Abstract
Quantitativamente cattura processi di sviluppo è fondamentale per ricavare modelli meccanicistici e la chiave per identificare e descrivere fenotipi mutanti. Qui protocolli sono presentati per la preparazione di embrioni e adulti C. elegans animali per breve e lungo termine microscopia time-lapse e metodi per il monitoraggio e la quantificazione dei processi di sviluppo. I metodi presentati sono tutti basati su C. ceppi disponibili nel Caenorhabditis Genetics Center e sul software open-source elegans che possono essere facilmente implementate in qualsiasi laboratorio indipendentemente dal sistema di microscopia utilizzato. Una ricostruzione di un modello cellulare-forma 3D utilizzando il IMOD software di modellazione, il monitoraggio manuale delle strutture subcellulari fluorescenza marcata con il programma di analisi di immagine multi-purpose Endrov, e un'analisi dei flussi contrattile corticale mediante PIVlab (-Time Risolto Image Velocimetry Particle digitale sono mostrati strumento per MATLAB). Si è discusso di come questi metodi possono anche essere distribuiti to quantitativamente catturare altri processi di sviluppo in diversi modelli, per esempio, di monitoraggio delle cellule e lineage tracing, il monitoraggio del flusso di vescicole.
Introduction
Con i miglioramenti costanti di proteine fluorescenti, ingegneria del genoma, la microscopia ottica, e software e all'hardware, è ora possibile registrare sviluppo di molti organismi modello a risoluzione senza precedenti spazio-temporale. Questo permette ai ricercatori di fare domande che non possono essere affrontate in precedenza o per rivisitare i processi di sviluppo noti per la ricerca di aspetti trascurati. Questo progresso ha scatenato campo della biologia dello sviluppo quantitativo, che mira a trasformare qualitativi, modelli informali in modelli quantitativi da misurazioni approfondite e analisi statistiche.
Tracking cellule e strutture subcellulari ha permesso di ricavare modelli quantitativi dello sviluppo embrionale, l'attività del sistema nervoso, o divisione cellulare 1-12. Tracciando resti divisione cellulare durante lo sviluppo iniziale del C. elegans embrione, potremmo recentemente rivelare che seguono un impianto stereodigitato il percorso e costituiscono importanti fattori di polarizzazione 13,14.
Qui, i protocolli vengono presentate che rendono la biologia dello sviluppo quantitativo approcci accessibili per i non esperti. L'attenzione si concentra su tre straight-forward, strumenti liberamente disponibili che sono implementabili in qualsiasi laboratorio che ha accesso a microscopia confocale standard ed i computer. Tra questi, un protocollo per generare forme di cellule 3D, un protocollo per monitorare resti divisione cellulare, e un protocollo per descrivere quantitativamente le dinamiche actomyosin corticali. Il nematode C. elegans è usato come un caso esemplare, tuttavia, i metodi e gli strumenti qui descritti adatti per una serie di domande in altri modelli biologici, per esempio, cellule coltivate, espianti di tessuto, organoidi o sferoidi, altri embrioni, etc.
In generale, alcune delle analisi indicati qui possono essere eseguite anche con il popolare strumento di ImageJ open source (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; o FIJI, le "batterie incluse 'versione di ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) per i quali sono disponibili molti plugin per diversi analisi quantitative. Tuttavia, i programmi qui discussi sono progettati per affrontare i problemi specifici.
