Abstract
Kantitatif gelişimsel süreçleri yakalayan mutant fenotipleri belirlemek ve tanımlamak için mekanik modelleri ve anahtarı türetmek için çok önemlidir. İşte protokoller embriyo ve yetişkin C hazırlamak için sunulmuştur elegans kısa ve uzun vadeli time-lapse mikroskopi için hayvanlar ve gelişim süreçlerinin takibi ve ölçümü için yöntemler. Sunulan yöntemlerin hepsi C dayanmaktadır kolay kullanılan mikroskop sistemi bağımsız herhangi laboratuvarda uygulanabilir Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden edinilebilir ve açık kaynak yazılımına elegans suşları. Modelleme yazılımı iMod kullanarak 3D hücre şekli modeli bir imar,-floresan etiketli hücre içi yapılar çok amaçlı görüntü analiz programı Endrov ve PIVlab kullanarak kortikal kasılma akışının analizi kullanılarak manuel izleme (Time-Çözülmüş Dijital görüntüleme ölçümleri MATLAB Aracı) gösterilmektedir. Bu t bu yöntemler de dağıtılabilir nasıl tartışıldıo kantitatif vezikül akışının izleme izleme farklı modelleri, örneğin, hücre izleme ve soy diğer gelişimsel süreçleri yakalamak.
Introduction
Floresan proteinleri, genom mühendisliği, ışık mikroskobu ve bilgisayar yumuşak ve donanım sürekli iyileştirmeler ile, benzeri görülmemiş uzay-zamansal çözünürlükte birçok model organizmaların gelişimini kaydetmek artık mümkün. Bu araştırmacılar, daha önce ele olamazdı soru sormak ya da gözden kaçan yönlerini aramak amacıyla bilinen gelişimsel süreçlerini tekrar verir. Bu ilerleme kapsamlı ölçümler ve istatistiksel analizlerle nicel modellere nitel, gayri modelleri dönüştürmeyi amaçlayan niceliksel gelişimsel biyoloji, alanını yol açtı.
Takip hücreleri ve hücre içi yapıların embriyonik gelişim, sinir sistemi aktivitesi ya da hücre bölünmesi 1-12 sayısal modeller elde etmek mümkün kıldı. C. erken gelişimi sırasında hücre bölünmesi kalıntılarını takip ederek elegans embriyo, biz onlar stereo takip ettiklerini ortaya geçenlerde olabiliryolunu yazdığınız ve oluşturan önemli polarize 13,14 faktörleri.
Burada protokoller nicel gelişim biyolojisi olmayan uzmanlar için erişilebilir yaklaşımlar yapmak sunulmuştur. Odak standart konfokal mikroskopi ve bilgisayarlara erişimi olan herhangi bir laboratuvarda uygulanabilir üç düz ileri, serbestçe kullanılabilir araçlar üzerinde yatıyor. Bunlar 3D cep şekiller oluşturmak için bir protokol, hücre bölünmesi kalıntıları izlemek için bir protokol ve kantitatif kortikal actomyosin dinamiklerini açıklamak için bir protokol bulunmaktadır. Nematod C. elegans örnek teşkil eden bir durum olarak kullanılır, bununla birlikte, burada tartışılan yöntem ve araçlar gibi diğer biyolojik örneğin bir model, kültürlenmiş hücreler, doku eksplantlarında, organoids ya da küresel cisimler, için diğer embriyolar, soru çeşitli uygundur
Genel olarak, burada gösterilen analizler bazıları da (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index popüler açık kaynak aracı ImageJ ile gerçekleştirilebilir.html; veya FIJI, farklı kantitatif analizler için birçok eklentileri mevcut olduğu ImageJ sürümünü, http://fiji.sc/Fiji) 'piller dahil'. Ancak, programları burada tartışılan belirli sorunları çözmek için tasarlanmıştır.
