Abstract
כמותית לכידת תהליכים התפתחותיים היא חיונית כדי להפיק מודלים ומפתח מכניסטית לזהות ולתאר פנוטיפים מוטציה. כאן פרוטוקולים מוצגים להכנת עוברים וג הבוגר elegans בעלי חיים למיקרוסקופיה זמן לשגות טווח קצר וארוך ושיטות למעקב וכימות של תהליכים התפתחותיים. כל השיטות שהוצגו מבוססות על ג זנים זמינים במרכז לגנטיקת Caenorhabditis ועל תוכנת קוד פתוח elegans שניתן ליישם בקלות בכל מעבדה עצמאית של מערכת מיקרוסקופיה בשימוש. בנייה מחדש של מודל תא-צורת 3D באמצעות IMOD תוכנת דוגמנות, (velocimetry תמונה דיגיטלי חלקיקים זמן נפתר מעקב ידני של מבני subcellular fluorescently שכותרתו באמצעות התכנית רב תכליתי ניתוח תמונת Endrov, וניתוח של זרימת התכווצות בקליפת המוח באמצעות PIVlab כלי לMATLAB) מוצג. הוא דן כיצד גם ניתן לפרוס שיטות אלה לאo ללכוד כמותית תהליכים התפתחותיים אחרים בדגמים שונים, לדוגמא, מעקב תא ושושלת ההתחקות, מעקב של זרימת שלפוחית.
Introduction
עם השיפורים מתמידים של חלבוני ניאון, הנדסה גנטית, מיקרוסקופ אור, ורך מחשב וחומרה, עכשיו זה אפשרי להקליט פיתוח של אורגניזמים מודל רבים ברזולוציה מרחב ובזמן חסרת תקדים. הדבר מאפשר לחוקרים לשאול שאלות שלא ניתן לטפל בעבר או לבקר תהליכים התפתחותיים ידועים כדי לחפש את היבטים התעלמו. התקדמות זו עוררה את תחום הביולוגיה התפתחותית כמותיים, שמטרתה להפוך את הדגמים איכותיים, פורמליים למודלים כמותיים על ידי מדידות יסודיות וניתוחים סטטיסטיים.
תאי מעקב ומבני subcellular הפכו אותו ניתן להפיק מודלים כמותיים של התפתחות עוברית, פעילות מערכת עצבים, או תא חלוקה 1-12. על ידי מעקב אחר שרידי חלוקת התא במהלך ההתפתחות המוקדמת של ג עובר elegans, אנו יכולים לחשוף לאחרונה שהם בצעו סטריאוקיטוב חשוב הקליד נתיב ומהווה גורמי 13,14.
הנה, פרוטוקולים מוצגים שהופכים את הביולוגיה התפתחותית כמותיים גישות נגישות לאינם מומחים. המוקד נמצא על שלושה כלים ישר קדימה, זמינים באופן חופשי כי הם ישימים בכל מעבדה יש לו גישה למיקרוסקופיה confocal סטנדרטית ומחשבים. אלה כוללים פרוטוקול כדי ליצור צורות תא 3D, פרוטוקול כדי לעקוב אחר שרידי חלוקת תא, ופרוטוקול לתאר כמותית דינמיקת actomyosin קליפת המוח. נמטודות ג elegans משמש כמקרה למופת, לעומת זאת, השיטות וכלים שנדונו כאן הם מתאימות למגוון רחב של שאלות במודלים אחרים ביולוגיים, למשל, תאים בתרבית, explants רקמות, organoids או spheroids, עוברים אחרים, וכו '
בדרך כלל, חלק מהניתוחים המוצגים כאן יכול גם להתבצע עם ImageJ כלי הקוד פתוח הפופולרי (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; או פיג'י, "הסוללות כלולות" גרסה של ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) שלתוספים רבים לניתוחים כמותיים שונים זמינים. עם זאת, התוכניות שנדונו כאן נועדו להתמודד עם בעיות ספציפיות.
