Abstract
Quantitativen Erfassung von Entwicklungsprozessen ist entscheidend, um mechanistische Modelle und grundlegenden ableiten zu identifizieren und zu beschreiben Mutantenphänotypen. Hier Protokolle werden zur Herstellung von Embryonen und erwachsenen C. vorgestellt elegans Tiere für kurz- und langfristigen Zeitraffer-Mikroskopie und Methoden zur Überwachung und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen. Die vorgestellten Methoden werden alle auf C basiert elegans Stämme von der Caenorhabditis Genetics Center und auf Open-Source-Software, die leicht in jedem Labor unabhängig von dem Mikroskopiesystem verwendet, implementiert werden kann. Eine Rekonstruktion eines 3D-Zell-Formmodells mit Hilfe der Modellierungssoftware IMOD, manuelle Verfolgung von fluoreszenzmarkierten subzellulärer Strukturen unter Verwendung des Mehrzweck-Bildanalyseprogramm Endrov, und eine Analyse der kortikalen Kontraktionsströmung mit PIVlab (zeitaufgelöste digitale Particle Image Velocimetry Werkzeug für MATLAB) gezeigt. Es wird diskutiert, wie diese Methoden können auch eingesetzt werden to quantitativ erfassen andere Entwicklungsprozesse in verschiedenen Modellen, zum Beispiel Zell Tracking und Tracing Abstammung, Tracking der Vesikel-Flow.
Introduction
Mit den stetigen Verbesserungen der fluoreszierenden Proteine, Genomtechnik, Lichtmikroskopie und Computer Soft- und Hardware, ist es nun möglich, die Entwicklung von vielen Modellorganismen zu beispiellosen räumlich-zeitliche Auflösung aufzeichnen. Dies ermöglicht es den Forschern, um Fragen, die bisher nicht behandelt werden konnten bitten oder zu bekannten Entwicklungsprozesse, um für übersehene Aspekte zu suchen denken. Diese Fortschritte sind auf dem Gebiet der quantitativen Entwicklungsbiologie, die bei Umwandlung qualitative, informellen Modelle in quantitativen Modellen durch gründliche Messungen und statistische Analysen sollen entfacht.
Tracking-Zellen und subzellulären Strukturen hat es möglich gemacht, um quantitative Modelle der Embryonalentwicklung Aktivität des Nervensystems oder der Zellteilung 1-12 abzuleiten. Durch die Verfolgung der Zellteilung Überreste während der frühen Entwicklung des C elegans Embryo, konnten wir kürzlich zeigen, dass sie ein Stereo folgeneingegeben Pfad und stellen wichtige Polarisationsfaktoren 13,14.
Hier werden Protokolle vorgestellt, die quantitative Entwicklungsbiologie Ansätze für Nicht-Experten zugänglich zu machen. Der Fokus liegt auf drei geradlinig, frei verfügbaren Tools, die umsetzbare in jedem Labor, das den Zugang zu Standard-konfokale Mikroskopie und Computer hat, sind. Dazu gehören ein Protokoll, um 3D-Zellformen zu erzeugen, ein Protokoll zur Zellteilung Überreste zu verfolgen, und ein Protokoll, um quantitativ zu beschreiben kortikalen Actomyosin Dynamik. Der Fadenwurm C. elegans wird als beispielhafter Fall verwendet wird, jedoch sind die Verfahren und Instrumente hier beschrieben werden, geeignet für eine Vielzahl von Fragen in anderen biologischen Modellen, beispielsweise kultivierten Zellen, Gewebeexplantate, Organoide oder Sphäroide anderen Embryonen usw.
Im Allgemeinen können einige der hier dargestellten Analysen auch mit dem beliebten Open-Source-Tool ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index durchgeführt werden.html; oder FIJI, 'mitgelieferten Batterien "die Version von ImageJ, http://fiji.sc/Fiji), für die viele Plugins für verschiedene quantitative Analysen zur Verfügung stehen. Allerdings sind die Programme hier diskutiert wurden entwickelt, um spezifische Probleme anzugehen.