İlk olarak, iMod, bir görüntü işleme, modelleme ve görüntü paketi elektron ve ışık mikroskopisi 15 seri bölümlerinin 3 boyutlu rekonstrüksiyon için kullanılabilir. IMod ayrıca herhangi bir yönlendirme 3D veri görüntüleme için araçlar içerir. İkincisi, Endrov, ImageJ eklenti uyumluluğu 16, ağlar ya da uzun bir eklenti mimarisi temelinde (diğerleri) parça görüntü analizi, veri işleme ve açıklama yapmak için tasarlanmış bir Java programı. 140 üzerinde görüntü işleme operasyonları ve model ve ham veriler ayrı ayrı sergilendiği bir uzayabilir kullanıcı arayüzü içerir. Onun kaynak kodu https://github.com/mahogny/Endrov bulunabilir. Üçüncü olarak, PIVlab bir MNitelik ve nicelik parçacık akış alanları 17 analiz için izin verir dijital parçacık görüntü velosimetri için ATLAB aracı. Bu programların kullanımı İşleme Toolbox (http://mathworks.com) Resmi içeren bir MATLAB lisansı gerektirir. PIVlab kantitatif akışını tanımlamak için tasarlanmış bir programdır. Bu görüntü çift veya seri içindeki hız dağılımı, büyüklüğü, girdap, sapma veya kesme hesaplar. Bunun için, en olası partikül deplasman elde etmek için bir görüntü çiftinin (protokol bölümü olarak adlandırılır 'geçer') görüntülerin küçük alanları çapraz korelasyon göstermektedir. Bu çapraz-korelasyon doğrudan çapraz korelasyon sırasında veya bir hızlı Fourier transformasyonunu (FFT), kullanılarak boşluk veya frekans alanında analiz edilebilir bir ilişkiyi gösteren bir tablo ortaya çıkarır.
Burada kullanılan ekipman Nipkow ('iplik') diske, bir EMCCD, 488 ve 561 nm standart katı-donatılmış bir ters mikroskophal lazerleri ve yağ veya su daldırma hedefleri apochromat 20x hava veya 40x veya 60x planı /. Ancak, diğer görüntüleme yöntemleri ile time-lapse görüntüleme gerçekleştirmek mümkündür, örneğin, nokta-, içini kaplamak veya deconvolution veya yapılandırılmış kombine sac tarama lazer tabanlı mikroskopisi, çoklu foton mikroskopi yanı sıra epi-floresan mikroskopi aydınlatma. Bir Nipkow disk sistemin kullanılmasının avantajı bir akış modu (sürekli hareket ve z boyutunda nesnenin tarama) mevcuttur, özellikle son derece hızlı görüntü elde etme olduğunu. Buna ek olarak, çözünürlüğünü artırmak için, EMCCD önünde bir 1.5 kat büyütme genişletici kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C hazırlanması 1. elegans Embriyolar Zaman atlamalı Mikroskopi mikroboncukları kullanılarak
- M9 tampon bir damla içine bir solucan seçim (platin tel) kullanılarak gebe erişkin solucanlar aktarın ve şiddetle ajitasyon ve daha sonra bir diş çekme / pipet üzerine monte edilmiş bir göz boşluğunu kullanarak M9 bitişik düşüş her solucan aktararak, ilk tarafından bakterileri temizlemek ya da sivri uçlu bir cam kılcal kullanın.
- , HPO 4, 5 g NaCl M9 tamponu (1 L M9 tamponu 3 g KH 2 içeren PO 4, 6 g 2 Na 20 mikron çapında polistiren tanecikler 10 kat ihtiva eden bir dispersiyon ile seyreltilir ve otoklavlama (20 dakika, 120 ° sonra, C)), 1 M MgSO 4 çözeltisi ilave 1 ml.
- İnce cam kapiller her türünden ağız pipet olun (örneğin, nokta kılcal veya kılcal enjeksiyon iğneleri çekmek için kullanılan eritme), kauçuk, silikon veya benzeri malzeme boru (ideal transparan) bir kabaca 0.5 m uzunluğunda bir parça, 200 ulPipet, 200 ul PCR tüp kapağı küçük enjektörler için bir hidrofobik filtre (örn., bir 0,2-0,45 mikron gözenek büyüklüğü ve 15-50 mm çapında bir Naylon, PTFE ya da benzer malzeme filtre) ve 1000 ul pipet . Ağız pipet Bu tür hiçbir biyolojik materyal deneyci ile temasa olanak sağlıyor.
- Tüp içine ilk ucu ile 200 ul pipet takarak pipet birleştirin ve kullanılan kılcal çapı eşleşen bir merkezi perforasyonu olan PCR tüp kapağı takın. Bir çok işaret tığ veya preparat, iğne delikleri oluşturmak için de kullanılabilir.