In primo luogo, MDI, l'elaborazione delle immagini, la modellazione e le suite display può essere utilizzato per le ricostruzioni 3D di sezioni seriali di elettrone o microscopia ottica 15. IMOD contiene anche strumenti per la visualizzazione dei dati 3D da qualsiasi orientamento. In secondo luogo, Endrov, un programma Java progettato per eseguire l'analisi delle immagini, l'elaborazione dei dati, e l'annotazione di reti o brani (tra gli altri), sulla base di una architettura a plugin esteso, con ImageJ compatibilità plug-16. Esso contiene più di 140 operazioni di elaborazione delle immagini e un'interfaccia utente estendibile, in cui il modello ei dati grezzi vengono visualizzati separatamente. Il suo codice sorgente può essere trovato alla https://github.com/mahogny/Endrov. In terzo luogo, PIVlab, un MStrumento Atlab per particella digitale immagine velocimetria, che permette all'utente di analizzare quantitativamente e qualitativamente i campi di flusso di particelle 17. L'utilizzo di questo programma richiede una licenza MATLAB che include l'Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab è un programma progettato per descrivere quantitativamente il flusso. Calcola la distribuzione di velocità, ampiezza, vorticità, divergenza, o tranciare in coppie di immagini o serie. Per questo, cross-correla piccole aree di immagini (chiamati 'pass' nella sezione protocollo) di una coppia di immagini per ricavare lo spostamento delle particelle più probabile. Questa correlazione incrociata produce una matrice di correlazione che può essere analizzato nel dominio spaziale o la frequenza utilizzando cross-correlazione diretta o una trasformazione rapida di Fourier (FFT), rispettivamente.
L'apparecchiatura utilizzata è un microscopio rovesciato dotato di Nipkow ('spinning') del disco, un EMCCD, 488 e 561 nm solido-serielaser a stato, e 20x o 40x o aria 60x piano / apochromat obiettivi di petrolio o di acqua-immersion. Tuttavia, è anche possibile effettuare l'imaging time-lapse con altre modalità di imaging, ad esempio, point, LINE o laser-based microscopia foglio di scansione, microscopia multi-fotoni, così come la microscopia fluorescenza combinata con deconvoluzione o strutturato illuminazione. Il vantaggio di utilizzare un sistema a disco Nipkow è l'acquisizione immagine estremamente veloce, specialmente se una modalità di streaming (movimento continuo e scansione dell'oggetto nella dimensione z) è disponibile. Inoltre, per migliorare la risoluzione, un ingrandimento di 1,5 volte extender davanti alla EMCCD può essere utilizzato.
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Protocol
1. Preparazione di C. elegans embrioni per time-lapse Microscopia utilizzando microsfere
- Trasferire vermi adulti gravide utilizzando un pick verme (filo di platino) in una goccia di tampone M9 e pulire i batteri prima vigorosamente agitando e poi trasferire ogni verme a un calo adiacente di M9 utilizzando una sferza occhio montato su un dente di prelievo / puntale o utilizzare un capillare di vetro appuntito.
- Diluire la dispersione contenente 20 micron perline diametro polistirene 10 volte in tampone M9 (1 tampone L M9 contiene 3 g KH 2 PO 4, 6 g di Na 2 HPO 4, 5 g di NaCl, e, dopo autoclavaggio (20 min, 120 ° C), aggiungere un ulteriore 1 ml di una soluzione di 4 1 M MgSO).
- Effettuare una pipetta a bocca da qualsiasi tipo di sottile capillare di vetro (ad esempio, la fusione capillari puntiformi o capillari utilizzati per tirare aghi per iniezione), a circa 0,5 m di lunghezza pezzo di gomma, silicone o materiale simile tubo (meglio se trasparente), a 200 microlitripuntale, il coperchio di un tubo 200 microlitri PCR, un filtro idrofobico per piccole siringhe (ad es., un 0,2-0,45 micron dimensione dei pori e 15-50 mm di diametro nylon, PTFE o materiale simile filtro) punta, e una pipetta 1.000 ml . Questo tipo di bocca pipetta assicura che nessun materiale biologico può entrare in contatto con lo sperimentatore.
- Assemblare la pipetta inserendo la punta della pipetta 200 microlitri con la punta prima nel tubo e collegarlo con il coperchio di un tubo di PCR che ha una foratura centrale che corrisponde al diametro del capillare utilizzato. Un ago punteruolo o preparazione molto rilevato può essere utilizzato per generare la perforazione.
- Disegnare una capillare sottile e inserirla nella perforazione. Inserire il filtro nell'altra estremità del tubo e inserire 1000 microlitri pipetta punta come boccaglio (Figura 1).