ראשית, IMOD, עיבוד תמונה, דוגמנות וחבילת תצוגה יכולים לשמש לשחזורי 3D סעיפים סדרתי מאלקטרון או מיקרוסקופ אור 15. IMOD מכיל גם כלים להצגת נתוני 3D מכל כיוון. שנית, Endrov, תכנית Java נועדה לבצע ניתוח תמונה, עיבוד נתונים, וביאור של רשתות או רצועות (בין יתר) על בסיס ארכיטקטורת תוסף מורחב, עם תאימות תוסף ImageJ 16. הוא מכיל מעל 140 פעולות עיבוד תמונה וממשק משתמש להרחבה שבמודל והנתונים גולמיים מוצגים בנפרד. ניתן למצוא את קוד המקור שלה בhttps://github.com/mahogny/Endrov. שלישית, PIVlab, Mכלי ATLAB לvelocimetry תמונת חלקיק דיגיטלי המאפשר למשתמש כמותית ואיכותי לנתח זרימת חלקיקי שדות 17. השימוש בתוכניות זה טעון רישוי MATLAB הכולל עיבוד תמונת ארגז כלים (http://mathworks.com). PIVlab היא תכנית שנועדה לתאר זרימת כמותית. היא מחשבת את חלוקת מהירות, גודל, ערבוליות, סטייה, או הגזירה בתוך זוגות תמונה או סדרה. לשם כך, בין-קורלציה אזורים קטנים של תמונות ('עובר' בשם בסעיף הפרוטוקול) של צמד תמונה לגזור את עקירת חלקיקים הסבירה ביותר. חוצה קשר זה מניב מטריצת מתאם שניתן לנתח בתחום החלל או תדירות או באמצעות מתאם צולב ישיר או שינוי פורייה מהיר (FFT), בהתאמה.
הציוד המשמש כאן הוא מיקרוסקופ הפוך מצויד בניפקוב ("ספינינג") דיסק, EMCCD, 488 ומוצק 561 ננומטר סטנדרטילייזרים של מצב, ו20x אוויר או 40x או 60x תכנית / Apochromat מטרות נפט או מים טבילה. עם זאת, אפשר גם לבצע הדמיה הזמן לשגות עם שיטות הדמיה אחרות, למשל, על נקודה, סכן למעשה או מיקרוסקופיה גיליונות סריקה מבוססת לייזר, מיקרוסקופיה רב-פוטון, כמו גם במיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית בשילוב עם deconvolution או מובנה תְאוּרָה. היתרון של שימוש במערכת דיסק ניפקוב הוא רכישת תמונה מאוד מהר, במיוחד אם מצב הזרמה (תנועה וסריקה של האובייקט בממד z רציף) זמין. בנוסף, כדי לשפר את הרזולוציה, ניתן להשתמש במאריך מגדלת פי 1.5 מול EMCCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ג elegans עוברים לזמן לשגות מיקרוסקופית באמצעות microbeads
- העבר את התולעים בוגרות הרות להולדת באמצעות איסוף תולעת (חוט פלטינה) לירידה של חיץ M9 ולנקות את החיידקים על ידי התססה הראשונה במרץ ולאחר מכן העברה כל תולעת לירידה הסמוכה M9 באמצעות שוט עין רכוב על גבי טנדר שן / טיפ פיפטה או להשתמש בנימי זכוכית מחודדות.
- לדלל את הפיזור המכיל 20 מיקרומטר חרוזי פוליסטירן בקוטר של פי 10 במאגר M9 (1 חיץ L M9 מכיל 3 גרם KH 2 PO 4, 6 גרם Na 2 4 HPO, 5 גרם NaCl, ו, לאחר מעוקר (20 דקות, 120 מעלות C), להוסיף 1 מיליליטר נוסף של פתרון 1 M MgSO 4).
- הפוך פיפטה פה מכל סוג של זכוכית נימים דקות (למשל, נמס נימי נקודה או נימים משמשות למשוך מחטי הזרקה), חתיכת גומי, סיליקון או צינורות חומר דומה (באופן אידיאלי שקופים) בערך עוד 0.5 מ ', 200 μlטיפ פיפטה, המכסה של צינור PCR 200 μl, מסנן הידרופובי ומזרקים קטנים (למשל., .2-0.45 מיקרומטר גודל נקבובית ו15-50 מ"מ קוטר ניילון, PTFE או מסנן חומר דומה) קצה, ופיפטה 1,000 μl . סוג זה של הפה פיפטה מבטיח כי אין חומר ביולוגי יכול לקבל במגע עם הנסיין.
- להרכיב את פיפטה על ידי הוספת טיפ פיפטה 200 μl עם הטיפ ראשון לתוך צינורות ולחבר אותו עם המכסה של צינור PCR שבו יש נקב מרכזי התואם את הקוטר של הנימים בשימוש. מחט מרצע או הכנה מאוד הצביעה יכולה לשמש כדי ליצור הניקוב.
- לצייר נימים דקות ולהכניס אותו לתוך הניקוב. הכנס את המסנן לקצה השני של הצינור ולהכניס קצה פיפטה 1,000 μl כפי חתיכה (איור 1).