Erstens IMOD, eine Bildverarbeitung, Modellierung und Display-Suite für 3D-Rekonstruktionen der Serienschnitte von Elektronen- oder Lichtmikroskop 15 verwendet werden. IMOD enthält auch Werkzeuge für die Anzeige der 3D-Daten aus jeder Ausrichtung. Zweitens Endrov, ein Java-Programm entwickelt, um die Bildanalyse, Datenverarbeitung, und Annotation von Netzwerken oder Spuren (unter anderem) auf der Grundlage eines erweiterten Plugin-Architektur durchzuführen, mit ImageJ Plugin-Kompatibilität 16. Es enthält über 140 Bildverarbeitungsoperationen und eine erweiterbare Benutzeroberfläche, in dem Modell und Rohdaten werden separat angezeigt. Sein Quellcode kann https://github.com/mahogny/Endrov gefunden werden. Drittens PIVlab, a MATLAB Werkzeug für digitale Particle Image Velocimetry, die dem Benutzer erlaubt, quantitativ und qualitativ analysiert Partikelströmungsfelder 17. Die Verwendung dieser Programme erfordert eine MATLAB-Lizenz, die die Image Processing Toolbox (http://mathworks.com) umfasst. PIVlab ist ein Programm entwickelt, um quantitativ zu beschreiben Fluss. Es berechnet die Geschwindigkeitsverteilung, Größe, Wirbel, Divergenz oder Scher innerhalb von Bildpaaren oder Serie. Hierfür einen kreuzkorreliert kleine Bereiche von Bildern (als "Durchgänge" in dem Protokollabschnitt) eines Bildpaares, um die wahrscheinlichste Teilchenverschiebung abzuleiten. Diese Kreuzkorrelation ergibt einen Korrelationsmatrix, die in dem oder den Frequenzbereich unter Verwendung von entweder direkten Kreuzkorrelation oder einer schnellen Fourier-Transformation (FFT) bzw. ausgewertet werden können.
Das hier verwendete Ausrüstung ist ein inverses Mikroskop mit einer Nipkow ('Spinning') Disc, einer EMCCD, 488 und 561 nm Standard Fest- ausgestattetKörperlaser und 20x Luft oder 40x oder 60x Plan / Apochromat auf Öl- oder Wasserimmersionsobjektive. Es ist jedoch auch möglich, Zeitraffer-Bildgebung in Verbindung mit anderen Bildgebungsverfahren durchführen, beispielsweise punkt-, linien- oder flächen Scanning Laser basierende Mikroskopie, Multi-Photonen-Mikroskopie sowie Epifluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Dekonvolution oder strukturierte Erleuchtung. Der Vorteil der Verwendung einer Nipkow-Scheibe-System ist die extrem schnelle Bildaufnahme, insbesondere wenn eine Streaming-Betrieb (kontinuierlicher Bewegung und Abtastung des Objekts in der z-Richtung) ist verfügbar. Darüber hinaus, um die Auflösung zu verbessern, kann ein 1,5-fach Vergrößerungs Extender vor dem EMCCD verwendet werden.
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Protocol
1. Herstellung der C. elegans Embryonen für Zeitraffer-Mikroskopie mit Mikroperlen
- Bringen gravid erwachsenen Würmer mit Hilfe eines Schnecken Pick (Platindraht) in einen Tropfen M9-Puffer und sauber aus Bakterien durch erste kräftiges Rühren und dann Übertragen jeder Wurm zu einem benachbarten Tropfen M9 mit einem Wimpern auf einen Zahnstocher / Pipettenspitze montiert oder mit einem spitzen Glaskapillare.
- Verdünne die Dispersion, die das 20 & mgr; m Durchmesser Polystyrolbeads 10fach in M9-Puffer (1 l M9-Puffer enthält 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, und nach dem Autoklavieren (20 Minuten, 120 ° C), fügen Sie eine zusätzliche 1 ml einer 1 M MgSO 4 Lösung).
- Einen Mundpipette von jeder Art von dünnen Glaskapillare (zB Schmelzpunkt-Kapillaren oder Kapillaren verwendet werden, um Injektionsnadeln zu ziehen), eine etwa 0,5 m langes Stück Gummi, Silikon oder ähnlichem Material Schlauch (idealerweise transparent), eine 200 & mgr;Pipettenspitze, wobei der Deckel aus einem 200 & mgr; l PCR-Röhrchen, einem hydrophoben Filter für kleine Spritzen (z. B. ein 0,2-0,45 & mgr; m Porengrße und 15-50 mm Durchmesser Nylon, PTFE oder ähnlichem Material Filter) und einem 1000 & mgr; l-Pipettenspitze . Diese Art von Mundpipette sichergestellt, dass kein biologisches Material in Kontakt mit dem Experimentator erhalten.
- Montieren Sie die Pipette durch Einfügen des 200 ul Pipettenspitze mit der Spitze zuerst in die Rohrleitung und schließen Sie es mit dem Deckel eines PCR-Röhrchen, die eine zentrale Perforation, die den Durchmesser der Kapillare verwendet, übereinstimmt. Eine sehr spitz Ahle oder der Zubereitung Nadel verwendet werden, um die Perforation zu erzeugen.