- Sezionare adulti gravido tagliando vermi trasversalmente alla vulva con una lama di rasoio pulita o bisturi.
NOTA: In genere, molti embrioni saranno postaxpulsed dopo il taglio. Tuttavia, se sono necessarie primi embrioni, a volte devono essere rilasciate dalla carcassa con un occhio sferza o un ago appuntito. - Pipettare una goccia della dispersione diluita in polistirolo (~ 4 microlitri) su un vetro di copertura 24x60 mm e di trasferimento embrioni in questo calo usando la pipetta bocca.
- Posizionare con cura un piccolo (ad esempio, 18x18 o 20x20 mm) copertura di vetro sulla parte superiore della goccia e assicurarsi che il calo si è completamente estesa.
NOTA: Il calo dovrebbe essere abbastanza piccolo da non toccare i bordi del piccolo vetro di copertura. - Sigillare il monte con vaselina liquefatto. Aggiungere una goccia di olio di immersione in copertina mm 24x60 lato antiscivolo e passare alla sezione 'Time-lapse Microscopia'.
2. Preparazione di adulti C. elegans animali per time-lapse Microscopia utilizzando Nanobeads
NOTA: In generale, il protocollo per il montaggio animali adulti è un adattamento del protocollo da rif. 18.Con questo protocollo, è possibile effettuare lungo termine microscopia time-lapse confocale di animali adulti.
- Preparare un 1,5% (w / v) di agarosio in tampone M9, bollire (1 min, 100 ° C a bagnomaria o microonde). L'uso di elevate concentrazioni di agarosio non è raccomandato poiché questo può portare a estrusione del intestino e / o parti di gonade.
- Stick giù 2-3 strati di nastro su due vetrini da microscopio ciascuno. Posizionare un vetrino senza nastro tra le due diapositive con nastro adesivo.
- Utilizzare un puntale e mettere una goccia della soluzione di agarosio caldo al centro della slitta centrale. Introdurre rapidamente un'altra vetrino sul goccia così che sia supportato dagli strati di nastro su ogni lato. Questo creerà un giro e pad agar piatta di circa 10 mm di diametro.
- Mettere una goccia di soluzione di 100 nm tallone (non diluito, che è 2,6% (w / v)) sul pad. Trasferimento 1-10 vermi adulti puliti nel menu a tendina con un pick verme. Sigillare con 18x18 millimetri di vetro di copertura e di vaselina come spiegato in ProtOcol 1.
3. microscopia time-lapse
- Mettere una goccia di olio di immersione sul vetrino da microscopio o il panino vetro di copertura. Utilizzare campo chiaro a basso ingrandimento (5x o 10x lenti) per individuare il campione.
NOTA: limitare l'esposizione alla luce blu il più possibile (in particolare per C. elegans embrioni), ad esempio, non utilizzare la microscopia fluorescenza per trovare / focalizzare il provino ma utilizzare campo chiaro invece. - Passare alla maggiore ingrandimento (40x o 60x obiettivi), portare il campione a fuoco (o piano centrale o superiore / inferiore piani del campione, a seconda del software di acquisizione).
- Impostare gli intervalli di campionamento a 30 aerei a 1 micron spaziatura registrato ogni 1min. Nel caso in cui un xy o xyz stadi automatica è disponibile, più punti possono essere registrati in un'unica sessione. Passare a imaging di fluorescenza e controllare di nuovo la messa a fuoco.
NOTA: cercare di evitare l'uso di poteri alta del laser, piuttosto utilizzare tempi di esposizione leggermente più lungoa bassissime intensità. Misura immagini acquisite subito, sia nel programma di acquisizione immagini o in ImageJ per evitare la saturazione, che colture variano le dinamiche e significa anche un'eccessiva esposizione alle radiazioni. - Avviare la registrazione della serie time-lapse.
