Abstract
Kvantitativt fånga utvecklingsprocesser är avgörande för att härleda mekanistiska modeller och för att identifiera och beskriva muterade fenotyper. Här protokoll presenteras för framställning av embryon och vuxna C. elegans djur för kort och lång sikt time-lapse mikroskopi och metoder för spårning och kvantifiering av utvecklingsprocesser. De metoder som presenteras är baserade på C. elegans stammar tillgängliga från Caenorhabditis Genetics Center och på öppen källkod som kan enkelt implementeras i alla laboratorier oberoende av mikroskopi system som används. En rekonstruktion av en 3D-cell-form modellen med modellering programvara IMOD, manuell spårning av fluorescerande-märkta subcellulära strukturer med hjälp av multi-purpose bildanalysprogram Endrov, samt en analys av kortikal kontraktila flödet med PIVlab (Tids Lösta Digital Particle Image Velocimetry Verktyg för MATLAB) visas. Det diskuteras hur dessa metoder kan också sättas to kvantitativt fånga andra utvecklingsprocesser i olika modeller, till exempel spårning cell och härstamning spåra, spårning av vesikler flödet.
Introduction
Med ständiga förbättringar av fluorescerande proteiner, genomteknik, ljusmikroskop, och dator mjuk- och hårdvara, är det nu möjligt att registrera utvecklingen av många modellorganismer vid oöverträffad spatiotemporala upplösning. Detta gör det möjligt för forskare att ställa frågor som inte kunde behandlas tidigare eller att se över kända utvecklingsprocesser för att söka efter förbisedda aspekterna. Denna utveckling har väckt inom kvantitativ utvecklingsbiologi, som syftar till att omvandla kvalitativa, informella modeller i kvantitativa modeller med noggranna mätningar och statistiska analyser.
Spårnings celler och subcellulära strukturer har gjort det möjligt att härleda kvantitativa modeller av embryonal utveckling, nervsystemets aktivitet, eller celldelning 1-12. Genom att spåra celldelning rester under tidig utveckling av C. elegans embryo, vi kunde nyligen avslöja att de följer en stereoskrivit bana och utgör viktiga polariserande faktorer 13,14.
Här är protokoll presenteras som gör kvantitativ utvecklingsbiologi närmar sig tillgänglig för icke-experter. Fokus ligger på tre raka framåt, fritt tillgängliga verktyg som är genomförbara i alla lab som har tillgång till standard konfokalmikroskopi och datorer. Dessa inkluderar ett protokoll för att generera 3D cellformer, ett protokoll för att spåra celldelning rester, och ett protokoll för att kvantitativt beskriva kortikala aktomyosin dynamik. Nematoden C. elegans används som ett exemplifierande fall är emellertid de metoder och verktyg som diskuteras här är lämpade för en mängd olika frågor i andra biologiska modeller, t.ex. odlade celler, vävnadsexplantat, organoids eller sfäroider, andra embryon, etc.
Generellt kan en del av de analyser som visas här också utföras med den populära öppen källkod verktyg ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; eller FIJI, "ingår batterier" den version av ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) för vilka många plugins för olika kvantitativa analyser finns tillgängliga. Men programmen diskuteras här är utformade för att ta itu med särskilda problem.
För det första, IMOD, en bildbehandling, modellering och display sviten kan användas för 3D rekonstruktioner av seriesnitt från elektronmikroskopi eller ljusmikroskop 15. IMOD innehåller också verktyg för att titta på 3D-data från alla riktningar. För det andra Endrov, ett Java-program för att utföra bildanalys, databehandling och anteckning av nätverk eller spår (bland annat) på grundval av en utökad plugin arkitektur, med ImageJ plugin kompatibilitet 16. Den innehåller över 140 bild behandling och en utbyggbar användargränssnitt i vilken modell och rådata visas separat. Dess källkod kan hittas på https://github.com/mahogny/Endrov. För det tredje, PIVlab, en MATLAB verktyg för digital partikelbild Velocimetry som tillåter användaren att kvantitativt och kvalitativt analysera partikelflödesfält 17. Användningen av detta program krävs en MATLAB licens som innehåller Bildbehandling Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab är ett program för att kvantitativt beskriva flödet. Det beräknar hastighetsfördelningen, storlek, vorticitet, divergens, eller klippa inom bildpar eller serier. För detta kors korrelerar det små områden av bilder (kallade passningar "i protokollenheten) i en bild par att härleda den mest sannolika partikel förskjutning. Denna korskorrelation ger en korrelationsmatris som kan analyseras i utrymmet eller frekvensdomänen med hjälp av antingen direkt korskorrelation eller en snabb Fouriertransformation (FFT), respektive.