- Zeichnen Sie eine dünne Kapillare und setzen Sie sie in die Perforation. Setzen Sie den Filter in das andere Ende des Schlauchs und legen Sie eine 1000 ul Pipettenspitze als Mundstück (Abbildung 1).
- Sezieren gravid Erwachsenen, indem Würmer in Querrichtung an der Vulva mit einer sauberen Rasierklinge oder Skalpell.
HINWEIS: In der Regel werden viele Embryonen e seinnach dem Schneiden xpulsed. Allerdings, wenn frühen Embryonen benötigt werden, haben sie manchmal, um von der Karkasse mit einem Wimpern oder spitzen Nadel freigegeben werden. - Pipette einen Tropfen der verdünnten Polystyrol-Kügelchen-Dispersion (ca. 4 & mgr; l) auf einen 24x60 mm Deckglas und Transfer-Embryonen in diese Tropfen mit dem Mund Pipette.
- Vorsichtig einen kleinen (zB 18x18 oder 20x20 mm) Deckglas auf der Oberseite der Tropfen und sicherstellen, dass der Tropfen vollständig auszubreiten.
HINWEIS: Der Abfall sollte auch klein genug, um nicht die Ränder der kleinen Deckglas zu berühren. - Verschließen Sie die Halterung mit verflüssigtem Vaseline. Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die 24x60 mm Deckglasseite und fahren Sie mit Abschnitt "Zeitraffer-Mikroskopie".
2. Herstellung von Adult C. elegans Tiere für Zeitraffer-Mikroskopie mit Nanobeads
HINWEIS: In der Regel wird das Protokoll für die Montage erwachsenen Tieren ist eine Anpassung des Protokolls von ref. 18.Mit diesem Protokoll ist es möglich, langfristige Zeitraffer-konfokale Mikroskopie von erwachsenen Tieren durchzuführen.
- Bereiten Sie eine 1,5% (w / v) Agarose-Lösung in M9-Puffer, Kochen (1 min, 100 ° C im Wasserbad oder in der Mikrowelle). Die Verwendung höherer Konzentrationen von Agarose wird nicht empfohlen, da dies zu der Extrusion des Darms und / oder Teile der Gonade führen.
- Halten Sie sich 2-3 Schichten des Bandes auf zwei Objektträger je. Platzieren Sie eine Diashow ohne Band zwischen den beiden Folien mit Klebeband.
- Verwenden Sie eine Pipettenspitze und einen Tropfen der heißen Agarose-Lösung in der Mitte des mittleren Rutsche. Platzieren schnell eine andere Folie auf die Tropfen, so daß es durch die Bandschichten auf jeder Seite unterstützt wird. Dies wird eine runde und flache Agar-Pad von rund 10 mm Durchmesser zu schaffen.
- Einen Tropfen 100 nm bead-Lösung (unverdünnt, das 2,6% (w / v)) auf die Unterlage. Bringen 1-10 gereinigt erwachsenen Würmer in den Tropfen mit einem Wurm Pick. Dichtung mit 18x18 mm Deckglas und Vaseline wie in Prot erklärtOcol 1.
3. Zeitraffer-Mikroskopie
- Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf den Objektträger oder Deckglas-Sandwich. Verwenden Hellfeld bei niedriger Vergrößerung (5x oder 10x-Objektive), um die Probe zu lokalisieren.
HINWEIS: Begrenzen Sie die Belichtung mit blauem Licht so viel wie möglich (insbesondere für C. elegans-Embryonen), beispielsweise nicht verwenden, Epi-Fluoreszenz-Mikroskopie zu finden / Fokus der Probe, sondern verwenden Hellfeld statt. - Wechseln Sie in höherer Vergrößerung (40x oder 60x Ziele), bringen die Probe in den Fokus (entweder zentralen Ebene oder oberen / unteren Ebenen der Probe in Abhängigkeit von der Erfassungssoftware).
- Stellen Sie die Abtastintervalle zu 30 Flugzeuge bei 1 & mgr; m Abstand erfasst jeden 1min. Für den Fall, ist eine automatisierte xy oder xyz-Stufen verfügbar sind, können mehrere Punkte in einer Sitzung aufgezeichnet werden. Wechseln Sie in den Fluoreszenz-Imaging und überprüfen Sie die Scharf.
HINWEIS: Versuchen Sie zu vermeiden, mit hohen Laserleistungen, lieber etwas längere Belichtungszeitenbei sehr niedrigen Intensitäten. Maßnahme aufgenommenen Bilder sofort, entweder in der Bildaufnahme-Programm oder in ImageJ zur Sättigung, die die Dynamikbereich Kulturen vermieden, und bedeutet auch übermäßige Strahlenexposition. - Starten Sie die Aufnahme des Zeitraffer-Serie.