NOTA: Per escludere l'analisi artefatti, iniziare con lunghi intervalli (3-10 min) tempo tra la scansione del campione e aumentare gradualmente campionamento temporale agli intervalli desiderati. Tempi di sviluppo così come i punti finali in entrambi i casi dovrebbero essere simili quando si effettua una analisi statistica. Inoltre, è spesso necessario valutare i tassi di sopravvivenza e fototossicità. Pertanto, recuperare campione dal monte dopo-lungo termine microscopia time-lapse e controllare se continuano a sviluppare / live.
4. Ricostruire un modello delle cellule di figura 3D con IMOD
NOTA: Il software IMOD è disponibile dalla pagina web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. L'installazione del software è descrittod lì. Quando si utilizza il sistema operativo Windows, un toolkit Unix deve essere installata, che può anche essere trovato come un pacchetto sul sito IMOD. Inoltre, vi è un'introduzione 3dmod ottimamente compilato disponibili sulla pagina web IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).
- Aprire la shell Unix e digitare "imod". La finestra MDI si aprirà. Selezionare il file con i dati grezzi (idealmente un tif impilati o simili) da cui generare un modello 3D.
- Individuare la parte inferiore e superiore degli oggetti nella finestra zap utilizzando la finestra delle informazioni (su e giù strumento scorrimento).
- Avviare l'analisi i contorni delle cellule. È importante sottolineare che, in modo che ogni cella è un oggetto. Inizia con il piano superiore di ogni cella e creare il primo contorno si utilizza la finestra delle informazioni. Scorrere verso il basso in z e creare un nuovo profilo per ogni piano z.
- Fare lo stesso per tutte le celle come necessario per modellare in 3D. Non dimenticare di creare un nuovo oggetto quando si inizia con una nuova cellula.
NOTA: Ci sono molti modi diversi per contorno tracciamento e diversi plugin utile. Si prega di visitare la pagina web IMOD e tutorial online per i dettagli. Nel caso qui illustrato, è stata usata l'impostazione predefinita. - Aprire la finestra "Modello View" per ispezionare gli oggetti e le loro contorni.
- Nella barra degli strumenti "Model View" scegliere "Modifica" - "Oggetti". La rispettiva finestra di modifica si aprirà.
- Per modellare cellule come oggetti pieni e chiusi, scegliere "Mesh" come "Draw tipo di dati" e "Fill" come "stile di disegno". Clicca su "mesh" nella selezione scorrimento in basso a sinistra della finestra. Controllare l'opzione "Cap" nella selezione in basso a destra. Controllare il numero di oggetti come necessario e fare clic su "Mesh All". Il programma genererà oggetti solidi dalle pile di contorni. Il fattore-z campionamento può essere regolata cambiando "Z-scale" nella finestra "View".
- Sposta / ruotare l'obiet 3Dt ("Edit" - "Vista") e salvare le istantanee o filmati ("File" - "Snap Tiff con nome ..." o "Movie / Montaggio").
5. Monitoraggio fluorescente Strutture etichettati con Endrov
NOTA: Al fine di tenere traccia di resti divisione cellulare, utilizzare un ceppo con un pennarello membrana nucleare o al plasma per l'identificazione delle cellule (ad esempio, H2B, PH-PLC-d1) e una divisione cellulare marcatore residuo (ad esempio, NMY-2, ZEN-4 ). Il marcatore membrana nucleare o del plasma è importante per determinare quale cella eredita il rimanente divisione cellulare.
- Per caricamento veloce e facilità d'uso, i dati grezzi deve essere convertito in un file TIFF (ad esempio, in ImageJ). Avanti, aperto Endrov e caricare il file da analizzare, scegliendo l'opzione "Carica file" dal menu file. Fare clic sull'icona "Visualizzatore 2D" nella barra degli strumenti.
- Regolare l'istogramma facendo clic sull'icona "gamma Fit" (l'icona blu nell'angolo in basso a destradello schermo Endrov). Impostare la XYZ risoluzione andando su "dati" - "nomefile" - "ImageSet" - "Canale" - "Set XYZ-risoluzione". Digitare valori X, Y, e Z, per esempio, 5, 5, 1 se la risoluzione X e Y è di 0.2 micron e campionare ogni 1 micron di Z.