Den utrustning som används här är ett inverterat mikroskop utrustat med en Nipkow ("spinning") skiva, en EMCCD, 488 och 561 nm standard fast-tillståndslasrar och 20x luft eller 40x eller 60x planen / Apochromat olje- eller vatten nedsänkning mål. Emellertid är det även möjligt att utföra tidsförlopp avbildning med andra avbildningsmodaliteter, t.ex. punkt-, linje- eller ark-avsökningslaserbaserad mikroskopi, multifoton mikroskopi samt epi-fluorescensmikroskopi kombinerad med dekonvolution eller strukturerad belysning. Fördelen med att använda ett Nipkow skivsystemet är den extremt snabb bildförvärv, särskilt om en strömmande mod (kontinuerlig rörelse och avsökning av objektet i z-dimensionen) är tillgänglig. Dessutom, för att förbättra upplösningen, kan en 1,5-faldig förstorings förlängare framför EMCCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av C. elegans embryon för Time-lapse Mikroskopi med hjälp av mikropärlor
- Överför gravida vuxna maskar med hjälp av en mask plocka (platinatråd) i en droppe M9 buffert och rensa bort bakterierna genom att först kraftig omrörning och sedan överföra varje mask till en intilliggande droppe M9 med hjälp av en ögonfrans monterad på en tandpetare / pipettspets eller använd ett spetsigt glaskapillär.
- Späd dispersion innehållande de 20 um polystyren diameter pärlor 10-faldiga i M9-buffert (1 L M9-buffert innehåller 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl och, efter autoklavering (20 min, 120 ° C), tillsätt ytterligare 1 ml av en 1 M MgSO 4 lösning).
- Gör en mun pipett från varje typ av tunt glas kapillär (t.ex., smältpunkt kapillärer eller kapillärer som används för att dra injektionsnålar), en ungefär 0,5 m lång bit gummi, silikon eller liknande material slang (idealt genomskinlig), en 200 | j, lpipettspets, locket på en 200 | j, l PCR-rör, ett hydrofobt filter för små sprutor (t ex., en 0,2 till 0,45 | im porstorlek och 15 till 50 mm i diameter Nylon, PTFE eller liknande material filter), och en 1000 mikroliter pipettspets . Denna typ av mun pipett säkerställer att ingen biologiskt material kan komma i kontakt med försöksledaren.
- Montera pipetten genom insättning av 200 mikroliter pipettspets med spetsen först in i röret och koppla in den med locket av ett PCR-rör, vilket har en central perforering som matchar diametern hos kapillären används. En mycket pekade syl eller beredning nål kan användas för att alstra perforeringen.
- Rita en tunn kapillär och sätt in den i perforeringen. Sätt in filtret i den andra änden av slangen och sätt i en 1000 mikroliter pipettspets som munstycket (figur 1).
- Dissekera gravida vuxna genom att skära maskar tvären vid vulva med en ren rakblad eller skalpell.
OBS: Vanligtvis kommer många embryon att vara expulsed efter kapning. Men om tidiga embryon behövs, de ibland måste frigöras från slaktkroppen med hjälp av en ögonfrans eller spetsig nål. - Pipett en droppe av den utspädda polystyrenkula dispersion (~ 4 pl) på en 24x60 mm täckglas och embryon överföring till denna minskning med hjälp av munnen pipett.
- Placera försiktigt en liten (t.ex. 18x18 eller 20x20 mm) omfattar glas ovanpå släpp och se till att nedgången har fullt utspridda.
OBS: Nedgången bör också vara tillräckligt liten för att inte röra kanterna på den lilla täckglaset. - Täta fästet med flytande vaselin. Tillsätt en droppe immersionsolja på 24x60 mm täckglas sidan och gå vidare till "Time-lapse Mikroskopi avsnittet.