- Ince kılcal çizin ve perforasyon takın. Hortumun diğer ucunu filtreyi takın ve (Şekil 1) ağız parçası olarak 1000 ul pipet yerleştirin.
- Temiz bir jilet veya neşter ile vulva enine solucanlar keserek gravid yetişkin parçalara ayır.
NOT: Genellikle, birçok embriyolar, e olacakkesim sonrası xpulsed. Erken embriyolar gerekli Ancak, bazen bir göz boşluğunu veya sivri iğne kullanılarak karkas serbest gerekir. - Ağız pipet kullanarak bu damla içine 24x60 mm kapak cam ve transfer embriyolar üzerine seyreltilmiş polistiren boncuk dağılım (~ 4 ul) Pipet bir damla.
- Dikkatle küçük (örneğin, 18x18 veya 20x20 mm) yerleştirmek damla üstündeki cam kapak ve damla tamamen yayılmış olduğundan emin olun.
NOT: damla aynı zamanda küçük cam kapak kenarlarına dokunmak yeterli değil küçük olmalıdır. - Sıvılaştırılmış vazelin ile montaj Seal. 24x60 mm kapak kayma tarafındaki daldırma petrol bir damla ekleyin ve 'Time-lapse mikroskopi' bölümüne geçin.
Yetişkin C'lik 2. Hazırlık elegans Hayvanlar Time-lapse Mikroskopi Nanobeads kullanarak
NOT: Genel olarak, yetişkin hayvanların montaj için protokol ref gelen protokol bir uyarlamasıdır. 18.Bu protokol ile, yetişkin hayvanların uzun vadeli time-lapse konfokal mikroskopi gerçekleştirmek mümkündür.
- Bir% 1.5 hazırlama M9 tampon agaroz çözeltisi (ağ / hac), kaynatma (1 dakika, su banyosu ya da mikrodalgada 100 ° C). Bu bağırsak ve / veya gonad parçalarının ekstrüzyon yol açabileceği için agaroz yüksek konsantrasyonlarının kullanılması tavsiye edilmez.
- İki mikroskop lamı her üzerine bant 2-3 katmanları aşağı sopa. Bant ile iki slaytlar arasındaki bant olmadan bir slayt yerleştirin.
- Bir pipet kullanın ve orta slayt merkezinde sıcak agaroz çözüm bir damla yerleştirin. Her tarafta teyp katmanları tarafından desteklenen, böylece hızlı bir şekilde damla üzerine başka bir slayt yerleştirin. Bu yaklaşık 10 mm çapında yuvarlak ve düz ağar pad yaratacaktır.
- Ped üzerine (v) a / a (% 2.6 seyreltilmemiş), 100 nm boncuk çözeltisi bir damla koyun. Bir solucan çekme ile damla içine 1-10 temizlenmiş erişkin solucanlar aktarın. Prot açıklandığı gibi 18x18 mm kapak cam ve vazelin ile Sealocol 1.
3. Time-lapse mikroskopi
- Mikroskop lamı veya kapak cam sandviç üzerine daldırma petrol bir damla koyun. Numuneyi bulmak için düşük büyütme (5x veya 10x lensler) de aydınlık kullanın.
NOT: (örn C. elegans embriyolar için özellikle) mümkün olduğunca mavi ışık, maruz kalma sınırlandırın / bulmak numune odak yerine aydınlık kullanmak için epi-floresan mikroskobu kullanmayın. - Yüksek büyütme (40x veya 60x hedefler) olarak değiştirin, (merkezi düzlemi veya satın alma yazılımına bağlı olarak numunenin üst / alt uçakları ya) odak noktası haline getirmek numune.
- 1 mikron aralıklarla 30 uçakları örnekleme aralıklarını ayarlama her 1dk kaydedildi. Otomatik karboksi- veya xyz aşamalı mevcut durumda, birden fazla noktalar tek oturumda kaydedilebilir. Floresan görüntüleme geçin ve tekrar odağı kontrol ediniz.