- Per annotare i nuclei, passare al piano di interesse e cliccare su "visore 2D". Selezionare "Lineage" dal menu a discesa e scegliere "Nuovo stirpe".
- Cliccando e trascinando sul nucleo, può essere marcato. Per assegnare un nome al nucleo, fare clic destro e scegliere "Rinomina particella" dal menu a discesa. Per aumentare o diminuire il diametro del cerchio, trascinare la freccia che appare sulla sinistra del cerchio marcato. Per celebrare il piano centrale del nucleo, fare clic sull'icona a destra. Quando si utilizza un marcatore membrana plasmatica, una grande sfera può trarre che coprirà la maggior parte della cellula.
- Per continuare nel tempo e piano, scegliere il "Frame" e "Z"i pasti presso la barra degli strumenti in basso. Dopo essere andato al successivo punto di tempo, regolare la posizione o la dimensione del cerchio che segna il nucleo di conseguenza. Ripetere questa operazione fino a quando la cellula si divide cingolati.
- Quando c'è una divisione cellulare, segnare i nuclei figli e passare a "spettatore Lineage". Questo può essere selezionata facendo clic sull'icona "Windows" sulla barra degli strumenti superiore. Segna tutti e tre i nuclei contemporaneamente, passare all'opzione "Lineage" nella barra degli strumenti in alto e selezionare "genitore Associate".
- Quando il monitoraggio delle cellule è terminata, passare alla marcatura il resto della divisione cellulare per il monitoraggio dei canali. Per cambiare canale, fare clic sul nome del file nell'angolo in basso a sinistra della barra degli strumenti. Il residuo divisione cellulare (o qualsiasi altra struttura) possono essere monitorati come descritto sopra per il nucleo.
- Quando si ritorna al software dopo la chiusura, è necessario andare a "2D Viewer" - "Lineage" - "Modifica" e cliccare sul numero di stirpe che verrà modificato.
6. Analizzando corticale actomiosina flusso con PIVlab
NOTA: PIVlab è un software disponibile gratuitamente da: http://pivlab.blogspot.de/; esso può essere richiamato all'interno dell'ambiente riga di comando Matlab digitando PIVlab_GUI. Quando si lavora con PIVlab, si raccomanda di salvare la serie di immagini in una cartella separata.
- Avviare una nuova sessione dal menu "File". Caricare i file di immagine, fare clic sul pulsante "Carica immagini".
- Selezionare lo stile sequenza 1-2, 2-3, ... e passare alla directory che contiene la sequenza delle immagini desiderate. Selezionare le immagini e fare clic sul pulsante "Aggiungi" e di importazione.
- Vai su "Impostazioni" Analisi e selezionare "Esclusioni (ROI, Maschera)". In alternativa, premere il tasto "Ctrl + E". Utilizzare il pulsante "Disegna maschera (s) per fotogramma corrente" per disattivare la parte indesiderata delle immagini / s (cioè, al di fuori dell'area embrione).
- Selezionare "Impostazioni PIV" from il menu "Impostazioni Analisi". In alternativa, premere il tasto "Ctrl + S". Scegliere "finestra deformazione FFT", come l'algoritmo di PIV desiderato.
NOTA: trasformazione rapida di Fourier (FFT) riduce il costo computazionale ma è consigliata solo il segnale è ben al di sopra del rumore e se lo spostamento delle particelle studiati non supera la metà della superficie passaggio analizzato (vedi 6.5). - Inserire i seguenti valori per le tre passaggi, che sono la zona di interrogazione per incrociata intensità correlazione tra immagini successive: Passo 1: interrogazione un'area di 64 pixel con un passo di 32. Passo 2: interrogazione superficie di 32 pixel con un passo di 16 . Selezionare "lineare" dalla deformazione finestra menu a discesa. Scegli il metodo 2 * 3 punti di Gauss per lo spostamento stima sub-pixel.