HINWEIS: Um auszuschließen Analyse Artefakte, beginnen Sie mit langen (3-10 min) Zeitintervalle zwischen Proben Scannen und die stufenweise Erhöhung der Zeitstichproben zu den gewünschten Intervallen. Entwicklungszeitpunkt als auch Endpunkte in beiden Fällen ähnlich sein sollten, wenn sie eine statistische Analyse. Darüber hinaus ist es oft notwendig, Phototoxizität und die Überlebensrate zu bewerten. Daher erholen Probe aus der Halterung nach Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie und prüfen, ob sie weiter leben zu entwickeln /.
4. Die Rekonstruktion eines 3D Zellform-Modell mit IMOD
HINWEIS: IMOD-Software finden Sie auf der Web-Seite IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. Installation der Software beschreibend gibt. Bei der Verwendung von Windows-Betriebssystemen muss ein Unix-Toolkit installiert werden, was auch als ein Paket auf dem IMOD Homepage zu finden ist. Darüber hinaus gibt es ein hervorragend zusammengestellt 3dmod Einführung auf dem IMOD Webseite (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html) zur Verfügung.
- Öffnen Sie die Unix-Shell und geben Sie "IMOD". Das Fenster IMOD wird geöffnet. Wählen Sie die Datei mit den Rohdaten (idealerweise eine gestapelte tif oder ähnliches), aus denen ein 3D-Modell zu generieren.
- Suchen Sie die unten und oben von den Objekten in der ZAP-Fenster mithilfe der Informationsfenster (up & down Scroll-Tool).
- Starten Sie Verfolgen der Zell Konturen. Wichtig ist, dass jede Zelle eines Objekts. Beginnen Sie mit der oberen Ebene der einzelnen Zellen und erstellen Sie das erste Kontur es mit dem Informationsfenster. Blättern Sie nach unten in Z und legen Sie eine neue Kontur für jede z-Ebene.
- Wiederholen Sie den Vorgang für so viele Zellen wie benötigt wird, um in 3D zu modellieren. Vergessen Sie nicht, beim Start mit einer neuen Zelle ein neues Objekt zu erstellen.
NHINWEIS: Es gibt viele verschiedene Möglichkeiten für die Konturverfolgung und einige hilfreiche Plugins. Bitte besuchen Sie die IMOD Webseite und Online-Lernprogramme für weitere Einzelheiten. In dem hier gezeigten Fall ist die Standardeinstellung verwendet. - Öffnen Sie das Fenster "Modellansicht", um die Objekte und ihre Konturen zu inspizieren.
- In der Symbolleiste "Model View" wählen Sie "Edit" - "Objekte". Die jeweiligen Bearbeitungsfenster wird geöffnet.
- Zum Modellzellen gefüllten und verschlossenen Objekte, wählen Sie "Mesh" als "Zeichnen Sie Datentyp" und "Fill" als "Art zeichnet". Klicken Sie auf "Meshing" in der scrollbaren Auswahl an der unteren linken Seite des Fensters. Aktivieren Sie die Option "Cap" in der Auswahl in der unteren rechten. Überprüfen Sie so viele Objekte wie erforderlich und klicken Sie auf "Mesh-All". Das Programm wird feste Gegenstände von den Stapeln von Konturen zu erzeugen. Die z Sampling-Faktor kann durch Veränderung "Z-Skala" im Fenster "View" eingestellt werden.
- Verschieben / Drehen Sie den 3D object ("Edit" - "Ansicht") und speichern Schnappschüssen oder Movies ("Datei" - "Snap Tiff wie ..." oder "Movie / Montage").
5. Verfolgung fluoreszenzmarkierten Strukturen mit Endrov
HINWEIS: Um die Zellteilung Überreste zu verfolgen, verwenden Sie einen Stamm mit einer nuklearen oder Plasmamembran Marker für Zellidentifikation (zB H2B, PH-PLC-d1) und einer Zellteilung Rest Marker (zB NMY-2, ZEN-4 ). Die nukleare oder Plasmamembran-Markierung ist, um zu bestimmen, welche Zelle die Zellteilung Rest erbt.
- Für schnelles Laden und Benutzerfreundlichkeit hat der Rohdaten in eine TIFF-Datei umgewandelt werden (zB in ImageJ). Als nächstes öffnen Endrov und laden Sie die Datei an, indem Sie die "Datei laden" aus dem Datei-Menü analysiert werden. Klicken Sie auf das Symbol "2D-Viewer" auf der Symbolleiste.