NOT: biraz daha uzun pozlama süreleri kullanmak yerine, yüksek lazer yetkilerini kullanarak kaçınınÇok düşük yoğunluklarda. Tedbir dinamikleri aralığı bitkiler doygunluk önlemek için görüntü elde etme programında veya ImageJ ya hemen görüntüleri elde ve aynı zamanda aşırı radyasyona maruz demektir. - Time-lapse serisi kaydetmeye başlayın.
NOT: eserler analiz dışlamak örnek taraması arasındaki uzun (3-10 dk) zaman aralıklarında ile başlar ve yavaş yavaş istenilen aralıklarda temporal örnekleme arttırmak. Istatistiksel bir analiz gerçekleştirirken her iki durumda da gelişimsel zamanlaması olarak bitiş noktaları benzer olmalıdır. Ayrıca, fototoksisite ve hayatta kalma oranlarını değerlendirmek genellikle gereklidir. Bu nedenle, uzun vadeli time-lapse mikroskobu sonra montaj gelen numune kurtarmak ve canlı / geliştirmeye devam olmadığını kontrol edin.
4. iMod sahip bir 3D Hücre Şekli modeli Yeniden
NOT: http://bio3d.colorado.edu/imod/: iMod yazılım iMod web sayfasından edinilebilir. Yazılımın kurulumu tarif olduğunuOrada d. Windows işletim sistemi kullanırken, bir Unix araç da iMod web sayfasında bir paket olarak bulunabilir, hangi yüklü olması gerekmektedir. Ayrıca, iMod web sayfasında (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html) kullanılabilir bir mükemmel derlenmiş 3dmod giriş var.
- Unix kabuk açın ve "iMod" yazın. IMod penceresi açılacaktır. 3D modelini oluşturmak için hangi ham veri (ideal bir yığılmış tif veya benzeri) ile dosyayı seçin.
- Bilgi penceresini (yukarı ve kaydırma aracı aşağı) kullanarak Zap penceresindeki nesnelerin alt ve üst bulun.
- Hücre özetliyor izleme başlayın. Önemli olarak, her bir hücre, bir amacı olduğundan emin olun. Her hücrenin üst düzlemi ile başlayın ve bilgi penceresini kullanarak ilk orada kontur oluşturmak. Z aşağı kaydırın ve her z-düzlemi için yeni bir kontur oluşturmak.
- 3D modellemek için gerektiği kadar hücreler için de aynı işlemi yapın. Yeni hücre ile başlarken yeni bir nesne oluşturmak için unutmayın.
NOT: kontur izleme ve birkaç yararlı eklentileri için birçok farklı yolu vardır. Ayrıntılar için iMod web sayfası ve çevrimiçi öğreticiler ziyaret ediniz. Burada gösterilen durumda, varsayılan ayar olarak kullanılmaktadır. - Nesneleri ve konturları incelemek için "Model View" penceresini açın.
- "Nesneler" - "Model View" araç çubuğunda "Edit" seçeneğini seçin. İlgili düzenleme penceresi açılacaktır.
- "Veri türü Beraberlik" ve "Çizim stili" olarak "Fill" olarak "Mesh" i seçin, doldurulmuş ve kapatılmış nesneler olarak hücreleri model. Pencerenin sol alt köşesindeki kaydırılabilir seçiminde "mesh başlıklı yazımıza" butonuna tıklayın. Alt sağdaki seçiminde seçenek "Cap" seçeneğini işaretleyin. Gerekli olduğu kadar çok nesne kontrol ve "All Mesh" i tıklayın. Program konturları yığınları katı nesneler üretecektir. Z-örnekleme faktör "Görünüm" penceresinde "Z-ölçek" değiştirilerek ayarlanabilir.
- Taşı / 3D objec döndürmekt ("Edit" - "Görünüm") ve anlık veya film kaydetmek ("Dosya" - "Yakala Tiff olarak ..." ya da "Film / Montage").
Endrov 5. Takip floresan etiketli Yapılar
NOT: Hücre tanımlama (örn H2B, PH-PLC-d1) ve bir hücre bölünmesi kalıntı işaretleyici (örneğin bir nükleer ya da plazma zarı işaretleyici ile bir gerginlik kullanmak, hücre bölünmesi kalıntılarını izlemek için, nmy-2, In ZEN-4 ). Nükleer ya da plazma membranı markör hücre bölünmesi-yapı artık kısmının devraldığı hücre belirlemek önemlidir.