2. Beredning av vuxna C. elegans Djur för Time-lapse Mikroskopi använder Nanobeads
OBS: I allmänhet är protokollet för montering av vuxna djur en anpassning av protokollet från ref. 18.Med detta protokoll, är det möjligt att utföra långsiktiga tidsförlopp konfokalmikroskopi av vuxna djur.
- Bered en 1,5% (w / v) agaroslösning i M9 buffert, koka (1 min, 100 ° C i vattenbad eller mikrovågsugn). Användningen av högre koncentrationer av agaros rekommenderas inte, eftersom detta kan leda till extrudering av tarmen och / eller delar av gonad.
- Stick ned 2-3 lager av tejp på två objektglas vardera. Placera en bild utan band mellan de två bilderna med tejp.
- Använd en pipettspets och placera en droppe av den varma agaroslösningen i centrum av den mellersta bilden. Snabbt placera en annan bild på droppen så att den stöds av bandskikten på varje sida. Detta kommer att skapa en rund och platt agar pad på ca 10 mm i diameter.
- Lägg en droppe 100 nm vulst lösning (outspädd, vilket är 2,6% (vikt / volym)) på dynan. Överför 1-10 rengjorda vuxna maskar i nedgången med en mask plocka. Täta med 18x18 mm täckglas och vaselin som förklaras i Protocol 1.
3. Time-lapse mikroskopi
- Sätt en droppe immersionsolja på objektglas eller täckglaset smörgås. Använd ljusfält vid låg förstoring (5x eller 10x objektiv) för att lokalisera provet.
OBS: Begränsa exponering för blått ljus så mycket som möjligt (i synnerhet för C. elegans embryon), t.ex. använd inte epi-fluorescens mikroskopi för att hitta / fokusera provet men använd bright istället. - Byt till högre förstoring (40x eller 60x mål), bringa provet i fokus (antingen central plan eller topp / botten plan av provet, beroende på förvärv programvara).
- Ställ in samplingsintervallen till 30 plan vid 1 pm mellanrum registreras varje 1min. Om en automatiserad XY eller xyz steg finns, kan flera punkter spelas in i en session. Växla till fluorescens avbildning och kontrollera skärpan igen.
OBS: Försök att undvika att använda hög lasereffekter, hellre använda något längre exponeringstidervid mycket låga intensiteter. Åtgärd förvärvade bilder direkt, antingen i bildförvärvs program eller i ImageJ för att undvika mättnad, vilka grödor dynamiken varierar och innebär också exponering överdriven strålning. - Börja spela in time-lapse-serien.
OBS: För att utesluta att analysera artefakter, börja med långa (3-10 min) tidsintervall mellan provskanning och gradvis öka temporal stickprovs till önskade intervall. Utvecklings timing samt slutpunkter i båda fallen bör vara densamma när du utför en statistisk analys. Dessutom är det ofta nödvändigt att bedöma fototoxicitet och överlevnadstal. Därför åter provet från berget efter långtids time-lapse mikroskopi och kontrollera om de fortsätter att utveckla / live.
4. rekonstruera en 3D-cellform modell med imod
OBS: IMOD mjukvara finns tillgänglig från imod webbsidan: http://bio3d.colorado.edu/imod/. Installation av programvaran är att beskrivad där. Om du använder Windows OS, har ett Unix verktygslåda som ska installeras, som också finns som ett paket på imod hemsida. Dessutom finns det en utmärkt samman 3dmod introduktion tillgänglig på IMOD webbsida (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).
- Öppna Unix shell och skriv in "IMOD". Den imod öppnas. Markera filen med rådata (helst en staplad tif eller liknande) för att generera en 3D-modell.
- Leta reda på botten och toppen av objekten i Zap fönstret med hjälp av informationsfönstret (upp & ner rullning verktyg).
- Börja spåra cell konturer. Viktigt är att varje cell är ett objekt. Börja med toppytan av varje cell och skapa den första kontur där med hjälp av informationsfönstret. Rulla nedåt i z och skapa en ny kontur för varje z-planet.
- Gör samma sak för så många celler som behövs för att modellera i 3D. Glöm inte att skapa ett nytt objekt vid start med en ny cell.