- Selezionare "Analyze!" dal menu Analysis e utilizzare il pulsante "Analizza tutti i frame" per iniziare un'analisi.
- Per la post-elaborazione selezionare "convalida Vector" da "; Menù post trattamento "e impostare la deviazione standard (Stdev) Soglia di filtro a 7 e si applicano a tutti i fotogrammi.
- Scegliere "Derivare parametri / modificare i dati" dal menu "Plot". Selezionare "vettori [px / telaio]" dal menu a discesa. Regolare la scorrevolezza dei vettori e filtro passa alto e si applicano a tutti i fotogrammi.
- Per calcolare i vettori medi di tutti i fotogrammi, impostare i "fotogrammi usati" a 1: fine e fare clic sul pulsante "Calcola i vettori medi".
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Representative Results
Utilizzando i protocolli 2, 3, e 4, time-lapse di imaging di gonadi a selvaggio tipo C. elegans adulti viene eseguita (ceppo OD58 (unc-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1, pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), che esprime un marcatore di membrana da un promotore della linea germinale ). Concentrandosi sulla volta della gonade, un modello 3D delle cellule germinali è generato dai dati microscopia (Figura 2). Questo modello permette di analizzare variazioni di dimensione della cella, mentre il transito cellule formano distale al braccio prossimale, rivela l'organizzazione del rachide e le dimensioni dei contatti delle singole celle al rachide (vedi anche http: //www.wormatlas. org / ermafrodita / germe% 20LINE / Germframeset.html).
Avanti, protocolli 1, 3, e 5 vengono utilizzate per eseguire a lungo termine microscopia time-lapse di C. elegans embrioni (ceppo CHP52 che è un incrocio di ceppo RW10226 (unc-119 (ED3) III; itIs37 [torta-1p :: :: mCherry H2B :: pie-1 3'UTR + unc-119 (+)]; stIs10226 [suo-72 promotoreHIS-24 :: mCherry fusione traslazionale con let-858 3 'UTR + unc-119 (+)]) e la tensione LP162 (nmy-2 (CP13 [nmy-2 :: GFP + loxP]) I.). In questo sforzo, è possibile seguire due nuclei (attraverso le proteine di fusione mCherry-istoni) e resti di divisione cellulare (attraverso la non-muscolo miosina II locus genomicamente modificato dove un GFP è stato integrato nel telaio attraverso il CRISPR / Tecnologia Cas9 19 ) Pannelli allo stesso tempo con due colori microscopia time-lapse (Figura 3, a sinistra). I modelli ottenuti da lineaging di entrambe le strutture in Endrov mostrano il modello stereotipato precedentemente descritto di divisione cellulare eredità residuo 13,14. Inoltre, dai dati lineaging, le tracce per ogni cella e la divisione cellulare residuo (figura 3, i pannelli di destra) e il tempo di divisione cellulare persistenza residuo (basata sulla GFP NMY-2 -signal) nonché la correlazione alla cella temporizzazione divisione può essere ottenuta (<strong> Figura 4, mostrato solo il lignaggio ABA). Quando si utilizza un marcatore membrana plasmatica in aggiunta, è anche possibile osservare il tempo del punto di divisione cellulare internalizzazione residuo.
Infine, utilizzando i protocolli 1, 3, e 6, a breve termine la microscopia time-lapse con alta risoluzione temporale (5s intervalli tra la registrazione di un z-stack) di corticale non muscolo miosina II (NMY-2 GFP) viene eseguita. L'attenzione qui si trova sulle differenze tra le dinamiche della corticale flusso polarizzante confrontando questo flusso tra wild type ed embrioni RNAi-impoverito per Rho GTPasi attivando proteina RGA-3 20,21. Simili recenti osservazioni 22, fluire in embrioni di tipo selvatico è prevalentemente lungo l'asse dell'embrione (Figura 5, pannelli di sinistra), mentre il flusso in rga-3 RNAi embrione è ortogonale a questo asse. Questo è evidente da sovrapposizione punti temporali consecutivi o dalle analys PIVè (Figura 5, pannelli inferiori).