- Hızlı yükleme ve kullanım kolaylığı için, ham veri (ImageJ, örneğin) bir tiff dosyası dönüştürülecek vardır. Sonra, açık Endrov ve dosyayı yüklemek Dosya menüsünden "Load dosyası" seçeneğini seçerek analiz edilecek. Araç çubuğunda "2B izleyici" ikonuna tıklayın.
- Sağ alt köşede ("Fit aralık" ikonuna mavi simgesine tıklayarak histogram ayarlayınEndrov ekranın). "Filename" - - "ImageSet" - için "Veri" giderek XYZ-çözünürlük ayarlayın "Kanal" - "XYZ-çözünürlüğünü ayarla". X ve Y, çözünürlüğü 0.2 um ise, örneğin X, Y ve Z, 5, 5, 1 değerlerini yazın ve Z her 1 um örnek
- Çekirdekleri eklenmesi için, ilgi düzlemine taşımak ve "2D görüntüleyici" üzerine tıklayın. Açılan menüden "Lineage" seçin ve "Yeni soy" seçeneğini seçin.
- Tıklayıp çekirdeği üzerinde sürükleyerek, bu işaretlenebilir. Çekirdeği adlandırmak için, sağ tıklayın ve açılan menüden "parçacık yeniden adlandırın" seçeneğini seçin. Artırmak veya çemberin çapını azaltmak için, işaretli daire solunda görünen ok simgesine sürükleyin. Çekirdeğin merkez düzlemi işaretlemek için, sağ ikonuna tıklayın. Plazma zarı işaretleyici kullanırken, büyük bir küre hücrelerinin en kapsayacak çizilebilir.
- Zaman ve düzlemde devam etmek için, "Frame" ve "Z" seçimAlt araç çubuğu seçeneklerini. Bir dahaki sefere noktasına gittikten sonra, buna göre çekirdeği işaret dairenin konumunu ve boyutunu ayarlayın. Paletli Hücre bölünürken kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Bir hücre bölünmesi olduğunda, kızı çekirdekleri işaretlemek ve "Lineage izleyicinin" geçin. Bu üst araç çubuğundaki "Windows" ikonuna tıklayarak seçilebilir. Mark aynı anda her üç çekirdek, üst araç çubuğundaki "Lineage" seçeneğine gidin ve "Ortak üst" seçeneğini seçin.
- Hücre izleme bittiğinde, izleme için hücre bölünmesi kalıntısını işaretleme kanala geçin. Kanal değiştirmek için, araç çubuğunun sol alt köşesinde dosya adının üzerine tıklayın. Çekirdek için yukarıda tarif edildiği gibi, hücre bölünmesi, kalan (ya da başka bir yapı) takip edilebilir.
- "Lineage" - - "Düzenle" ve düzenlenebilir olacak soy numarasına tıklayın kapattıktan sonra yazılımı dönen zaman, "2D Viewer" gitmek gerekir.
6. PIVlab ile Kortikal actomyosin Akış Analizi
NOT: PIVlab bir serbestçe kullanılabilir yazılım: http://pivlab.blogspot.de/; o PIVlab_GUI yazarak Matlab komut satırı ortamında çağrılabilir. PIVlab ile çalışırken, bu ayrı bir klasörde görüntü serisini kaydetmek için tavsiye edilir.
- "Dosya menüsünden" yeni bir oturumu başlatın. "Load görüntüleri" düğmesine tıklayarak görüntü dosyaları yükleyin.
- , Sıralama tarzı 1-2, 2-3, seçin ... ve istenen görüntülerin dizisini içeren dizine gidin. Görüntüleri seçin ve "Ekle" butonuna ve ithalat üzerine tıklayın.
- "Analizler ayarları" gidin ve "Dışta (ROI, Maske)" seçeneğini seçin. Alternatif olarak, basın "Ctrl + E". Görüntü / s (embriyo dışında yani alan) istenmeyen kısmını inaktive "mevcut çerçeve için maske (ler) çizin" düğmesini kullanın.
- "PIV ayarları" seçeneğini seçin fr"Analizler ayarları" menüsünü om. Alternatif olarak, basın "Ctrl + S". İstenilen PIV algoritması olarak "FFT penceresi deformasyon" seçiniz.