- Passen Sie das Histogramm durch Klicken auf das Symbol "Fit-Bereich" (das blaue Symbol in der rechten unteren Eckeder Endrov Bildschirm). Stellen Sie die XYZ-Auflösung, indem Sie auf "Data" - "Dateiname" - "Imageset" - "Channel" - "Set XYZ-Auflösung". Geben Werte für X, Y und Z beispielsweise 5, 5, 1, wenn X und Y-Auflösung von 0,2 & mgr; m und jede Probe 1 um in Z.
- Für Anmerkungen der Kerne, auf die Ebene von Interesse bewegen und klicken Sie auf "2D-Viewer". Wählen Sie "Lineage" aus dem Dropdown-Menü und wählen Sie "Neue Linie".
- Durch Klicken und Ziehen auf den Kern, kann es zu kennzeichnen. Um den Kern Name mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Umbenennen Teilchen" im Dropdown-Menü. Zum Erhöhen oder Verringern der Durchmesser des Kreises, ziehen Sie den Pfeil-Symbol, das auf der linken Seite des markierten Kreis erscheint. Zur Mittelebene des Kerns zu markieren, klicken Sie die rechte Symbol. Bei Verwendung eines Plasmamembranmarker kann ein großer Bereich gezogen, daß die meisten von der Zelle abdecken wird.
- , In der Zeit und Fläche gehen, wählen Sie den "Rahmen" und "Z"Optionen in der unteren Symbolleiste. Nachdem Sie mit dem nächsten Zeitpunkt, passen Sie die Position oder Größe des Kreises, die den Kern entsprechend markiert. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Raupen Zelle teilt.
- Wenn es eine Zellteilung, markieren Sie die Tochterkerne und wechseln Sie zu "Lineage-Viewer". Dies kann durch Klicken auf das Symbol "Windows" in der oberen Symbolleiste ausgewählt werden. Markieren Sie alle drei Kerne gleichzeitig, um die Option "Lineage" gehen in der oberen Symbolleiste und wählen Sie "Mitarbeiterin Mutter".
- Wenn Zellverfolgung abgeschlossen ist, um den Kanal Kennzeichnung der Zellteilung Rest für die Verfolgung zu wechseln. Um Kanäle zu wechseln, klicken Sie auf den Dateinamen auf der linken unteren Ecke der Symbolleiste. Die Zellteilung Rest (oder eine andere Struktur) kann wie oben für den Kern beschrieben nachgeführt.
- Wenn nach dem Schließen der Rückkehr in die Software, ist es notwendig, den "2D-Viewer" zu gehen - "Lineage" - "Edit" und auf der Linie Zahl, die bearbeitet werden soll klicken.
6. Analysieren Cortical Actomyosin Fluss mit PIVlab
HINWEIS: PIVlab ist eine frei verfügbare Software von: http://pivlab.blogspot.de/; es kann von innerhalb der MATLAB-Kommandozeilenumgebung durch Eingabe PIVlab_GUI aufgerufen werden. Bei der Arbeit mit PIVlab, ist es empfehlenswert, um das Bild-Serie in einem separaten Ordner speichern.
- Starten Sie eine neue Sitzung von "Menü Datei". Laden Sie die Image-Dateien, indem Sie auf die Schaltfläche "Bilder laden".
- Wählen Sie die Sequenzierung style 1-2, 2-3, ... und navigieren Sie zum Verzeichnis, das die Sequenz von gewünschten Bilder enthält. Wählen Sie die Bilder und klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen" und Import.
- Gehen Sie auf "Analysen-Einstellungen" und wählen Sie "Ausschlüsse (ROI, Maske)". Alternativ drücken Sie "Strg + E". Über die Schaltfläche "Draw-Maske (n) für die aktuelle Frame", um den unerwünschten Teil der Bild / s (dh Bereich außerhalb Embryos) zu inaktivieren.
- Wählen Sie "PIV-Einstellungen" from das Menü "Analyse-Einstellungen". Alternativ drücken Sie "Strg + S". Wählen Sie "FFT-Fenster Verformung", wie die gewünschte PIV-Algorithmus.
HINWEIS: Fast-Fourier-Transformation (FFT) reduziert den Rechenaufwand, sondern wird nur empfohlen, das Signal weit über Lärm und wenn die Verschiebung der untersuchten Partikel hat die Hälfte den Pass Bereich analysiert nicht überschreiten (siehe 6.5) ist. - Geben Sie die folgenden Werte für die drei Durchgänge, die die Fläche der Vernehmung zur Intensitätskreuzkorrelation zwischen aufeinanderfolgenden Bildern sind: Überschreiten 1: Interrogation Bereich von 64 Pixeln mit einem Schritt des 32. Pass 2: Vernehmungs Fläche von 32 Pixeln mit einem Schritt von 16 . Wählen Sie "linear" aus dem Fenster Verformung im Dropdown-Menü. Wählen Gauß-2 * 3-Punkt-Methode zur Subpixel-Verschiebung Schätzung.