NOTE: Det finns många olika sätt för kontur spårning och flera hjälp plugins. Besök imod webbsida och självstudier online för mer information. I det fall som visas här har standardinställningen använts. - Öppna "Model View" fönstret för att inspektera objekt och deras konturer.
- I "Model View" verktygsfält välj "Edit" - "objekt". Respektive redigeringsfönstret öppnas.
- För att modellera celler som fyllda och stängda objekt, välj "Mesh" som "Rita Data Type" och "Fill" som "Drawing Style". Klicka på "Rullande" i rull val längst ned till vänster i fönstret. Markera alternativet "Cap" i markeringen på nedre högra. Kontrollera så många objekt som är nödvändigt och klicka på "Mesh alla". Programmet kommer att generera fasta föremål från högar av konturerna. Z-samplingsfaktor kan justeras genom att ändra "Z-skala" i "Visa" fönstret.
- Flytta / rotera 3D objektivtt ("Edit" - "Visa") och spara stillbilder eller filmer ("File" - "Snap Tiff som ..." eller "Film / Montage").
5. Spårning fluorescensmärkta Strukturer med Endrov
OBS: För att spåra celldelning rester, använda en stam med en nukleär eller plasmamembran markör för cellidentifikation (t.ex. H2B, PH-PLC-d1) och celldelning restmarkör (t.ex. Nmy-2, ZEN-4 ). Den nukleära eller plasmamembranet markör är viktigt att bestämma vilken cell ärver celldelnings kvarlevan.
- För snabb lastning och enkel användning, har rådata som skall omvandlas till en TIFF-fil (t.ex. i ImageJ). Nästa, öppna Endrov och läsa in filen som skall analyseras genom att välja "Ladda fil" från Arkiv-menyn. Klicka på "2D viewer" -ikonen i verktygsfältet.
- Justera histogram genom att klicka på "Fit intervallet" -ikonen (den blå ikonen längst ner till högerav Endrov skärmen). Ställ in XYZ upplösning genom att gå till "Data" - "filnamn" - "Imageset" - "Kanal" - "Set XYZ-upplösning". Skriv in värden för X, Y och Z, t.ex. 5, 5, 1 om X och Y resolutionen 0,2 um och prova varje 1 pm i Z.
- Frambringa kärnorna, flytta till planet av intresse och klicka på "2D viewer". Välj "Lineage" i rullgardinsmenyn och välj "Nytt härstamning".
- Genom att klicka och dra på kärnan, kan det märkas. För att nämna kärnan, högerklicka och välj "Byt namn partikel" i rullgardinsmenyn. För att öka eller minska diametern på den cirkel, drar pilen som visas till vänster om den markerade cirkeln. För att markera det centrala planet av kärnan, klicka på den högra ikonen. När du använder en plasmamembran markör, kan en stor sfär dras som kommer att täcka större delen av cellen.
- För att fortsätta i tid och plan, välj "Frame" och "Z"På det nedre verktygsfältet. Efter att gå till nästa tidpunkt, justera positionen eller storleken på cirkeln som markerar kärnan därefter. Upprepa detta tills de spårade cellen delar.
- När det finns en celldelning, markera dotterkärnorna och byta till "Lineage viewer". Detta kan väljas genom att klicka på "Windows" -ikonen på verktygsfältet. Markera alla tre kärnor samtidigt, gå till "Lineage" i det övre verktygsfältet och välj "Associate förälder".
- När spårning cell är klar, växla till kanalen markerar celldelning rest för att spåra. För att byta kanal, klicka på filnamnet i det nedre vänstra hörnet av verktygsfältet. Celldelnings rest (eller någon annan struktur) kan spåras som beskrivits ovan för kärnan.
- När han återvände till programvaran efter stängning, är det nödvändigt att gå till "2D Viewer" - "Lineage" - "Redigera" och klicka på härstamning nummer som ska redigeras.
6. Analysera Kortikal aktomyosin Flow med PIVlab
OBS: PIVlab är en fritt tillgänglig programvara från: http://pivlab.blogspot.de/; det kan åberopas inifrån Matlab kommandoraden miljö genom att skriva PIVlab_GUI. När du arbetar med PIVlab, rekommenderas att spara bildserien i en separat mapp.
- Starta en ny session från "Arkiv-menyn". Ladda bildfiler genom att klicka på "Ladda bilder" -knappen.
- Välj sekvense stil 1-2, 2-3, ... och navigera till den katalog som innehåller sekvensen av önskade bilder. Markera bilderna och klicka på knappen och import "Lägg till".
- Gå till "Analyser inställningar" och välj "Undantag (ROI, Mask)". Alternativt kan du trycka "Ctrl + E". Använd knappen "Draw mask (s) för aktuell ram" för att inaktivera den oönskade delen av bilden / s (dvs området utanför embryo).
- Välj "PIV Inställningar" frOm menyn "Analyser Inställningar". Alternativt kan du trycka "Ctrl + S". Välj "FFT fönster deformation" som önskade PIV-algoritmen.
OBS: Snabb Fouriertransformation (FFT) minskar beräkningskostnad men rekommenderas endast signalen är väl över buller och om förskjutningen av partiklarna studerade inte överstiger halv passområdet analyseras (se 6,5). - Ange följande värden för de tre passager, som är området för förhör för intensitetskorskorrelationen mellan efterföljande bilder: Pass 1: Interrogation område på 64 pixlar med ett steg med 32. Pass 2: Interrogation område på 32 pixel med ett steg med 16 . Välj "linjära" från fönstret deformation rullgardinsmenyn. Välj Gaussian 2 * 3-punkts-metoden för sub-pixel förskjutning uppskattning.
- Välj "Analysera" från Analys menyn och använd knappen "Analysera alla ramar" för att påbörja en analys.
- Efterbehandling välj "Vector validering" från "; Efterbehandling "menyn och ställ in standardavvikelsen (Standardavvikelse) filter tröskeln till 7 och gäller för alla ramar.
- Välj "Ta fram parametrar / ändra data" från menyn "Plot". Välj "vektorer [px / ram]" från rullgardinsmenyn. Justera jämnhet vektorer och högpassfilter och gäller för alla ramar.
- För att beräkna medel vektorer alla ramar, ställ in "Begagnade ramar" till 1: avsluta och klicka på "Beräkna medel vektorer" -knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att använda protokoll 2, 3 och 4, time-lapse avbildning av könskörtlar i vild typ C. elegans vuxna utförs (stam OD58 (UNC-119 (ED3) III, ltIs38 [pAA1, paj-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)]), som uttrycker en membranmarkör från en nedärvda promotor ). Fokusera på turn av gonad är en 3D-modell av könsceller genereras från mikroskopi data (Figur 2). Denna modell gör det möjligt att analysera förändringar i cellstorlek medan celler transitering bilda den distala till den proximala armen, avslöjar organisationen av rachis och storleken av kontakterna hos individuella celler för de rachis (se även http: //www.wormatlas. org / hermafrodit / groddar% 20line / Germframeset.html).
Nästa, protokoll 1, 3, och 5 används för att utföra långsiktiga time-lapse mikroskopi av C. elegans embryon (stam CHP52 som är en korsning av stam RW10226 (UNC-119 (ED3) III, itIs37 [paj-1p :: mCherry :: H2B :: paj-1 3'UTR + UNC-119 (+)]; stIs10226 [his-72 promotorHIS-24 :: mCherry translationell fusion med låt-858 3 'UTR + UNC-119 (+)]) och stam LP162 (Nmy-2 (CP13 [Nmy-2 :: gfp + LoxP]) I.). I denna stam, är det möjligt att följa båda kärnorna (genom mCherry-histon fusionsproteiner) och celldelning rester (genom genomiskt modifierade icke-muskel myosin II locus där en GFP har integrerats i ram genom crispr / Cas9 teknik 19 ) samtidigt vid användning av två-färg tidsförlopp mikroskopi (Figur 3, vänstra panelen). De modeller som erhålls genom lineaging av båda strukturerna i Endrov visar den tidigare beskrivna stereotypa mönster av celldelning kvarleva arv 13,14. Dessutom, från lineaging data, spår för varje cell och celldelning kvarleva (Figur 3, höger paneler) och tiden för celldelning kvarleva uthållighet (baserat på Nmy-2 GFP -signal) samt korrelation till cellen division timing kan erhållas (<strong> Figur 4, visas för ABA endast härstamning). Vid användning av en plasmamembranmarkör dessutom är det även möjligt att observera tidpunkten för celldelning kvarleva intemalisering.