NOT: Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) hesaplama maliyetini düşürür ama sinyal iyi gürültü üzerinde çalışılan ve parçacıkların deplasman (6.5 bakınız) analiz yarım geçiş alanını aşmadığı takdirde önerilen tek edilir. - Sonraki görüntüler arasında yoğunluk çapraz korelasyon sorgulama alanı üç geçer, aşağıdaki değerleri girin: 1 Pass: Sorgulama 64 piksel alanını 32. Geçidi 2 bir adım: Sorgulama 32 piksel alanı 16 bir adım . açılır menüsünden Pencere deformasyon "doğrusal" i seçin. Sub-pixel deplasman tahmininde Gauss 2 * 3 sayılık yöntemini seçin.
- Seç "Analiz" Analiz menü ve düğmesini kullanın bir analiz başlamak için "tüm çerçeveleri analiz".
- Sonrası işleme için "" Vektör doğrulama "seçin; Post processing "menüsü ve 7 standart sapma (STDEV'leri) filtre eşiğini ayarlamak ve tüm kareleri için geçerlidir.
- "Konu" menüsünden "verileri değiştirmek / parametreleri türevi" seçiniz. Açılan menüden "Vektörler [px / çerçeve]" seçeneğini seçin. Vektörler ve yüksek geçiren filtre düzgünlüğü ayarlayın ve tüm kareleri için geçerlidir.
- Tüm çerçevelerin ortalama vektörleri hesaplamak 1 "Kullanılan kareleri" ayarlamak için: uç ve "ortalama vektörleri Hesapla" butonuna tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolleri 2, 3, ve 4, yabani tip C. gonadlar zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak elegans yetişkin yapılır (soy OD58 (unc-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1, pasta-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), bir tohum çizgisi promotörden bir membran işaretleyici ifade ). Gonad dönüş odaklanarak, germ hücrelerinin bir 3D model mikroskopi verileri (Şekil 2) oluşturulur. Bu model, hücrelerin geçiş proksimal kol distal formu ise hücre boyutu değişiklikleri analiz etmeyi sağlar rachis organizasyonu ve rachis bireysel hücrelerin temas boyutunu ortaya koymaktadır (ayrıca bkz http: //www.wormatlas. org / hermafrodit / germ% 20line / Germframeset.html).
Sonraki protokoller 1, 3 ve 5 ° C uzun dönem zaman atlamalı mikroskopla inceleme yapmak için kullanılan itIs37 [pasta-1p :: mCherry :: H2B :: pasta-1 3'UTR + unc-119 (+)];; stIs10226 (unc-119 (ED3) III zorlanma RW10226 bir çapraz elegans embriyolar (suş CHP52 [onun-72 promotörIle HIS-24 :: MCherry öteleme füzyon let-858 3 'UTR + unc-119 (+)]) ve gerilme LP162 (nmy-2 (CP13 [nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). Bu gerginlik, bu GFP CRISPR aracılığıyla çerçeveye entegre edilmiş genomik modifiye olmayan kas miyozin II lokusu / Cas9 teknolojisi 19 aracılığıyla hem (mCherry histon füzyon proteinleri aracılığıyla) çekirdekleri ve hücre bölünmesi kalıntılarını (takip etmek mümkündür ) iki renkli time-lapse mikroskobu (Şekil 3 kullanırken aynı anda sol paneller). Endrov iki yapıların lineaging elde edilen modeller hücre bölünmesinin kalan miras 13,14 daha önce açıklanan basmakalıp desen gösterir. Ayrıca, lineaging verileri, her hücre ve hücre bölünmesi kalıntısı (Şekil 3, sağ panel) ve hücre bölünmesi kalan kalıcılık kez parça yanı sıra hücre korelasyon (nmy-2 GFP -Sinyal göre) bölünme zamanlama <(elde edilebiliraba soy sadece) için gösterilen strong> Şekil 4. Ek olarak, bir plazma membranı işaretleyici kullanırken, hücre bölünmesi, kalan içselleştirme zaman noktası gözlemlemek mümkündür.