- Wählen Sie "Analysieren" von Analyse-Menü und verwenden Sie die Schaltfläche "Analysieren Sie alle Frames", eine Analyse zu beginnen.
- Für die Nachbearbeitung wählen Sie "Vector Validierung" von "; Nachbearbeitung "Menü und stellen Sie die Standardabweichung (Stdev) Filterschwelle bis 7 und gelten für alle Bilder.
- Wählen Sie "Leiten Sie Parameter / Daten ändern" aus dem Menü "Plot". Wählen Sie "Vektoren [Pixel / Frame]" vom Dropdown-Menü. Einstellen der Glätte der Vektoren und Hochpaßfilter und gelten für alle Frames.
- Zur Berechnung der Mittelvektoren aller Rahmen, setzen Sie die "Gebrauchte Rahmen" bis 1: Ende und klicken Sie "Gesamtmittelvektoren" -Taste.
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Representative Results
Durch die Verwendung von Protokollen 2, 3, und 4, Zeitraffer-Bildgebung der Gonaden in Wildtyp C. elegans Erwachsenen durchgeführt wird (Stamm OD58 (unc-119 (ED3) III; ltIs38 [PAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), ein Membranmarker exprimierenden von einem Keimbahn-Promotor ). Die Konzentration auf die Wende des Gonaden wird ein 3D-Modell der Keimzellen von den Mikroskopiedaten (Abbildung 2) erzeugt wird. Dieses Modell erlaubt es, Veränderungen in der Zellgröße zu analysieren, während die Zellen Transit bilden die distal nach proximal Arm, zeigt die Organisation der rachis und die Größe der Kontakte von einzelnen Zellen auf die rachis (siehe auch http: //www.wormatlas. org / Zwitter / Keim% 20LINE / Germframeset.html).
Weiter, Protokolle 1, 3 und 5 werden verwendet, um langfristige Zeitraffer-Mikroskopie C durchführen elegans Embryonen (Stamm CHP52 die eine Querdehnungs RW10226 (unc-119 (ED3) III ist; itIs37 [pie-1P :: mCherry :: H2B :: pie-1 3'UTR + unc-119 (+)]; stIs10226 [his-72-PromotorHIS-24 :: mCherry translationale Fusion mit let-858 3'-UTR + unc-119 (+)]) und Belastung LP162 (Nmy-2 (CP13 [Nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). In diesem Stamm ist es möglich, beide Kerne (über die mCherry-Histon-Fusionsproteine) und Zellteilung Reste (durch genomisch modifizierten nicht Muskelmyosin II-Locus, wo ein GFP in Rahmen durch die CRISPR integriert / Cas9 Technik 19 folgen ) gleichzeitig bei der Verwendung von zwei-Farben-Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 3, links Platten). Die von lineaging beider Strukturen in Endrov erhalten Modelle zeigen die zuvor beschriebenen stereotype Muster der Zellteilung Rest Vererbung 13,14. Außerdem wurden aus den lineaging Daten der Spuren für jede Zelle und die Zellteilung Rest (Abbildung 3, rechte Felder) und dem Zeitpunkt der Zellteilung Rest Persistenz (bezogen auf das NMY-2 -Signal GFP) sowie der Zusammenhang zur Zell Division Timing erzielt werden (<strong> 4, für die ABA-Linie nur) gezeigt. Bei Verwendung eines Plasmamembranmarker zusätzlich ist es auch möglich, den Zeitpunkt der Zellteilung Rest Internalisierung beobachten.
Schließlich wird durch Verwendung von Protokollen 1, 3 und 6, kurzfristige Zeitraffer-Mikroskopie mit hoher zeitlicher Auflösung (5s Intervalle zwischen der Aufnahme eines Z-Stapel) der kortikalen nicht Muskelmyosin II (NMY-2 GFP) durchgeführt wird. Der Fokus liegt hier auf die Unterschiede in der Dynamik der kortikalen Polarisationsfluss durch Vergleich dieser Fluss zwischen Wildtyp und Embryonen für die Rho GTPase-aktivierendes Protein RGA-3 20,21 RNAi verarmten. Ähnlich bisherigen Beobachtungen 22, fließt in Wildtyp-Embryonen überwiegend entlang der langen Achse des Embryos (5, linke Felder), während die Strömung in der RGA-3 RNAi Embryo ist orthogonal zu dieser Achse. Dieses ist von Überlagerung aufeinanderfolgenden Zeitpunkten oder aus den PIV Analytik offensichtlichist (Abbildung 5, Bodenplatten).