Per osservare queste differenze, è importante scegliere un intervallo di campionamento in modo che le particelle di flusso corticali possono essere risolti senza ambiguità di interpretazione accurata dei dati. Intervalli di tempo più piccolo (≤5 sec) si raccomanda di evitare di grandi spostamenti e vettori mancanti. La finestra di interrogazione dovrebbe essere abbastanza grande per accogliere la dimensione delle particelle da analizzare (granuli corticali). Sovrapposizione tra finestre di interrogazione limitrofi consente di ridurre la distanza vettoriale e quindi aumenta il numero di vettori nella griglia.
Figura 1. Assemblaggio una pipetta a bocca. A sinistra: le parti necessarie per assemblare una pipetta bocca con filtro. A destra:. La pipetta assemblato pregaclicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Modello 3D di regione gonade girare alto a sinistra:. Proiezione 3D di un unico punto di tempo a partire da dati di microscopia time-lapse. In alto al centro ea destra: i modelli 3D dei dati microscopia. In basso:. Dettagli dei contatti cellula-rachide Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Monitoraggio dei nuclei e resti di divisione cellulare. A sinistra: proiezioni in 3D a partire da dati di microscopia time-lapse. Middle: Istantanee del modello acquisito da entrambi i nuclei di monitoraggio (sfere colorate) e resti di divisione cellulare (sfere grigie). A destra: Istantaneeda divisione cellulare di monitoraggio residuo. I percorsi per i resti vengono visualizzati anche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Sono mostrati Figura 4. cellulare e la divisione delle cellule lignaggi rimanenti per la sublineage aba. Casate da un embrione rappresentante. Divisioni cellulari sono contrassegnati da quadrati. Ogni segno di graduazione corrisponde a 1 min. I resti divisione cellulare sono stati chiamati dopo le figlie che nascono dalla divisione in cui viene generato il rimanente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Rendiconto contrattile corticale con PIV Top:. Alambicchi di proiezione 3D da microscopia time-lapse che raffigurano l'inizio (prima fila) e la fine (seconda fila), della finestra temporale per il calcolo del campo vettoriale con PIVlab. La terza fila di pannelli mostra la sovrapposizione di tutti i punti temporali della finestra temporale. In basso:. Campi vettoriali ottenuti da PIVlab Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Video 1 -. Legati alla figura 2. Un modello 3D della regione turno gonade Il video inizia con scorrere l'intero stack di aerei utilizzati per segmentare le cellule. Successivamente una sporgenza massima 3D dello stack è mostrato, seguita dal modello di segmentazione 3D ruotando attorno assi xey (con e senza rachide della gonade segmentata).
Video 2 - legati alla Figura 3. Monitoraggio dei nuclei e resti divisione cellulare Sinistra: proiezioni in 3D a partire da dati di microscopia time-lapse.. Al centro: Il modello ottenuto dal monitoraggio entrambi i nuclei (sfere colorate) e resti di divisione cellulare (sfere grigie). A destra: resti la divisione cellulare e le loro traiettorie. Barra di scala = 10 micron.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Video 3 - legato alla figura 5. Rendiconto contrattile corticale con PIV massima proiezione time-lapse registrazioni 3D di tipo selvaggio rappresentante e RGA-3 RNAi embrione utilizzato per calcolare il campo vettoriale con PIVlab bar Scala.. = 10 micron.
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Discussion
Attraverso oggetto inseguimento in sviluppo, in particolare inseguimento nucleare, è stato possibile per chiarire i meccanismi centrali di patterning C. elegans embriogenesi 1,23,24. Espansione questa strategia per un throughput più elevato, è stato recentemente possibile scoprire regole patterning complementari e di proporre un metodo come dedurre patterning regole de novo 10. Per molti mutanti, tuttavia, l'esatto difetto patterning sono ancora sconosciute. I metodi qui descritti sono strumenti che possono essere determinanti per la loro spiegazione. Importante, è diventato chiaro negli ultimi anni che, anche se molti altri sistemi modello non seguono uno sviluppo invariante come C. elegans, inseguimento di oggetto e analisi dei dati di monitoraggio quantitativo è uno strumento fondamentale per individuare meccanismi e dei meccanismi della malattia di sviluppo.