Son olarak, yüksek temporal çözünürlük kortikal olmayan kas miyozin II (nmy-2 GFP) (z-yığını kayıt arasındaki 5s aralıklarla) ile protokol 1, 3 ve 6, kısa vadeli time-lapse mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilir. Odak burada yabani tip ve embriyoların Rho GTPaz aktive protein RGA-3 20,21 için RNAi tükenmiş arasındaki bu akışını karşılaştırarak kortikal polarize akış dinamikleri farklılıklar üzerinde yatıyor. Rga-3 RNAi embriyo akışı bu eksene dik ise son gözlem 22 benzer şekilde, vahşi tipli embriyolar, akış esas olarak embriyonun uzun ekseni (Şekil 5, solda paneller) boyuncadır. Bu ardışık zaman noktaları kaplanacağı veya PIV analizi kullanılmıştır kolayca anlaşılır(Şekil 5, alt paneller) 'dir.
Kortikal akış parçacıkları verilerin doğru yorumlanması için açıkça çözülebilir ve böylece bu farklılıkları gözlemlemek için, bir örnekleme aralığı seçmek önemlidir. Daha küçük zaman aralıkları (≤5 sn) büyük yer değiştirmelerin ve eksik vektörleri önlemek için tavsiye edilir. Sorgulama penceresi parçacıkların boyutu analiz edilecek (kortikal granüller) alacak kadar büyük olmalıdır. Komşu sorgulama pencereler arasındaki örtüşme vektör aralığı azaltmak için izin verir ve böylece kılavuzunda vektörlerin sayısını artırır.
Şekil 1. Bir ağız pipet Montaj Sol:. Filtreli ağız pipet montajı için gerekli parçalar. Sağ:. Monte pipet LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Gonad dönüş bölgenin Şekil 2. A 3D model Sol üst:. Time-lapse mikroskopi verileri tek bir zaman noktasında 3D projeksiyon. Üst orta ve sağ: mikroskopi verileri 3 boyutlu modelleri. Alt:. Hücre rachis temasların Ayrıntılar bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Çekirdekler ve hücre bölünmesi kalıntıları Sol'un Şekil 3. Takip: time-lapse mikroskopi verilerinden 3D projeksiyonlar. Orta: Anlık hem çekirdekleri (renkli küreler) ve hücre bölünmesi kalıntıları (gri küreler) izleme elde edilen modelin. Sağ: AnlıkHücre bölünmesi kalan izlemeden gelen. Kalıntıları için yolları da gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Temsili bir embriyodan aba sublineage. Soy için Şekil 4. Hücre ve hücre bölünmesi kalan soy gösterilir. Hücre bölünmeleri kareler işaretlenmiştir. Her onay işareti 1 dakikaya tekabül eder. Hücre bölünmesi kalıntıları kalıntı oluşturulan sırasında bölünme kaynaklanan kızları isimleri verildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PIV En kortikal kasılma akışının Şekil 5. Analizi: başlangıç (ilk satır) ve PIVlab vektör alanını hesaplamak için kullanılan zaman penceresi sonuna (ikinci sıra) tasvir time-lapse mikroskobu 3D projeksiyon hareketsiz.. Panellerin üçüncü sıra zaman penceresinin her zaman noktalarının kaplamayı göstermektedir. Alt:. PIVlab ile elde edilen vektör alanları, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Video 1 -. Gonad dönüş bölgenin 2. 3D modeli Şekil alakalı video hücreleri segmentine kullanılan uçakların tüm yığını aracılığıyla kaydırma ile başlar. Daha sonra yığının 3B maksimum projeksiyon x ve (ve parçalı gonad en rachis olmadan) y eksenleri etrafında dönen 3D segementation modeli takip gösterilmiştir.