- לנתח מבוגרים הרה להולדת על ידי חיתוך רוחבי תולעים בפות בסכין גילוח נקי או אזמל.
הערה: בדרך כלל, עובר רב תהיה דוארxpulsed לאחר החיתוך. עם זאת, אם יש צורך בעוברים המוקדמים, הם לפעמים צריכים להשתחרר מהפגר באמצעות שוט עין או מחט מחודדת. - ירידת פיפטה אחד פיזור חרוז קלקר המדולל (~ 4 μl) על גבי זכוכית 24x60 מ"מ כיסוי ועוברי העברה לירידה זו באמצעות פיפטה הפה.
- בזהירות במקום קטן (למשל, 18x18 או 20x20 מ"מ) כיסוי זכוכית על גבי הירידה ולוודא הירידה התפשטה החוצה באופן מלא.
הערה: הירידה צריכה להיות גם קטנה מספיק כדי לא לגעת בקצוות של מכסה הזכוכית הקטנה. - לאטום את ההר עם וזלין הנוזלי. להוסיף טיפה של שמן טבילה בצד להחליק את מכסה מ"מ 24x60 ולהמשיך לסעיף 'זמן לשגות מיקרוסקופית ".
2. הכנת ג המבוגרים elegans בעלי חיים לזמן לשגות מיקרוסקופית באמצעות Nanobeads
הערה: באופן כללי, הפרוטוקול להרכבת בעלי חיים מבוגרים הוא עיבוד של הפרוטוקול מנ"צ. 18.עם פרוטוקול זה, ניתן לבצע מיקרוסקופיה confocal הזמן לשגות לטווח הארוך של בעלי חיים מבוגרים.
- הכן 1.5% (w / v) פתרון agarose במאגר M9, רתיחה (1 דקות, באמבט מים או במיקרוגל 100 מעלות צלזיוס). השימוש בריכוזים גבוהים יותר של agarose אינו מומלץ שכן זה יכול להוביל שלחול של המעי ו / או חלקים של בלוטת המין.
- היצמד למטה 2-3 שכבות של קלטת על שתי שקופיות מיקרוסקופ כל אחד. מקום שקופית ללא קלטת בין שתי השקופיות עם קלטת.
- השתמש בקצה פיפטה ולמקם את הטיפה אחת של פתרון agarose החם במרכז שקופית האמצע. עד מהרה את מקום שקופית אחרת על הירידה, כך שהיא נתמכת על ידי שכבות קלטת בכל צד. זו תיצור עגולה ומשטח אגר שטוח של כ 10 מ"מ קוטר.
- לשים טיפה של 100 ננומטר פתרון חרוז (חי, שהוא 2.6% (w / v)) על הכרית. העבר 1-10 תולעים בוגרות ניקו לירידה באיסוף תולעת. חותם עם מכסה זכוכית 18x18 מ"מ וזלין כמוסבר בProtocol 1.
מיקרוסקופיה 3. זמן לשגות
- לשים טיפה של שמן טבילה לשקופית מיקרוסקופ או כריך מכסה הזכוכית. השתמש brightfield בהגדלה נמוכה (5x או 10x עדשות) כדי לאתר את המדגם.
הערה: הגבל את החשיפה לאור הכחול ככל האפשר (בפרט לC. elegans עוברים), למשל, לא משתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית למצוא / להתמקד הדגימה אבל להשתמש brightfield במקום. - לשנות להגדלה גבוהה יותר (40x או 60x יעדים), להביא את המדגם אל מוקד (או מטוס מרכזי או מטוסים העליונים / תחתון של המדגם, בהתאם לתוכנת הרכישה).
- הגדר את מרווחי הדגימה עד 30 מטוסים במרווח 1 מיקרומטר נרשם כל 1min. במקרה הוא שלב XYZ-xy- או אוטומטי זמין, ניתן להקליט כתמים מרובים בפגישה אחת. לעבור להדמית הקרינה ולבדוק את הפוקוס שוב.
הערה: נסה להימנע משימוש סמכויות גבוה לייזר, ולא להשתמש בזמני חשיפה ארוכים במקצתבעוצמות נמוכות מאוד. מדד רכש תמונות מייד, או בתכנית רכישת תמונה או בImageJ כדי למנוע הרוויה, אשר יבולים הדינמיקה נעה וגם אומר חשיפה לקרינה מוגזמת. - להתחיל להקליט את סדרת הזמן לשגות.
