikropartikler, vesikler, etc. let kan spores, kun optagelsesparametre skal justeres for at sikre fuldstændig indfangning af objekt spor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