Slutligen, genom att använda protokoll 1, 3 och 6, kortfristiga time-lapse mikroskopi med hög tidsupplösning (5s intervall mellan inspelning av ett z-stack) av kortikalt icke-muskel myosin II (Nmy-2 GFP) utförs. Fokus här ligger på skillnaderna i dynamiken i kortikalt polariserande flöde genom att jämföra detta flöde mellan vildtyp och embryon RNAi-utarmat för Rho GTPase aktiverande protein RGA-3 20,21. I likhet med de senaste observationer 22, flöde i vilda embryon typ är främst längs den långa axeln av embryot (Figur 5, vänster paneler), medan flödet i RGA-3 RNAi embryo är vinkelrät mot denna axel. Detta framgår tydligt från överliggande varandra följande tidpunkter eller från PIV analysär (Figur 5, bottenpanelema).
För att observera dessa skillnader, är det viktigt att välja en samplingsintervall, så att kortikala flödespartiklar kan lösas entydigt för noggrann tolkning av data. Mindre tidsintervall (≤5 sek) rekommenderas att undvika stora förskjutningar och saknade vektorer. Utfrågnings fönstret ska vara stora nog att rymma storleken på de partiklar som skall analyseras (kortikala granuler). Överlappning mellan angränsande frågefönster medger att reducera vektoravståndet och därmed ökar antalet vektorer i rutnätet.
Figur 1. Montering en mun pipett Vänster:. Delar som krävs för att montera en mun pipett med filter. Till höger:. Den sammansatta pipett VänligenKlicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. En 3D-modell av gonad tur region Överst till vänster:. 3D-projektion av en enda tidpunkt från tidsförlopp mikroskopi uppgifter. Högst upp i mitten och höger: 3D-modeller av mikroskopi data. Nederst:. Uppgifter om cell rachis kontakter Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Spårning av kärnor och celldelning rester Vänster:. 3D-prognoser från tidsförlopp mikroskopi uppgifter. USA: Ögonblicksbilder av modell som köpts från att spåra båda kärnorna (färgade kulor) och celldelning rester (grå sfärer). Höger: Ögonblicksbilderfrån celldelning rest spårning. Banorna för resterna visas också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Cell och celldelning rest härstamningar för ABA sublineage. Linjerna från ett representativt embryo visas. Celldelningar är markerade med kvadrater. Varje bock motsvarar en min. Celldelningen resterna namngavs efter döttrarna som uppkommer vid divisionen under vilken kvarlevan genereras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Analys av kortikalt kontraktila flöde med PIV Top. 3D projektionsstillbilder från tidsförlopp mikroskopi som skildrar start (första raden) och slutet (andra raden) i tidsfönstret som används för att beräkna vektorfält med PIVlab. Den tredje raden av paneler visar en överlagring av alla tidpunkter i tidsfönstret. Nederst:. Vektorfält som erhållits genom PIVlab Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1 -. Relaterade till figur 2. En 3D-modell av gonad tur regionen Videon börjar med att bläddra igenom hela bunten med flygplan som används för att segmentera cellerna. Efteråt en 3D maximal projektion av stapeln visas, följt av 3D segementation modellen roterar kring x- och y-axlar (med och utan den segmente gonad s rachis).
Video 2 - i samband med figur 3. Spårning av kärnor och celldelning rester Vänster: 3D prognoser från tidsförlopp mikroskopi data.. Mitten: Den modell som köpts från att spåra båda kärnorna (färgade kulor) och celldelning rester (grå sfärer). Höger: celldelning rester och deras banor. Skalstreck = 10 | im.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Video 3 - i samband med figur 5. Analys av kortikalt kontraktila flöde med PIV 3D maximal projektions time-lapse inspelningar av ett representativt vildtyp och RGA-3 RNAi embryo används för att beräkna vektorfält med PIVlab Skala bar.. = 10 | am.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genom objektspårning i utveckling, i synnerhet kärnkrafts spårning, har det varit möjligt att klarlägga centrala mönstrings mekanismer för C. elegans embryogenes 1,23,24. Utöka denna strategi till högre genomströmning, har det nyligen varit möjligt att avslöja ytterligare mönstrings regler och föreslå en metod hur man härleda mönstring regler de novo 10. För många mutanter, men de exakta mönstring defekter är fortfarande okänd. De metoder som beskrivs här är verktyg som kan vara avgörande för deras klargörande. Viktigt, har det blivit tydligt de senaste åren att även om många andra modellsystem inte följer en oföränderlig utveckling som C. elegans, spårning och analys av kvantitativa spårningsdataobjektet är ett viktigt verktyg för att identifiera utvecklingsmekanismer och mekanismer för sjukdom.