הערה: כדי לא לכלול ניתוח ממצאים, להתחיל עם מרווחי זמן (3-10 דקות) ארוכים בין סריקת מדגם ולהגדיל את הדגימה זמנית בהדרגה לתדירות הרצויה. עיתוי התפתחותית, כמו גם נקודות קצה בשני המקרים צריך להיות דומה בעת ביצוע ניתוח סטטיסטי. יתר על כן, לעתים קרובות יש צורך להעריך שיעורי phototoxicity והישרדות. לכן, לשחזר דגימה מההר לאחר מיקרוסקופיה זמן לשגות לטווח ארוך ולבדוק אם הם ימשיכו לפתח / חיים.
4. שחזור מודל צורת תא 3D עם IMOD
הערה: תוכנת IMOD נגיש מדף האינטרנט IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. התקנה של התוכנה היא לתארשם ד. בעת שימוש במערכת ההפעלה Windows, Unix ערכת כלים חייבים להיות מותקנות, אשר גם ניתן למצוא כחבילה בדף אינטרנט IMOD. יתר על כן, יש הקדמת 3dmod הידור מצוין זמינה בדף אינטרנט IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).
- פתח את מעטפת יוניקס ולהקליד "IMOD". חלון IMOD ייפתח. בחר את הקובץ עם נתונים הגולמיים (באופן אידיאלי טיף או דומה מוערמים) שממנו ניתן ליצור מודל 3D.
- אתר התחתון והעליון של האובייקטים בחלון zap באמצעות חלון המידע (עד & למטה כלי גלילה).
- התחל העתקה קווי המתאר התא. חשוב לציין, להבטיח כי כל תא הוא אובייקט אחד. תתחיל עם המטוס העליון של כל תא וליצור את קווי המתאר הראשונים יש להשתמש בחלון המידע. לגלול למטה בz וליצור קווי המתאר חדשים לכל Z-מטוס.
- לעשות את אותו הדבר לתאים רבים ככל נחוץ למודל ב3D. אל תשכח ליצור אובייקט חדש כאשר מתחיל עם תא חדש.
NOTE: ישנן דרכים רבות ושונות לאיתור קווי המתאר וכמה תוספים מועילים. אנא בקר בדף האינטרנט IMOD והדרכות מקוונות לקבלת פרטים. במקרה שמוצג כאן, כבר השתמשה בהגדרת ברירת המחדל. - פתח את החלון "דגם התצוגה" כדי לבדוק את החפצים וקווי המתאר שלהם.
- בסרגל הכלים "דגם התצוגה" בחר באפשרות "ערוך" - "אובייקטים". חלון העריכה המתאים ייפתח.
- מודל תאים כאובייקטים מלאים וסגורים, לבחור "רשת" כמו "צייר סוג נתונים" ו "מילוי" כמו "ציור בסגנון". לחץ על "Meshing" בבחירה לגלילה בפינה השמאלית התחתונה של החלון. בדוק את "הכובע" האפשרות בבחירה בפינה הימנית התחתונה. בדוק חפצים רבים ככל נדרשים ולחץ על "Mesh כל". התכנית תפיק עצמים מוצקים מהערמות של קווי המתאר. גורם הדגימה-Z יכול להיות מותאם על ידי שינוי "Z בקנה מידה" בחלון "התצוגה".
- העבר / לסובב את objec 3Dt ("ערוך" - "תצוגה") ולשמור תמונות או סרטים ("קובץ" - "הצמד Tiff בשם ..." או "סרט / Montage").
5. מבני תווית המעקב fluorescently שעם Endrov
הערה: כדי לעקוב אחר שרידי חלוקת תא, להשתמש זן עם סמן קרום גרעין או פלזמה לזיהוי תאים (לדוגמא, H2B, PH-PLC-D1) וסמן שריד חלוקת תא (לדוגמא, Nmy-2, ZEN-4 ). סמן קרום הגרעין או פלזמה הוא חשוב כדי לקבוע אילו תא יורש את שריד חלוקת תא.
- לטעינה וקלות שימוש מהירים, נתונים הגולמיים יש להמרה לקובץ TIFF (למשל, בImageJ). בשלב הבא, Endrov הפתוח ולטעון את הקובץ להיות מנותח על ידי בחירה באפשרות "קובץ טען" מתפריט הקובץ. לחץ על הסמל "הצופה 2D" בסרגל הכלים.