Um diese Unterschiede zu beobachten, ist es wichtig, um ein Abtastintervall zu wählen, daß kortikale Strömungsteilchen eindeutig für eine genaue Interpretation der Daten gelöst werden. Kleinere Zeitintervalle (≤5 sec) wird empfohlen, große Verschiebungen und fehlende Vektoren zu vermeiden. Das Abfragefenster sollte groß genug sein, um die Größe der zu analysierenden Teilchen (Rindengranulate) aufzunehmen. Überlappung zwischen benachbarten Abfragefenster erlaubt es, den Vektor Abstand verringern und erhöht die Zahl der Vektoren in dem Gitter so.
Abbildung 1. Zusammenstellen einer Mund-Pipette. Links: Ersatzteile benötigt, um ein Mundpipette mit Filter montieren. Rechts:. Die zusammengebaute Pipetten BitteKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Ein 3D-Modell der Gonade wiederum Region Links oben:. 3D-Projektion eines einzigen Zeitpunkt von Zeitraffer-Mikroskopie Daten. Top Mitte und rechts: 3D-Modelle der Mikroskopie Daten. Unten:. Einzelheiten zell rachis Kontakte Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Spurhaltung von Keimen und Zellteilung Überreste. Links: 3D-Projektionen von Zeitraffer-Mikroskopie Daten. Mitte: Momentaufnahmen der vom Tracking beide Kerne (farbige Kugeln) und Zellteilung Überreste (graue Kugeln) erhaltenen Modells. Rechts: Snapshotsvon Zellteilung Rest Tracking. Die Pfade für die Reste sind ebenfalls dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Handy und Zellteilung Rest Abstammungslinien für die ABA sublineage. Stammbaum von einer repräsentativen Embryo gezeigt. Zellteilungen sind durch Quadrate gekennzeichnet. Jeder Teilstrich entspricht 1 min. Die Zellteilung Überreste wurden nach den Töchtern, die sich aus der Division, in der die Reste erzeugt entstehen, benannt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Analyse der kortikalen Kontraktionsströmung mit PIV Top:. 3D-Projektionsbilder aus Zeitraffer-Mikroskopie, die den Beginn (erste Reihe) und Ende (zweite Reihe) des Zeitfensters verwendet werden, um das Vektorfeld mit PIVlab Berechnung darzustellen. Die dritte Reihe von Platten zeigt die Überlagerung von allen Zeitpunkten des Zeitfensters. Unten:. Vektorfelder durch PIVlab erhalten Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Video 1 -. Seiten, die von 2. Ein 3D-Modell der Gonaden wiederum Region Abbildung Das Video beginnt mit Scrollen durch den gesamten Stapel von Ebenen, um Segment verwendet die Zellen. Danach wird ein 3D maximale Vorsprung des Stapels gezeigt ist, gefolgt von der 3D segementation Modell um die x und y-Achsen (mit und ohne rachis die segmentierten Gonade ist) dreht.
Video 2 - Seiten, die von 3. Spurhaltung von Keimen und Zellteilung Überreste Abbildung links: 3D-Projektionen von Zeitraffer-Mikroskopie Daten.. Mitte: Die vom Tracking beide Kerne (farbige Kugeln) und Zellteilung Überreste (graue Kugeln) erhaltenen Modells. Rechts: Die Zellteilung Überreste und ihre Flugbahnen. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Video 3 - Seiten, die von 5. Analyse der kortikalen Kontraktionsströmung mit PIV Abbildung 3D maximale Projektions Zeitraffer-Aufnahmen von einem Vertreter Wildtyp und RGA-3 RNAi Embryonen verwendet werden, um das Vektorfeld mit PIVlab Maßstabsbalken berechnen.. = 10 um.
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Discussion
Durch Objektverfolgung in der Entwicklung, insbesondere Kern Tracking, ist es gelungen, den zentralen Mustermechanismen aufzuklären C. elegans Embryogenese 1,23,24. Der Ausbau dieser Strategie um einen höheren Durchsatz, hat es vor kurzem gelungen, zusätzliche Strukturierungsregeln aufzudecken und schlagen eine Methode, wie man Strukturierungsregeln ableiten, De-novo-10. Für viele Mutanten sind jedoch die präzise Strukturierung Defekte noch unbekannt. Die hier beschriebenen Methoden sind Werkzeuge, die maßgeblich an deren Aufklärung sein. Wichtig ist, hat es sich in den letzten Jahren deutlich, dass obwohl viele andere Modellsysteme nicht über eine unveränderliche Entwicklung wie C. folgen elegans, Objektverfolgung und Analyse der quantitativen Tracking-Daten ist ein wichtiges Instrument, um Entwicklungsmechanismen und Mechanismen der Krankheit zu identifizieren.
Die hier gezeigten Methoden sind in der Lage besonders gut geeignet, wo es entweder zu seinherausfordernde, um komplexere und / oder selbst generierte Softwarelösungen oder einfach zu teuer zu implementieren, um kommerzielle Software-Tools zu implementieren sind. Wichtig ist, dass die Werkzeuge, die hier beschrieben ermöglichen dem Forscher zu laden und alle Daten unabhängig auf welchem Instrument ihrer Aufnahme analysieren. Außerdem, wenn proprietäre Bildaufnahme-Software verwendet wird, bietet ImageJ die Bio-Formate Plugin, das Daten in proprietären Formaten zu laden und speichern Sie sie in Standardformaten (JPEG, TIFF) können.
Ein entscheidender Schritt in alle Protokolle, die auf Zeitraffer-Mikroskopie angewiesen ist, um die Bedingungen Recht zu ausreichenden Kontrast in der Mikroskopie Bilder zu erhalten, und, zur gleichen Zeit, um die Strahlenexposition auf die Probe zu verringern. Dies hängt stark von der Art des Mikroskops verwendet, und es wird in der Regel empfohlen, schnelle Scan-Techniken, wie sich drehende Scheibe oder Single-Plane-Illumination-Mikroskopie verwendet. Speziell für PIV der kortikalen Dynamik, ältere Versionen von Punkt-Scanning-Mikroskope möglicherweise zu langsam, damit die Erfassung kortikalen Signale mit einer ausreichenden Auflösung und Geschwindigkeit, um gültige Analysen durchführen zu können. Daher ist es immer wichtig, sorgfältig die Strahlenbelastung und testen Sie die Überlebensfähigkeit der Probe. Darüber hinaus, obwohl die hier besprochenen Protokolle verwenden micobeads Embryonen zu montieren, ist es auch möglich, Agarose-Pads, die nur dauert ein wenig mehr Zeit zur Vorbereitung, aber ist weniger teuer und mit einiger Erfahrung gleichermaßen reproduzierbare verwenden. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass die Kombination von Agarose-Pad und Nanobeads ist die überlegene Verfahren zur langfristigen Immobilisierung von erwachsenen Würmer da es die Verwendung jeglicher lähmende Mittel, zB Levamisol vermeidet.
Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die Werkzeuge, die hier beschrieben haben ihre Grenzen, da sie nicht voll automatisierte Datenanalyse durchzuführen. Jedoch für Strukturen wie Zellteilung Resten, ist es oft schwierig zu einen molekularen Marker zu identifizieren, die nur senthält diese Struktur, die entscheidend für eine zuverlässige Tracking ist. Eine wichtige Herausforderung für die Zukunft liegt daher in einschließlich Features wie maschinelles Lernen und anpassungsErkennung / Segmentierungsalgorithmen in der einfach zu bedienenden und offenen Zugang Software, die wir hier diskutieren. Einige dieser Funktionen können auch in anderen Software-Module gefunden werden, insbesondere Software, die mit wiederholten Tracking über längere Zeitintervalle umgehen kann, oder dass große Mengen von Tracking-Daten (zB StarryNite / AceTree 25 oder Nucleitracker4D 26, die ausgelegt sind, zu vergleichen, Track Kerne mit Histon-Fusionsproteine oder Spindeln 27 oder Simi BioCell 28). Diese Instrumente kann komplexer zu implementieren, wenn Ziel-Tracking von anderen als Kerne Strukturen sein. Ungeachtet der besonderen Struktur, die verfolgt werden soll, sind diese Programme im Allgemeinen sehr hilfreich, wenn große Mengen von Bilddaten analysiert werden. Wichtig ist, dass die Kompatibilität zwischen dem oben genannten Software-Modules.
Bei der Arbeit mit anderen Modellsystemen (zB Fliegen Embryonen, Säugetierzellkulturen, etc.), sind die hier vorgestellten Methoden auch gut geeignet, um orthologen Strukturen zu verfolgen, wie oben beschrieben. Noch wichtiger ist, unabhängig von dem Modellsystem untersuchten unterschiedlichen subzellulären Strukturen, beispielsweise Zentrosomen, Nucleoli, Mikropartikel, Vesikel, etc. können ohne weiteres verfolgt werden kann, nur die Aufnahme-Parameter justiert werden, um vollständige Erfassung der Objektspuren sicherzustellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
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