De metoder som visas här är speciellt väl lämpade i situationen där det antingen skulle vara alltförutmaning att genomföra mer komplexa och / eller självgenererade mjukvarulösningar, eller helt enkelt för kostsamt att genomföra kommersiella mjukvaruverktyg, respektive. Det är viktigt att de verktyg som diskuteras här gör det möjligt för forskare att läsa in och analysera data oberoende på vilket instrument de har spelats in. Dessutom, om egen bild förvärv programvara används ger ImageJ Bio-format plugin som kan läsa in data i proprietära format och spara dem i standardformat (JPEG, TIFF).
Ett kritiskt steg i alla protokoll som är beroende av tidsförlopp mikroskopi är att välja de villkor rätt att få tillräcklig kontrast i mikroskopiska bilder, och samtidigt, för att minska exponering för strålning med förlagan. Detta beror mycket på vilken typ av mikroskop som används och det är allmänt rekommenderas att använda snabba scanningstekniker såsom roterande skiva eller enda plan belysning mikroskopi. Specifikt för PIV av kortikala dynamik, äldre versioner av punkt-scanningmikroskop kan vara för långsam för att tillåta fånga kortikala signaler med en tillräcklig upplösning och hastighet för att utföra giltiga analyser. Det är därför alltid viktigt att noggrant utvärdera strålningsexponeringen och testa livskraft provet. Även om de protokoll som diskuteras här använder micobeads att montera embryon, är det också möjligt att använda agaros kuddar, som bara tar lite mer tid att förbereda, men är billigare och med viss erfarenhet lika reproducerbar. Det bör dock påpekas att kombinationen av agarosen pad och nanobeads är överlägsen metod för långsiktig immobilisering av vuxna maskar, eftersom den undviker användning av förlamande agent, t.ex. levamisol.
Det bör påpekas att de verktyg som diskuteras här har sina begränsningar, eftersom de inte utför helt automatiserad analys av data. Men för strukturer som celldelnings rester, är det ofta en utmaning att identifiera en molekylär markör som endast ärtains denna struktur, vilket är avgörande för tillförlitlig spårning. En stor framtida utmaning ligger därför bland annat funktioner som maskininlärning och anpassnings detektering / segmente algoritmer i den lättanvända och öppen tillgång programvara som vi diskuterar här. Några av dessa funktioner kan hittas i andra programvarumoduler, särskilt program som kan ta itu med upprepad spårning över längre tidsintervall, eller som kan jämföra stora uppsättningar av spårningsdata (t.ex. StarryNite / AceTree 25 eller Nucleitracker4D 26, som är utformade för att spår kärnor använder histon-fusionsproteiner eller spindlar 27, eller Simi BioCell 28). Dessa verktyg kan vara mer komplicerade att genomföra när som syftar till spårning av andra än kärnor strukturer. Oaktat den speciella struktur som ska spåras, är dessa program är i allmänhet mycket användbara när stora mängder bilddata kommer att analyseras. Det är viktigt att det finns kompatibilitet mellan ovan nämnda mjukvara modules.
När man arbetar med andra modellsystem (t.ex., fluga embryon, däggdjurs odlade celler, etc), de metoder som presenteras här är också väl lämpade för att spåra ortologa strukturer såsom beskrivits ovan. Ännu viktigare, kan oberoende av modellsystemet under utredning, olika subcellulära strukturer, t.ex. centrosomes, nukleolerna, mikropartiklar, vesikler, etc. lätt spåras, bara ackvisitionsparametrar måste justeras för att säkerställa fullständig fånga objekt spår.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