- התאם את ההיסטוגרמה על ידי לחיצה על הסמל "מגוון Fit" (הסמל הכחול בפינה הימנית התחתונהשל מסך Endrov). הגדר את הרזולוציה XYZ על ידי הולך "נתונים" - "שם הקובץ" - "Imageset" - "ערוץ" - "הגדרת הרזולוציה XYZ". הקלד בערכי X, Y, Z ו, למשל, 5, 5, 1 אם הרזולוציה X ו- Y היא 0.2 מיקרומטר ולטעום כל 1 מיקרומטר בז
- להוספת הערות הגרעינים, לעבור למטוס של עניין ולחץ על "הצופה 2D". בחר "שושלת" מהתפריט הנפתח ובחר "שושלת חדשה".
- על ידי לחיצה וגרירה על הגרעין, ניתן לסמן אותו. לשם הגרעין, לחץ לחיצה ימנית ובחר באפשרות "שינוי שם חלקיק" מהתפריט הנפתח. כדי להגדיל או להקטין את הקוטר של העיגול, גרור את סמל החץ שמופיע בצד השמאל של המעגל המסומן. כדי לסמן את המטוס של הגרעין המרכזי, לחץ על הסמל הנכון. בעת שימוש בסמן קרום פלזמה, כדור גדול ניתן להסיק שיכסה את רוב התא.
- כדי להמשיך בזמן ובמטוס, לבחור את "מסגרת" ו- "Z"אפשרויות בסרגל הכלים התחתון. אחרי הולך לנקודת הזמן הבאה, להתאים את המיקום או גודל של המעגל שמסמן את הגרעין בהתאם. חזור על פעולה זו עד לתא מתחלק במעקב.
- כאשר יש חלוקת תאים, לסמן את גרעיני הבת ולעבור ל" הצופה שושלת ". זה יכול להיות שנבחר על ידי לחיצה על הסמל "Windows" בסרגל הכלים העליונים. סמן את כל שלושת הגרעינים בו זמנית, ללכת לאופצית "השושלת" בסרגל הכלים העליונים ובחר "הורה חבר".
- כאשר מעקב תא הוא סיים, לעבור לערוץ סימון שריד חלוקת תא למעקב. כדי לעבור ערוצים, לחץ על שם הקובץ בפינה השמאלית התחתונה של סרגל הכלים. שריד חלוקת התא (או כל מבנה אחר) יכול להיות במעקב כפי שתואר לעיל לגרעין.
- כשחזרתי לתוכנה לאחר הסגירה, יש צורך ללכת ל" 2D Viewer "-" שושלת "-" ערוך "וללחוץ על מספר השושלת שתעבור עריכה.
6. ניתוח בקליפת המוח Actomyosin זרימה עם PIVlab
הערה: PIVlab היא תוכנה זמינה באופן חופשי מ: http://pivlab.blogspot.de/; זה יכול להיות מופעל בסביבת שורת פקודת Matlab על ידי הקלדת PIVlab_GUI. כאשר עובד עם PIVlab, מומלץ לשמור את סדרת התמונה בתיקייה נפרדת.
- התחל הפעלה חדשה מתפריט "קובץ". טען את קבצי תמונה על ידי לחיצה על הכפתור "טעינת תמונות".
- בחר את סגנון רצף 1-2, 2-3, ... ולנווט לספרייה המכילה את הרצף של תמונות הרצויות. בחר את התמונות ולחץ על הכפתור "הוסף" ויבוא.
- עבור אל "הגדרות ניתוח" ובחר "חריגים (ROI, מסכה)". לחלופין, לחץ על "Ctrl + E". השתמש בכפתור "צייר מסכה (ים) למסגרת נוכחית" כדי להשבית חלק לא רצוי של התמונה / s (כלומר, האזור שמחוץ עובר).
- בחר באפשרות "הגדרות PIV" frאום התפריט "הגדרות ניתוח". לחלופין, לחץ על "Ctrl + S". בחר "עיוות חלון FFT" כאלגוריתם PIV הרצוי.
הערה: שינוי המהיר פורייה (FFT) מפחיתה את העלות חישובית אלא רק המליצה האות היא הרבה מעל רעש ואם התזוזה של החלקיקים למדו אינה עולה על מחצית מהשטח לעבור ניתוח (ראה 6.5). - הזן את הערכים הבאים לשלושת מעברים, המהווים את האזור של חקירה למתאם צלב עוצמה בין התמונות הבאות: לעבור 1: חקירת שטח של 64 פיקסלים בצעד 32. Pass 2: חקירת שטח של 32 פיקסלים בצעד של 16 . בחר באפשרות "ליניארי" מעיוות חלון תפריט הנפתחת. בחר שיטת 2 * 3 נקודות גאוס להערכת עקירה תת-פיקסל.
- בחר "נתח!" מתפריט ניתוח ולהשתמש בלחצן "לנתח כל המסגרות" כדי להתחיל ניתוח.
- לפוסט עיבוד בחר "אימות וקטור" מ"; תפריט ההודעה עיבוד "ולהגדיר את סף מסנן סטיית תקן (STDEV) עד 7 ויחול על כל המסגרות.
- בחר "לגזור פרמטרים / לשנות את הנתונים" מתפריט "עלילה". בחר "וקטורים [פיקסלים / מסגרת]" מתפריט הנפתח. התאם את החלקות של וקטורים ולעבור סינון גבוה ותחול על כל המסגרות.
- כדי לחשב וקטורים ממוצעים של כל המסגרות, להגדיר את "מסגרות משומשות" ל1: הסוף ולחץ על כפתור "חישוב וקטורים ממוצעים".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על ידי שימוש בפרוטוקולים 2, 3, ו -4, הזמן לשגות הדמיה של בלוטות מין בג הסוג בר elegans מבוגרים מתבצע (OD58 מתח (UNC-119 () III ed3; ltIs38 [pAA1; עוגה-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)]), מבטא את סמן קרום מאמרגן germline ). התמקדות בתור של בלוטת המין, מודל 3D של תאי הנבט נוצר מנתונים מיקרוסקופ (איור 2). מודל זה מאפשר לנתח שינויים בגודל תא בזמן מעבר התאים יוצר דיסטלי הזרוע הפרוקסימלית, חושף את הארגון של rachis והגודל של אנשי הקשר של תאים בודדים לrachis (ראה גם http: //www.wormatlas. org / אנדרוגינוס / נבט% 20line / Germframeset.html).
בשלב הבא, הפרוטוקולים 1, 3, ו -5 משמשים לביצוע מיקרוסקופיה זמן לשגות ארוך הטווח של ג elegans עוברים (CHP52 מתח שהוא הכלאה של RW10226 מתח (UNC-119 () III ed3; itIs37 [עוגה-1P :: mCherry :: 3'UTR-1 עוגת H2B :: + UNC-119 (+)]; stIs10226 [-72 אמרגן-24 שלו :: היתוך translational mCherry עם בואו-858 UTR '3 + וLP162 UNC-119 (+)]) המתח (Nmy-2 (cp13 [Nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). בזן זה, אפשר לעקוב אחרי שני הגרעינים (באמצעות חלבוני היתוך mCherry-היסטון) ושרידי חלוקת תא (באמצעות המוקד שונה genomically הלא השרירים שרירן השני בי GFP כבר משולב במסגרת דרך CRISPR / טכנולוגית Cas9 19 לוחות) בו זמנית בעת שימוש במיקרוסקופ הזמן לשגות בשני צבעים (איור 3, משמאל). המודלים מתקבלים על ידי lineaging של שני המבנים בEndrov להראות שתואר קודם לכן הדפוס הסטריאוטיפי של שריד ירושת חלוקת תא 13,14. יתר על כן, מנתונים lineaging, המסלולים לכל שריד תא וחלוקת תאים (איור 3, לוחות מימין) ואת הזמן של התמדת שריד חלוקת תאים (המבוסס על ה- GFP Nmy-2 -signal), כמו גם את המתאם לתא ניתן להשיג עיתוי החלוקה (<strong> איור 4, הראה לשושלת ABA בלבד). בעת שימוש בסמן קרום פלזמה בנוסף, אפשר גם לצפות בנקודת הפנמת שריד זמן חלוקת תא.
לבסוף, על ידי שימוש בפרוטוקולים 1, 3, ו -6, מיקרוסקופיה זמן לשגות לטווח קצר עם רזולוציה גבוהה זמנית (מרווחי 5S בין הקלטת Z- מחסנית) של שרירן שאינו שריר בקליפת המוח השני (Nmy-2 GFP) מבוצע. המוקד כאן טמון בהבדלים בדינמיקה של זרימת קיטוב בקליפת המוח על ידי השוואת זרימה בין סוג ועוברי RNAi מדולדל לחלבון הפעלת Rho GTPase RGA-3 20,21 הפראיים. בדומה לתצפיות האחרונות 22, לזרום בעוברי סוג בר הוא בעיקר לאורך ציר זמן של העובר (איור 5, לוחות משמאל), ואילו זרימה בעובר RNAi RGA-3 היא מאונך לציר הזה. זה ברור ממבט מכיסה נקודות זמן רצופות או מanalys PIVהוא (איור 5, לוחות למטה).
