Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Kwantitatief vastleggen van ontwikkelingsprocessen is cruciaal om mechanistische modellen en belangrijke ontlenen aan mutante fenotypes te identificeren en te beschrijven. Hier protocollen worden gepresenteerd voor het bereiden van embryo's en volwassen C. elegans dieren voor de korte en lange termijn time-lapse microscopie en methoden voor het opsporen en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen. De gepresenteerde methoden zijn allemaal gebaseerd op C. elegans stammen beschikbaar in het Caenorhabditis Genetics Center en open source software die gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in elk laboratorium onafhankelijk van de gebruikte microscoop. Een reconstructie van een 3D-cel-vorm model met behulp van het modelleren software IMOD, handmatig bijhouden van fluorescent-gelabelde subcellulaire structuren met behulp van de multi-purpose beeldanalyse programma Endrov, en een analyse van de corticale contractie stroom met behulp PIVlab (tijdsopgeloste Digital Particle Image Velocimetry tool voor MATLAB) getoond. Er wordt besproken hoe deze werkwijzen ook kunnen worden ingezet to kwantitatief vast te leggen andere ontwikkelingsprocessen in verschillende modellen, bijvoorbeeld, mobiele tracking en lineage tracing, het bijhouden van blaasje flow.
Met de gestage verbetering van de fluorescerende eiwitten, genoom engineering, lichtmicroscopie en computer soft- en hardware, is het nu mogelijk om de ontwikkeling van vele modelorganismen opnemen met ongekende ruimtelijke en temporele resolutie. Dit stelt onderzoekers in staat om vragen die niet eerder konden worden aangepakt vragen of bekende ontwikkelingsprocessen opnieuw in om te zoeken naar het hoofd gezien aspecten. Deze vooruitgang is op het gebied van kwantitatieve ontwikkelingsbiologie, die gericht is op het transformeren van kwalitatieve, informele modellen in kwantitatieve modellen door een grondige metingen en statistische analyses aangewakkerd.
Tracking cellen en subcellulaire structuren heeft het mogelijk gemaakt om kwantitatieve modellen van embryonale ontwikkeling, zenuwstelselactiviteit of celdeling 1-12 afleiden. Door het bijhouden van celdeling resten tijdens de vroege ontwikkeling van het C. elegans embryo, konden we onlangs bekend dat zij volgen een stereogetypte pad en zijn belangrijke factoren polariserende 13,14.
Hier worden protocollen gepresenteerd waaruit kwantitatieve ontwikkelingsbiologie benaderingen toegankelijk voor niet-experts. De focus ligt op drie straight-forward, vrij beschikbare tools die implementeerbaar in een lab dat de toegang tot standaard confocale microscopie en computers heeft zijn. Deze omvatten een protocol om 3D cel vormen te genereren, een protocol bij de celdeling resten volgen en een protocol om corticale actomyosine dynamiek kwantitatief te beschrijven. De nematode C. elegans wordt gebruikt als een typisch geval echter de methoden en instrumenten die hier besproken zijn geschikt voor een verscheidenheid van vragen in andere biologische modellen, bijvoorbeeld gekweekte cellen, weefsel explantaten, organoids of sferoïden andere embryo's, etc.
In het algemeen, een aantal van de hier getoonde analyses kunnen ook worden uitgevoerd met de populaire open source tool ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; of Fiji, de 'batterijen' versie van ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) waarvoor veel plugins voor verschillende kwantitatieve analyses beschikbaar zijn. Echter, de programma's die hier besproken zijn ontworpen om specifieke problemen aan te pakken.
Allereerst IMD, een beeldverwerking, modelleren en weergave suite kan worden gebruikt voor 3D-reconstructies van seriële coupes van elektron of lichtmicroscopie 15. IMOD bevat ook gereedschappen voor het bekijken van de 3D-gegevens uit elke richting. Ten tweede, Endrov, een Java-programma dat is ontworpen om beeldanalyse, data verwerking en annotatie van netwerken of tracks (onder andere) aan de hand van een uitgebreide plugin architectuur te voeren, met ImageJ plugin compatibiliteit 16. Het bevat meer dan 140 image-verwerking en een uitbreidbare gebruikersinterface in welk model en ruwe data afzonderlijk worden weergegeven. De broncode is te vinden op https://github.com/mahogny/Endrov. Ten derde PIVlab een MATLAB hulpmiddel voor digitale Particle Image Velocimetry dat de gebruiker toelaat om deeltjes vloeivelden 17 kwantitatief en kwalitatief te analyseren. Het gebruik van deze programma's vereist een MATLAB licentie die de Image Processing Toolbox (http://mathworks.com) omvat. PIVlab is een programma ontworpen om kwantitatief te beschrijven flow. Het berekent de snelheid distributie, magnitude, vorticiteit, divergentie of afschuiving binnen het paren of reeksen. Hiervoor is cross-correlatie kleine gebieden afbeeldingen (zogenaamde "passen" in het protocol) van een beeldpaar de meest waarschijnlijke deeltje verplaatsing ontlenen. Dit kruiscorrelatie levert een correlatiematrix die in de ruimte of frequentiedomein met behulp van rechtstreekse kruiscorrelatie of een snelle Fourier transformatie (FFT), respectievelijk kunnen worden geanalyseerd.
De apparatuur die hier gebruikt is een omgekeerde microscoop uitgerust met een Nipkow ('spinnen') disc, een EMCCD, 488 en 561 nm standaard solid-state lasers, en 20x lucht of 40x en 60x plannen / Apochromat olie- of water-immersie doelstellingen. Het is echter ook mogelijk om time-lapse imaging voeren met andere beeldvormende modaliteiten, bijvoorbeeld punt-, lijn- of blad-scanning laser microscopie gebaseerde multi-foton microscopie, en epi-fluorescentie microscopie gecombineerd met deconvolutie of gestructureerde verlichting. Het voordeel van een Nipkow schijfsysteem is de extreem snelle beeldacquisitie, vooral als een streamingmodus (continue beweging en scannen van het object in de z dimensie) beschikbaar. Bovendien, om de resolutie te verbeteren, kan een 1,5-voudige vergroot extender voor het EMCCD gebruiken.
Door middel van het volgen object in ontwikkeling, met name de nucleaire tracking, is het mogelijk geweest om de centrale patroonvorming mechanismen van C. helderen elegans embryogenese 1,23,24. Uitbreiding van deze strategie tot een hogere doorvoersnelheid, is onlangs onmogelijk geweest om extra patronen regels te ontdekken en voor te stellen een methode hoe patronen afleiden regels de novo 10. Voor veel mutanten, maar de precieze patroon defecten nog onbekend. De hier b…
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
20 µm | |||
Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
0.1 µm | |||
Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |