Abstract
Quantitativamente capturar processos de desenvolvimento é crucial para derivar modelos mecanicistas e chave para identificar e descrever os fenótipos mutantes. Aqui são apresentados os protocolos para a preparação de embriões e adultos C. elegans animais para microscopia de lapso de tempo curto e longo prazo e métodos de rastreamento e quantificação dos processos de desenvolvimento. Os métodos apresentados são todos baseados em C. cepas elegans disponíveis a partir do Centro de Genética Caenorhabditis e no software de código aberto que pode ser facilmente implementado em qualquer laboratório independentemente do sistema de microscopia usado. A reconstrução de um modelo de célula-forma 3D usando o IMOD software de modelagem, o rastreamento manual de estruturas subcelulares fluorescente-etiquetados usando o multi-purpose programa de análise de imagem Endrov, e uma análise de fluxo contrátil cortical usando PIVlab (resolvida no tempo Velocimetry Digital Imagem de Partículas Ferramenta para MATLAB) são mostrados. Discute-se como esses métodos também podem ser implantados to quantitativamente capturar outros processos de desenvolvimento em diferentes modelos, por exemplo, rastreamento de linhagem celular e rastreamento, monitoramento do fluxo de vesícula.
Introduction
Com as melhorias estáveis de proteínas fluorescentes, engenharia de genoma, microscopia de luz, e soft e hardware de computador, agora é possível gravar desenvolvimento de muitos organismos modelo em sem precedentes resolução espácio-temporal. Isto permite aos investigadores fazer perguntas que não podem ser abordados anteriormente ou revisitar processos de desenvolvimento conhecidas, a fim de procurar os aspectos negligenciados. Este progresso tem suscitado o campo da biologia do desenvolvimento quantitativo, que visa transformar qualitativos, modelos informais em modelos quantitativos por meio de medições exaustivas e análises estatísticas.
Células de rastreamento e estruturas subcelulares tornou possível derivar modelos quantitativos do desenvolvimento embrionário, atividade do sistema nervoso, ou a divisão celular 1-12. Ao rastrear restos de divisão celular durante o desenvolvimento precoce do C. elegans embrião, poderíamos recentemente revelam que eles seguem um aparelho de somdigitado caminho e constituem fatores de polarização importante 13,14.
Aqui, os protocolos são apresentados que fazem biologia do desenvolvimento quantitativo aproxima acessível para os não-especialistas. O foco recai sobre três straight-forward, ferramentas livremente disponíveis, que são aplicáveis em qualquer laboratório que tem acesso a microscopia confocal padrão e computadores. Estes incluem um protocolo para gerar formas celulares 3D, um protocolo para rastrear restos de divisão celular, e um protocolo para descrever quantitativamente dinâmica actomiosina corticais. O nemátodo C. elegans é usado como um caso exemplar, no entanto, os métodos e ferramentas discutidas aqui são adequadas para uma variedade de questões em outros modelos biológicos, por exemplo, as células cultivadas, explantes de tecido, Organóides ou esferóides, outros embriões, etc.
Geralmente, algumas das análises mostrados aqui também pode ser realizada com a ferramenta aberta fonte populares ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; ou FIJI, os "baterias incluídas" versão do ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) para os quais muitos plugins para diferentes análises quantitativas estão disponíveis. No entanto, os programas aqui discutidos são projetados para resolver problemas específicos.
Em primeiro lugar, IMOD, um processamento de imagem, modelagem e suite do display pode ser usado para as reconstruções 3D de cortes seriados de elétron ou microscopia de luz 15. IMOD também contém ferramentas para visualizar os dados 3D a partir de qualquer orientação. Em segundo lugar, Endrov, um programa Java projetado para executar análise de imagem, processamento de dados, e anotação de redes ou faixas (entre outros), com base em uma arquitetura de plugins extensa, com ImageJ compatibilidade de encaixe 16. Ele contém mais de 140 operações de processamento de imagem e uma interface de usuário extensível em que modelo e dados brutos são exibidos separadamente. Seu código fonte pode ser encontrada em https://github.com/mahogny/Endrov. Em terceiro lugar, PIVlab, um HAtlab ferramenta para partículas de imagem digital velocimetria que permite que o usuário quantitativa e qualitativamente analisar campos de fluxo de partícula 17. O uso deste programas requer uma licença MATLAB, que inclui a Imagem Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab é um programa desenhado para descrever quantitativamente o fluxo. Ele calcula a distribuição de velocidade, magnitude, vorticidade, divergência ou de cisalhamento dentro de pares de imagens ou séries. Para isso, cross-se correlaciona pequenas áreas de imagens (chamado de "passes" na seção de protocolo) de um par de imagens para derivar o deslocamento de partículas mais provável. Esta correlação cruzada produz uma matriz de correlação que pode ser analisada, no espaço de domínio de frequência ou utilizando qualquer correlação cruzada directa ou uma transformação rápida de Fourier (FFT), respectivamente.
O equipamento utilizado é um microscópio invertido equipado com uma Nipkow ('fiação') do disco, uma EMCCD, 488 e 561 nm padrão sólido-lasers de estado, e 20x ou 40x de ar ou 60x plano / Apochromat objectivos óleo ou água-de imersão. No entanto, é também possível realizar imagem de lapso de tempo com outras modalidades de imagiologia, por exemplo, ponto-, linha- ou microscopia de varrimento de folha à base de laser, microscopia multi-fotão, bem como microscopia de epi-fluorescência combinado com desconvolução ou estruturada iluminação. A vantagem de utilizar um sistema de disco de Nipkow é a aquisição de imagem extremamente rápida, especialmente se um modo de fluxo contínuo (movimento contínuo e de varrimento do objecto na dimensão Z) está disponível. Além disso, para melhorar a resolução, um extensor de aumento de 1,5 vezes na parte dianteira do EMCCD pode ser usado.
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Protocol
1. Preparação de C. elegans embriões para Lapso de tempo Microscopia usando Microbeads
- Transferência de vermes adultos grávidas usando uma picareta verme (fio de platina) em uma gota de tampão M9 e limpar as bactérias pela primeira vigorosamente agitando e, em seguida, transferindo cada worm para uma queda adjacente de M9 usando um chicote do olho montada em uma picareta do dente / ponteira ou use um capilar de vidro aguçado.
- Dilui-se a dispersão contendo as 20 uM esferas de poliestireno diâmetro de 10-vezes em tampão M9 (1 tampão G M9 contém 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, e, depois de autoclavagem (20 min, 120 ° C), adicionar um adicional de 1 ml de uma solução 1 M 4 MgSO).
- Adicione uma pipeta de boca a partir de qualquer tipo de capilar de vidro fina (por exemplo, ponto de fusão capilares pontuais ou capilares usados para puxar as agulhas de injecção), cerca de um 0,5 m de comprimento pedaço de borracha, silicone ou material semelhante tubagem (de preferência transparente), A 200 ulponta da pipeta, a tampa de um tubo de PCR de 200 uL, de um filtro hidrofóbico de pequenas seringas (por exemplo., um 0,2-0,45 uM de tamanho de poro de 15-50 mm de diâmetro e de nylon, de PTFE ou material semelhante de filtro), e uma pipeta de 1000 ul ponta . Este tipo de boca pipeta garante que nenhum material biológico pode entrar em contacto com o experimentador.
- Montar a pipeta através da inserção da ponta de uma pipeta de 200 uL com a ponta primeiro para o tubo e ligá-lo com a tampa de um tubo de PCR, que apresenta uma perfuração central que coincide com o diâmetro do capilar utilizado. Uma agulha furador ou preparação muito apontada pode ser usado para gerar a perfuração.
- Desenhe um capilar fino e inseri-lo na perfuração. Inserir o filtro para a outra extremidade do tubo e inserir uma ponta de pipeta 1000 uL como peça de boca (Figura 1).
- Dissecar adultos grávidas cortando transversalmente vermes na vulva com uma lâmina de barbear limpa ou bisturi.
NOTA: Geralmente, muitos embriões e seráxpulsed após o corte. No entanto, se houver necessidade de embriões, às vezes eles têm que ser liberados a partir da carcaça usando um chicote do olho ou a agulha pontiaguda. - Pipetar uma gota da dispersão de bolhas de polistireno diluída (~ 4 mL) para uma tampa de vidro de 24x60 mm e em embriões de transferência de gota utilizando esta pipeta boca.
- Com cuidado, coloque um pequeno (por exemplo, 18x18 ou 20x20 mm) tampa de vidro no topo da gota e certifique-se a queda foi totalmente se espalhar.
NOTA: A queda também deve ser pequeno o suficiente para não tocar as bordas da tampa de vidro pequeno. - Selar a montagem com vaselina liquefeito. Adicionar uma gota de óleo de imersão no lado 24x60 lamínula mm e prossiga para a seção "Lapso de tempo Microscopia '.
2. Preparação de Adulto C. elegans Animais de Lapso de tempo Microscopia usando Nanobeads
NOTA: Em geral, o protocolo para a montagem de animais adultos, é uma adaptação do protocolo de ref. 18.Com este protocolo, é possível a realização de microscopia confocal de lapso de tempo de longa duração de animais adultos.
- Prepara-se uma 1,5% (w / v) de solução de agarose em tampão M9, fervura (1 min, 100 ° C em banho de água ou de microondas). A utilização de maiores concentrações de agarose não é recomendado uma vez que isto pode levar a extrusão do intestino e / ou partes da gónada.
- Atenha-se 2-3 camadas de fita em duas lâminas de microscópio cada. Coloque um slide sem fita entre os dois slides com fita.
- Utilizar uma ponta de pipeta e colocar uma gota da solução de agarose quente no centro da lâmina secundária. Colocar rapidamente uma outra corrediça para a gota de modo que seja suportada pelas camadas de fita de cada lado. Isto irá criar uma almofada redonda e agar apartamento de cerca de 10 mm de diâmetro.
- Colocar uma gota de solução de esferas 100 nm (não diluído, o qual é de 2,6% (w / v)) para a almofada. Transferir 1-10 vermes adultos limpas na gota com uma picareta worm. Selo com 18x18 mm e tampa de vidro de vaselina como explicado no ProtOCOL 1.
Microscopia 3. Time-lapse
- Coloque uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina de microscópio ou o sanduíche tampa de vidro. Use campo claro a baixa ampliação (5x ou 10x lentes) para localizar a amostra.
NOTA: Limite a exposição à luz azul, tanto quanto possível (em especial para C. elegans embriões), por exemplo, não use microscopia de epi-fluorescência para encontrar / concentrar a amostra, mas usar brightfield vez. - Mude a maior ampliação (40x ou 60x objetivos), levar a amostra em foco (ou plano central ou planos superiores / inferiores da amostra, dependendo do software de aquisição).
- Defina os intervalos de amostragem para 30 aviões no 1 um espaçamento registrados a cada 1min. No caso de um palco xyz XY ou automatizada está disponível, vários pontos podem ser gravados em uma única sessão. Mudar para imagens de fluorescência e verifique o foco novamente.
NOTA: Tente evitar o uso poderes alta de laser, em vez usar um pouco mais longos tempos de exposiçãoa muito baixas intensidades. Medida imagens adquiridas de imediato, quer no programa de aquisição de imagem ou em ImageJ para evitar a saturação, que corta a dinâmica variam e também significa a exposição à radiação excessiva. - Comece a gravar a série de lapso de tempo.
NOTA: Para excluir análise de artefatos, comece com intervalos longos (3-10 min) Tempo entre a digitalização de amostra e aumentar gradualmente a amostragem temporal para os intervalos adequados. Tempo de desenvolvimento, bem como os pontos finais em ambos os casos deve ser semelhante ao realizar uma análise estatística. Além disso, é muitas vezes necessário para avaliar as taxas de sobrevivência e fototoxicidade. Portanto, recuperar espécime da montada após a microscopia de lapso de tempo a longo prazo e verificar se eles continuam a desenvolver / live.
4. Reconstruir um modelo celular Forma 3D com IMOD
NOTA: O software IMOD está disponível a partir da página web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. A instalação do software é descreverd lá. Quando utilizar o Windows OS, um conjunto de ferramentas Unix tem de ser instalado, que também pode ser encontrado como um pacote na página IMOD. Além disso, há uma introdução 3dmod excelentemente compilado disponível na página IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).
- Abra o shell do Unix e digite "imod". A janela IMOD será aberta. Selecione o arquivo com os dados brutos (idealmente um tif empilhados ou semelhantes), de que para gerar um modelo 3D.
- Localize a parte inferior e superior dos objetos na janela de Zap usando a janela de informações (up & down ferramenta de rolagem).
- Comece traçando os contornos celulares. Importante, garantir que cada célula é um objeto. Comece com o plano superior de cada célula e criar o primeiro contorno lá usando a janela de informações. Role para baixo na z e criar um novo contorno para cada plano z.
- Faça o mesmo para o maior número de células conforme necessário para modelar em 3D. Não se esqueça de criar um novo objeto ao iniciar com uma nova célula.
NOTA: Há muitas maneiras diferentes para o rastreamento de contorno e vários plugins votos. Por favor, visite o site IMOD e tutoriais on-line para obter detalhes. No caso mostrado, a configuração padrão foi usado. - Abra o "Model View" janela para inspecionar os objetos e seus contornos.
- No "Model View" da barra de ferramentas escolher "Editar" - "Objetos". A janela de edição respectivo será aberta.
- Para modelar células como objectos cheios e fechados, escolha "malha" como "Desenhar tipo de dados" e "Fill" como "estilo do desenho". Clique em "engrenagens" na seleção de rolagem no canto inferior esquerdo da janela. Marque a opção "Cap" na seleção no canto inferior direito. Confira como muitos objetos, conforme necessário e clique em "Malha All". O programa irá gerar objetos sólidos das pilhas de contornos. O factor z-amostragem pode ser ajustado mudando "Z-escala" na janela "Ver".
- Move / girar o objec 3Dt ("Edit" - "Ver") e salvar instantâneos ou filmes ("File" - "Pressão Tiff como ..." ou "Movie / Montagem").
5. Rastreamento fluorescente Estruturas rotuladas com Endrov
NOTA: De modo a rastrear restos de divisão celular, utilizar uma estirpe com um marcador de membrana nuclear ou plasma para a identificação de células (por exemplo, H2B, Ph-PLC-d1) e um marcador remanescente divisão celular (por exemplo, NMy-2, ZEN-4 ). O marcador nuclear ou de membrana de plasma é importante para determinar qual célula herda o remanescente a divisão celular.
- Para o carregamento rápido e facilidade de utilização, os dados em bruto tem que ser convertido para um ficheiro TIFF (por exemplo, em ImageJ). Em seguida, abra Endrov e carregar o arquivo a ser analisado, escolhendo a opção "Carregar arquivo" no menu arquivo. Clique no ícone "visualizador 2D" na barra de ferramentas.
- Ajuste do histograma, clicando no ícone "gama Fit" (o ícone azul no canto inferior direitoda tela Endrov). Defina a resolução XYZ, indo para "Data" - "filename" - "ImageSet" - "Channel" - "Definir XYZ-resolução". Tipo de valores para X, Y, e Z, por exemplo, 5, 5, 1 se resolução X e Y é de 0,2 uM e 1 uM cada amostra em Z.
- Para anotar os núcleos, passar para o plano de interesse e clique em "Visualizador 2D". Selecione "Lineage" no menu suspenso e escolha "New linhagem".
- Clicando e arrastando no núcleo, que pode ser marcado. Para nomear o núcleo, clique com botão direito e escolha "Renomear partícula" no menu suspenso. Para aumentar ou diminuir o diâmetro do círculo, arraste o ícone de seta que aparece no lado esquerdo do círculo marcado. Para marcar o plano central do núcleo, clique no ícone à direita. Quando se utiliza um marcador de membrana plasmática, uma grande esfera pode ser desenhada que vai cobrir a maior parte da célula.
- Para continuar no tempo e no avião, escolher o "Frame" e "Z"opções na barra de ferramentas inferior. Depois de passar para o próximo ponto de tempo, ajustar a posição ou o tamanho do círculo que marca o núcleo em conformidade. Repita este procedimento até a célula se divide rastreados.
- Quando há uma divisão celular, marque os núcleos filhos e mudar para "viewer Lineage". Isso pode ser selecionado clicando no ícone "Windows" na barra de ferramentas superior. Marcar todos os três núcleos simultaneamente, ir até a opção "Lineage" na barra de ferramentas superior e selecione "pai Associado".
- Quando o rastreamento de pilha for concluído, mude para a marcação do remanescente divisão celular para rastreamento de canal. Para mudar de canal, clique no nome do arquivo no canto inferior esquerdo da barra de ferramentas. O remanescente da divisão celular (ou qualquer outra estrutura) pode ser controlada como acima descrito para o núcleo.
- Ao retornar para o software depois de fechar, é necessário ir a "2D Viewer" - "Lineage" - "Editar" e clique sobre o número linhagem que será editada.
6. Analisando Cortical actomiosina fluxo com PIVlab
NOTA: PIVlab é um software disponível gratuitamente a partir de: http://pivlab.blogspot.de/; ele pode ser chamado de dentro do ambiente de linha de comando Matlab digitando PIVlab_GUI. Ao trabalhar com PIVlab, recomenda-se para salvar a série de imagens em uma pasta separada.
- Inicie uma nova sessão do menu "Arquivo". Coloque os arquivos de imagem clicando no botão "Carregar imagens".
- Selecione o estilo de seqüenciamento 1-2, 2-3, ... e navegue até o diretório que contém a sequência de imagens desejadas. Selecione as imagens e clique no botão "Adicionar" e importação.
- Vá em "configurações de Análises" e selecione "Exclusões (ROI), Máscara". Como alternativa, pressione "Ctrl + E". Use o botão "Empate máscara (s) para o quadro atual" para inativar a parte indesejada da imagem / s (ou seja, fora da área do embrião).
- Selecione "Configurações PIV" from o menu "configurações Análises". Como alternativa, pressione "Ctrl + S". Escolha "FFT janela deformação", como o algoritmo PIV desejado.
NOTA: transformação de Fourier rápida (FFT) reduz o custo computacional, mas é recomendado apenas o sinal é bem acima do ruído e se o deslocamento das partículas estudadas não excede metade da área de passagem analisado (ver 6.5). - Entre os seguintes valores para as três passagens, que são a área de interrogação para a correlação cruzada entre a intensidade de imagens subsequentes: Passe 1: Interrogação área de 64 pixels, com uma fase de passagem 32. 2: Interrogação área de 32 elementos de imagem com um passo de 16 . Selecione "linear" da deformação Janela menu suspenso. Escolha forma de 2 * 3 pontos Gaussian para sub-pixel estimativa deslocamento.
- Selecione "Analisar!" a partir do menu Análise e use o botão "Analisar todos os quadros" para começar uma análise.
- Para o processamento pós selecione "Vector validação" de "; Menu de Pós-processamento "e definir o limite de filtro de desvio padrão (Stdev) a 7 e se aplicam a todos os quadros.
- Escolha "derive parâmetros / modificar dados" do menu "Plot". Selecione "Vectors [px / frame]" do menu suspenso. Ajuste a suavidade de vetores e filtro passa alta e se aplicam a todos os quadros.
- Para calcular vetores médios de todos os quadros, definir os quadros "usado" para 1: final e clique no botão "Calcular vetores médios".
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Representative Results
Usando protocolos 2, 3, e 4, com intervalo de tempo de imagem das gônadas em selvagem tipo C. elegans adultos é realizada (OD58 estirpe (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [PAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), expressando um marcador de membrana a partir de um promotor da linha germinal ). Centrando-se no turno da gônada, um modelo 3D das células germinativas é gerada a partir dos dados de microscopia (Figura 2). Este modelo permite analisar alterações no tamanho da célula, enquanto o trânsito células formam o distal ao braço proximal, revela a organização da ráquis e o tamanho dos contactos de células individuais para a coluna vertebral (ver também http: //www.wormatlas. org / hermafrodita / germe% 20line / Germframeset.html).
Próxima, protocolos 1, 3 e 5 são usados para executar microscopia de lapso de tempo a longo prazo de C. elegans embriões (CHP52 estirpe que é um cruzamento de RW10226 estirpe (UNC-119 (ED3) III; itIs37 [pie-1p :: :: mCherry H2B :: pie-1 + 3 'UTR de UNC-119 (+)]; stIs10226 [a-72 promotorHIS-24 :: mCherry fusão de tradução com deixá-858 UTR 3 '+ (+)]) e LP162 estirpe-119 UNC (nmy-2 (CP13 [nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). Nesta estirpe, é possível acompanhar os dois núcleos (através das proteínas de fusão mCherry-histona) e restos de divisão celular (por meio da não-muscular miosina II lócus genomicamente modificada, onde uma GFP foi integrado na estrutura através da CRISPR / tecnologia Cas9 19 ) painéis simultaneamente ao usar microscopia de lapso de tempo de duas cores (Figura 3, esquerda). Os modelos obtidos por lineaging de ambas as estruturas em Endrov mostrar o padrão estereotipado anteriormente descrito de divisão celular herança remanescente 13,14. Além disso, a partir dos dados lineaging, as faixas para cada célula e divisão celular remanescente (Figura 3, painéis da direita) e o tempo de divisão celular persistência remanescente (com base no NMy-GFP -signal 2), bem como a correlação com a célula divisão de temporização pode ser obtida (<strong> Figura 4, mostrado apenas a linhagem ABA). Quando se utiliza um marcador de membrana plasmática para além disso, também é possível observar o ponto de tempo da divisão celular internalização remanescente.
Finalmente, usando protocolos de 1, 3, 6, e microscopia de lapso de tempo de curto prazo com alta resolução temporal (intervalos de 5s entre a gravação de um z-stack) de miosina não-muscular cortical II (NMy-2 GFP) é executada. O foco aqui recai sobre as diferenças na dinâmica do fluxo de polarização cortical, comparando esse fluxo entre o tipo e embriões RNAi-empobrecido para a proteína de activação de Rho GTPase RGA-3 20,21 selvagem. Similar às observações recentes 22, fluem em embriões de tipo selvagem é predominantemente ao longo do eixo do embrião (figura 5, painéis esquerdos), enquanto que o fluxo na RGA-3 RNAi embrião é ortogonal a este eixo. Isto é prontamente aparente a partir da sobreposição pontos de tempo consecutivos ou a partir dos analys PIVé (Figura 5, painéis inferiores).
Para observar estas diferenças, é importante escolher um intervalo de amostragem de modo a que as partículas de fluxo corticais pode ser resolvido de forma inequívoca para a interpretação precisa das informações. Intervalos de tempo menores (≤5 seg) são recomendadas para evitar grandes deslocamentos e vetores desaparecidas. A janela de interrogação deve ser suficientemente grande para acomodar o tamanho das partículas a serem analisados (grânulos corticais). A sobreposição entre as janelas de interrogação vizinhos permite reduzir o espaçamento vector e, portanto, aumenta o número de vectores na grade.
Figura 1. Montagem de uma pipeta de boca esquerda:. Peças necessárias para montar uma pipeta de boca com filtro. À direita:. A pipeta montada Por favor,clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Um modelo 3D da região da gônada por sua vez, Top left:. Projeção em 3D de um único ponto no tempo a partir de dados de microscopia de lapso de tempo. Top meio e direito: modelos 3D dos dados de microscopia. Inferior:. Detalhes de contatos célula-ráquis Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Rastreamento de núcleos e restos de divisão celular esquerda:. Projeções em 3D a partir de dados de microscopia de lapso de tempo. Médio: Instantâneos do modelo obtido a partir de rastreamento de ambos os núcleos (esferas coloridas) e restos de divisão celular (esferas cinza). Direita: Snapshotsde divisão celular de rastreamento remanescente. Os caminhos para os remanescentes também são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Celulares e divisão celular linhagens remanescentes para o sublineage ABA. Linhagens de um embrião representante são mostrados. Divisões celulares são marcadas por quadrados. Cada marca de escala corresponde a 1 min. Os restos de divisão celular foram nomeados após as filhas que surgem a partir da divisão durante o qual o resto é gerado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Análise do fluxo contrátil cortical com PIV Top:. Stills de projeção 3D a partir de microscopia de lapso de tempo que retratam o início (primeira linha) e final (segunda linha) da janela de tempo usado para calcular o campo vetorial com PIVlab. A terceira fila de painéis mostra a sobreposição de todos os pontos de tempo de janela de tempo. Inferior:. Campos de vetores obtidos por PIVlab Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1 -. Relacionados com a Figura 2. Um modelo 3D do turno região da gônada O vídeo começa com percorrer toda a pilha de aviões usados para o segmento das células. Depois uma projecção máxima 3D da pilha é mostrado, seguido pelo modelo 3D segementation rotativa em torno do eixos x e y (com e sem raque da gónada segmentada).
Video 2 - relacionadas à Figura 3. Rastreamento de núcleos e restos de divisão celular Esquerda: projeções em 3D a partir de dados de microscopia de lapso de tempo.. Médio: O modelo obtido a partir de rastreamento de ambos os núcleos (esferas coloridas) e restos de divisão celular (esferas cinza). Direita: restos a divisão celular e suas trajetórias. Escala da barra = 10 m.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Vídeo 3 - relacionados com a Figura 5. Análise do fluxo contrátil cortical com PIV projeção 3D máximo gravações time-lapse de um tipo selvagem representante e RGA-3 RNAi embrião usado para calcular o campo vetorial com PIVlab Barra de escala.. = 10 um.
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Discussion
Através de rastreamento em desenvolvimento objecto, em particular de seguimento nuclear, tem sido possível para elucidar os mecanismos centrais de padronização de C. elegans embriogênese 1,23,24. Expandindo essa estratégia para um maior rendimento, tem sido recentemente possível descobrir regras de padronização adicionais e propor um método para deduzir como padronização regras de novo 10. Para muitos mutantes, no entanto, os defeitos de padrões precisos ainda são desconhecidos. Os métodos descritos aqui são ferramentas que podem ser instrumental na sua elucidação. Importante, tornou-se claro nos últimos anos que, embora muitos outros sistemas modelo não seguem um desenvolvimento invariante como C. elegans, objeto de acompanhamento e análise dos dados de monitoramento quantitativo é uma ferramenta fundamental para identificar os mecanismos e os mecanismos da doença de desenvolvimento.
Os métodos aqui apresentados são especialmente bem adequado, na situação em que ou seria demasiadoum desafio para implementar soluções de software mais complexos e / ou auto-gerado, ou simplesmente demasiado caro para implementar ferramentas de software comerciais, respectivamente. É importante ressaltar que as ferramentas discutidas aqui habilitar o pesquisador para carregar e analisar todos os dados de forma independente no qual o instrumento que eles foram registrados. Além disso, se o software de aquisição de imagem proprietário é usado, ImageJ fornece o plugin Bio-formatos que podem carregar dados em formatos proprietários e salvá-los em formatos padrão (JPEG, TIFF).
Uma etapa fundamental em todos os protocolos que se baseiam em microscopia lapso de tempo é para a direita escolher as condições para se obter um contraste suficiente em imagens de microscopia, e, ao mesmo tempo, para reduzir a exposição a radiação para o espécime. Isso depende muito do tipo de microscópio utilizado e é geralmente recomendado o uso de técnicas de digitalização rápidas, como disco giratório ou microscopia de iluminação plano único. Especificamente, para PIV da dinâmica corticais, versões mais antigas do ponto-de digitalizaçãomicroscópios pode ser demasiado lenta para permitir a captura de sinais corticais com uma resolução e velocidade para realizar análises válidos suficientes. Por conseguinte, é sempre crucial para avaliar cuidadosamente a exposição à radiação e testar a viabilidade do espécime. Além disso, embora os protocolos discutidos aqui micobeads usar para montar embriões, também é possível usar as almofadas de agarose, que só leva um pouco mais de tempo para se preparar, mas é menos caro e com alguma experiência igualmente reprodutível. No entanto, deve salientar-se que a combinação da almofada de agarose e nanobeads é o método superior para a imobilização de longo prazo de vermes adultos, uma vez que evita a utilização de qualquer agente paralisante, por exemplo, levamisole.
Deve-se salientar que as ferramentas discutidas aqui têm as suas limitações, uma vez que não executam análise de dados totalmente automatizado. No entanto, para as estruturas, como restos de divisão celular, é muitas vezes difícil identificar um marcador molecular que apenas sassombra esta estrutura, que é crucial para o rastreamento confiável. Por conseguinte, um grande desafio futuro reside na inclusão características como aprendizado de máquina e adaptáveis algoritmos de detecção / segmentação do software de acesso fácil de usar e aberto que discutimos aqui. Alguns desses recursos podem ser encontrados em outros módulos de software, nomeadamente software que pode lidar com acompanhamento repetido em intervalos de tempo mais longos, ou que se possa comparar grandes conjuntos de dados de controle (por exemplo, StarryNite / AceTree 25 ou Nucleitracker4D 26, que são projetados para núcleos de trilha utilizando proteínas histona-fusão ou fusos 27, ou Simi BioCell 28). Estas ferramentas podem ser mais complexo de implementar, visando apenas o rastreamento de outros núcleos de estruturas. Não obstante a estrutura particular que deve ser monitorado, esses programas são geralmente muito útil quando serão analisados grandes quantidades de dados de imagem. É importante ressaltar que existe compatibilidade entre o modul software mencionado acimaes.
Ao trabalhar com outros sistemas modelo (por exemplo, mosca embriões, células de mamíferos cultivadas, etc), os métodos aqui apresentados também são adequadas para controlar as estruturas ortólogos como descrito acima. Mais importante, independentemente do sistema de modelo em investigação, diferentes estruturas subcelulares, por exemplo, centrossomas, nucléolos, micropartículas, vesículas, etc, podem ser facilmente rastreados, apenas os parâmetros de aquisição tem que ser ajustada para assegurar a captura total de faixas de objectos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