כדי לצפות בהבדלים אלה, חשוב לבחור מרווח דגימה כך שניתן לפתור זרימת חלקיקי קליפת המוח באופן חד משמעי לפרשנות מדויקת של נתונים. מרווחי זמן קטן יותר (≤5 שניות) מומלצים להימנע התקות גדולות ווקטורים חסרים. חלון החקירה צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל (גרגרי קליפת המוח) בגודל של החלקיקים להיות מנותח. חפיפה בין חלונות חקירה השכנים מאפשרת להפחית את מרווח וקטור ובכך מגדילה את מספר הווקטורים ברשת.
איור 1. הרכבת פיפטה פה שמאל:. חלקים הדרושים להרכבת פיפטה פה עם מסנן. מימין:. פיפטה התאספו אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מודל 3D של אזור תור בלוטת מין שמאל למעלה:. הקרנת 3D של נקודת זמן אחת מנתונים מיקרוסקופיה הזמן לשגות. אמצע למעלה וימינה: מודלים 3D של נתונים מיקרוסקופי. תחתון:. פרטים של אנשי קשר התא-rachis אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מעקב של גרעינים ושאריות חלוקת תא שמאל:. תחזיות 3D מנתוני מיקרוסקופיה הזמן לשגות. התיכון: תצלומי מסך של המודל המתקבל ממעקב שני הגרעינים (ספירות צבעוניות) ושרידי חלוקת תא (תחומים אפורים). מימין: מול המצלמהממעקב שריד חלוקת תא. הנתיבים לשרידים גם מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
שושלות שריד איור סלולארי 4. וחלוקת התא לsublineage ABA. השושלות מעובר נציג מוצגות. חלוקות תא מסומנות על ידי ריבועים. כל סימן לתקתק תואם 1 דקות. שרידי חלוקת התא נקראו על שם הבנות שעולות מהחטיבה שבמהלכו השריד נוצר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. ניתוח של זרימה בקליפת המוח התכווצות עם PIV למעלה:. סטילס הקרנת 3D ממיקרוסקופיה הזמן לשגות המתארות את ההתחלה (השורה הראשונה) וסוף (שורה השנייה) של חלון הזמן המשמש לחישוב שדה הווקטורים עם PIVlab. השורה השלישית של לוחות מציגה את הכיסוי של כל הנקודות של חלון הזמן. תחתון:. שדות וקטור מתקבלים על ידי PIVlab אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
וידאו 1 -. הקשורים לאיור 2. מודל 3D של אזור תור בלוטת מין הווידאו מתחיל עם גלילה באמצעות כל הערימה של מטוסים המשמשים למגזר התאים. לאחר מכן הקרנה המרבית 3D הערימה מוצג, ואחריו מודל segementation 3D מסתובב סביב x ו- y צירים (עם ובלי rachis של בלוטת המין המפולח).
וידאו 2 - הקשורים לאיור 3. מעקב של גרעינים ושאריות חלוקת תא שמאל: תחזיות 3D מנתוני מיקרוסקופיה הזמן לשגות.. התיכון: המודל המתקבל ממעקב שני הגרעינים (ספירות צבעוניות) ושרידי חלוקת תא (תחומים אפורים). מימין: שרידי חטיבה סלולארי והמסלולים שלהם. בר סולם = 10 מיקרומטר.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> וידאו 3 - הקשורים לאיור 5. ניתוח של זרימת התכווצות בקליפת המוח עם PIV הקלטות זמן לשגות 3D הקרנה המרבית של סוג נציג פראי וRGA-3 עובר RNAi המשמש לחישוב שדה הווקטורים עם PIVlab בר סולם.. = 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות מעקב אחר אובייקט בפיתוח, במעקב גרעיני מסוים, זה כבר אפשרי להבהיר מנגנוני דפוסים מרכזיים של ג elegans עובר 1,23,24. הרחבת אסטרטגיה זו לתפוקה גבוהה יותר, זה כבר אפשרי לאחרונה לחשוף כללי דפוסים נוספים ולהציע שיטה איך להסיק דפוסים שולטת דה נובו 10. למוטציות רבות, עם זאת, פגמי דפוסים המדויקים עדיין אינם ידועים. השיטות שתוארו כאן הן כלים שיכולים להיות אינסטרומנטלי בהבהרתם. חשוב לציין, זה הפך להיות ברור בשנים האחרונות שלמרות שרבי מערכות מודל אחרים לא פעלו פיתוח משתנה כמו ג elegans, מעקב אובייקט וניתוח הנתונים הכמותיים המעקב הוא כלי חיוני לזהות מנגנונים ומנגנונים של מחלה התפתחותית.