I metodi descritti qui sono particolarmente adatti nella situazione in cui sarebbe essere sia troppodifficile da implementare le soluzioni software più complessi e / o auto-generati, o semplicemente troppo costoso da implementare strumenti software commerciali, rispettivamente. È importante sottolineare che gli strumenti discussi qui consentono al ricercatore per caricare e analizzare i dati in modo indipendente sui quali strumenti sono stati registrati. Inoltre, se si utilizza un software di acquisizione delle immagini di proprietà, ImageJ fornisce il plugin Bio-formati che possono caricare i dati in formati proprietari e salvarli in formati standard (JPEG, TIFF).
Un punto critico in tutti i protocolli che si basano sulla microscopia time lapse è di scegliere le condizioni per ottenere un sufficiente contrasto in immagini al microscopio, e, allo stesso tempo, di ridurre l'esposizione alle radiazioni al campione. Questo dipende fortemente dal tipo di microscopio utilizzato ed è generalmente raccomandato l'uso di tecniche di scansione veloci come disco rotante o singola microscopia illuminazione aereo. In particolare, per PIV delle dinamiche corticali, le versioni precedenti di point-scanningmicroscopi potrebbe essere troppo lento per permettere l'acquisizione di segnali corticali a risoluzione e velocità per eseguire analisi validi sufficiente. È quindi sempre essenziale valutare attentamente l'esposizione a radiazioni e testare la validità del campione. Inoltre, anche se i protocolli descritti qui usano micobeads per montare embrioni, è anche possibile utilizzare i rilievi agarosio, che prende un po 'più tempo per prepararsi, ma è meno costoso e con una certa esperienza altrettanto riproducibili. Tuttavia, si deve rilevare che la combinazione di pad agarosio e nanobeads è il metodo superiore per l'immobilizzazione a lungo termine di vermi adulti poiché evita l'uso di qualsiasi agente paralizzante, ad esempio, levamisolo.
Va sottolineato che gli strumenti discussi qui hanno i loro limiti in quanto non effettuano l'analisi dei dati completamente automatizzato. Tuttavia, per strutture come resti divisione cellulare, è spesso difficile da identificare un marcatore molecolare che s solocontiene tale struttura, che è cruciale per il monitoraggio affidabile. Una sfida importante futuro quindi sia quello di includere caratteristiche come machine learning e adattabili algoritmi di rilevamento / segmentazione del software di accesso facile da usare e aperto che discutiamo qui. Alcune di queste caratteristiche si possono trovare in altri moduli software, in particolare software in grado di gestire il monitoraggio ripetuto più intervalli di tempo più lunghi, o che può confrontare grandi insiemi di dati di monitoraggio (ad esempio, StarryNite / AceTree 25 o Nucleitracker4D 26, che sono progettati per nuclei traccia utilizzando proteine istone-fusione o mandrini 27, o Simi BioCell 28). Questi strumenti possono essere più complesso da implementare quando l'obiettivo di inseguimento di strutture diversi nuclei. Nonostante la particolare struttura che dovrebbe essere seguito, questi programmi sono generalmente molto utile quando verranno analizzate grandi quantità di dati di immagine. È importante sottolineare che non vi è compatibilità tra il sopra menzionato Modulo softwarees.
Quando si lavora con altri sistemi modello (ad esempio, volare embrioni, cellule coltivate di mammifero, ecc), i metodi qui presentati sono adatte anche per monitorare strutture ortologhi come descritto sopra. Ancora più importante, indipendentemente dal sistema modello in esame, diverse strutture subcellulari, ad esempio, i centrosomi, nucleoli, microparticelle, vescicole, ecc può essere facilmente monitorati, solo i parametri di acquisizione devono essere regolati per garantire la completa acquisizione di tracce di oggetti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
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