השיטות שמוצגים כאן הן מתאימות במיוחד במצב שבו היה גם להיות גםמאתגר ליישם פתרונות מורכבים יותר ו / או עצמי שנוצר תוכנה, או פשוט יקרים מדי ליישם כלי תוכנה מסחריים, בהתאמה. חשוב לציין, את הכלים שנדונו כאן לאפשר לחוקר לטעון ולנתח את כל הנתונים באופן עצמאי על שמכשיר שהם כבר נרשמו. יתר על כן, אם תוכנת רכישת תמונת קניינית משמשת, ImageJ מספק התוסף ביו-הפורמטים שיכולים לטעון נתונים בפורמטים קנייניים ולשמור אותם בפורמטים סטנדרטיים (JPEG, TIFF).
שלב קריטי בכל הפרוטוקולים המסתמכים על מיקרוסקופיה זמן לשגות הוא לבחור את התנאים נכון כדי להשיג ניגוד ראוי בתמונות מיקרוסקופית, ו, באותו הזמן, כדי להפחית את החשיפה לקרינה לדגימה. זה תלוי במידה רבה בסוג של מיקרוסקופ המשמש וזה בדרך כלל מומלץ להשתמש בטכניקות סריקה מהירות כמו דיסק מסתובב או מיקרוסקופיה תאורת מישור אחד. באופן ספציפי, לPIV של דינמיקה בקליפת המוח, גרסאות ישנות יותר של נקודה-סריקהמיקרוסקופים עשויים להיות איטיים מדי כדי לאפשר לכידת אותות בקליפת המוח ברזולוציה ומהירות לבצע ניתוחים בתוקף מספיק. לכן תמיד חשוב להעריך בזהירות החשיפה לקרינה ולבדוק את הכדאיות של הדגימה. בנוסף, למרות שהפרוטוקולים שנדונו כאן להשתמש micobeads להר עובר, אפשר גם להשתמש ברפידות agarose, שפשוט לוקחת קצת יותר זמן להכין אבל הוא פחות יקר ועם קצת ניסיון לשחזור במידה שווה. עם זאת, יש לציין כי השילוב של כרית וnanobeads agarose הוא השיטה מעולה לקיבוע לטווח הארוך של תולעים בוגרות שכן הוא ימנע את השימוש של כל סוכן משתק, למשל, levamisole.
יש לציין כי יש להם הכלים שנדונו כאן המגבלות שלהם מאז שהם לא לבצע ניתוח נתונים אוטומטי לחלוטין. עם זאת, למבנים כמו שרידי חלוקת תא, הוא לעתים קרובות מאתגר לזהות סמן מולקולרי שרק זהtains מבנה זה, שהוא חיוני למעקב אמין. אתגר עתיד גדול ולכן טמון בכולל תכונות כמו למידת מכונה ואלגוריתמי זיהוי / פילוח להתאמה בתוכנת הגישה קלה לשימוש ופתוחה שאנו דנים כאן. ניתן למצוא חלק מהתכונות הללו במודולי תוכנה אחר, בתוכנה מסוימת שיכול להתמודד עם מעקב חזר על מרווחי זמן ארוכים יותר, או שיכול להשוות קבוצות גדולות של נתונים למעקב (למשל, StarryNite / AceTree 25 או 26 Nucleitracker4D, אשר נועדו ל גרעיני מסלול באמצעות חלבוני היסטון-היתוך או צירים 27, או סימי BioCell 28). כלים אלה עשויים להיות מורכבים יותר לביצוע כאשר מכוונים מעקב של מבנים אחרים מאשר גרעינים. על אף מבנה המסוים שצריך להיות במעקב, תוכניות אלה הן בדרך כלל מאוד מועילות כאשר כמויות גדולות של נתונים תמונה תנותח. חשוב לציין, שיש תאימות בין מודולרי התוכנה שהוזכר לעילes.
כאשר עובדים עם מערכות מודל אחרות (למשל, לטוס עוברים, תאים בתרבית יונקים, וכו '), השיטות שהוצגו כאן הן גם מתאימות כדי לעקוב אחר מבני orthologous כפי שתואר לעיל. יותר מכך, באופן עצמאי של מערכת המודל תחת חקירה, מבני subcellular שונים, למשל, centrosomes, nucleoli, microparticles, שלפוחית, וכו 'יכול להיות במעקב בקלות, רק הפרמטרים הרכישה צריכים להיות מותאמים על מנת להבטיח לכידה של מסלולי אובייקט שלמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