Video 2 - çekirdekleri ve hücre bölünmesi kalıntıları Sol'un 3. İzleme Şekil bağlı. Time-lapse mikroskopi verilerinden 3D projeksiyonlar. Orta: Her iki çekirdek (renkli küreler) ve hücre bölünmesi kalıntıları (gri küreler) izleme elde edilen modeli. Sağ: Hücre bölünmesi kalıntıları ve bunların yörüngeleri. Ölçek çubuğu 10 mikron =.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Video 3 - PIV ile kortikal kasılma akışının 5. Analizi Şekil ilgili PIVlab Ölçek çubuğu ile vektör alanı hesaplamak için kullanılan bir temsilci yabani tip ve rga-3 RNAi embriyo 3D maksimum projeksiyon time-lapse kayıtları.. = 10 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geliştirme izleme nesnesi üzerinden, özellikle de nükleer takibi, bu C merkez desenlendirme mekanizmaları aydınlatmak mümkün olmuştur elegans 1,23,24 Embriyogenez. Yüksek verim için bu stratejiyi genişletilmesi, ek desenlendirme kurallarını ortaya çıkarmak için ve desenlendirme anlamak için nasıl bir yöntem de novo 10 kuralları önermek son zamanlarda mümkün olmuştur. Birçok mutantlar için, ancak, kesin desen kusurları hala bilinmemektedir. Burada açıklanan yöntemler kendi aydınlatılmasına vesile olabilir araçlardır. Önemlisi, diğer birçok model sistemler C gibi bir değişmeyen gelişmeleri takip olmamasına rağmen son yıllarda netleşti elegans, nesne izleme ve nicel izleme verilerinin analizi gelişim mekanizmaları ve hastalık mekanizmaları tanımlamak için çok önemli bir araçtır.
O da çok olacaktır burada burada gösterilen yöntemler durumda, özellikle çok uygundursırasıyla, ticari yazılım araçları uygulamak için daha karmaşık ve / veya kendinden oluşturulan yazılım çözümleri, ya da sadece çok pahalı uygulamak zor. Önemlisi, burada tartışılan araçlar yüklemek ve bağımsız kaydedildikleri edildiği enstrüman üzerinde herhangi bir verilerini analiz etmek için araştırmacı sağlar. Özel görüntü elde etme yazılımı kullanılırsa Ayrıca, eğer ImageJ tescilli biçimlerde veri yüklemek ve standart formatlarda (jpeg, tiff) saklayabilirsiniz Bio-Biçimleri eklentisi sağlar.
Zaman atlamalı mikroskopi güveniyor tüm protokollerde kritik bir adım doğru koşulları seçmek mikroskopi görüntüleri yeterli kontrast elde etmek ve aynı zamanda, numuneye radyasyon maruziyeti azaltmak için. Bu yoğun kullanılan mikroskop tipine bağlıdır ve genellikle bu tür dönen diske veya tek düzlem aydınlatma mikroskopisi hızlı tarama teknikleri kullanmak tavsiye edilir. Özellikle, kortikal dinamikleri PIV, nokta-tarama eski sürümleri içinmikroskoplar yeterli çözünürlük ve geçerli analizleri yapmak için hız kortikal sinyalleri yakalama izin vermek için çok yavaş olabilir. Bu nedenle her zaman dikkatli bir şekilde radyasyona maruz kalma değerlendirmek ve numunenin canlılığını test etmek çok önemlidir. Burada tartışılan protokoller embriyolar monte etmek micobeads kullanılmasına rağmen ek olarak, sadece hazırlamak için biraz daha fazla zaman alır ama daha az pahalı ve eşit tekrarlanabilir biraz tecrübe ile agaroz pedleri kullanmak da mümkündür. Bununla birlikte, herhangi bir felç madde, örneğin, levamisol kullanımını önlediğinden agaroz ped ve nanobeads kombinasyonu solucanların uzun süreli immobilizasyon için üstün bir yöntemdir işaret edilmelidir.
Burada tartışılan araçlar tam otomatik veri analizi gerçekleştirmek yok çünkü onların sınırlamaları olduğuna işaret edilmelidir. Ancak, hücre bölünmesi kalıntıları gibi yapılar için, genellikle sadece s moleküler işaretleyici tanımlamak için zorluGüvenilir izleme için çok önemli olan bu yapıyı, uyup. Büyük bir gelecek meydan nedenle makine öğrenmesi ve biz burada tartışmak için kolay kullanımlı ve açık erişim yazılımı uyarlanabilir algılama / segmentasyon algoritmaları gibi özellikleri de dahil olmak üzere yatıyor. Bu özelliklerin bazıları daha uzun zaman aralıkları boyunca tekrar takip başa belirli bir yazılım, diğer yazılım modülleri bulunabilir ya da bu şekilde tasarlanmıştır izleme büyük veri setleri (ör StarryNite / AceTree 25 veya Nucleitracker4D 26, karşılaştırın histon-füzyon proteinleri ya da iğ 27 kullanarak parça çekirdekleri veya Simi Biocell 28). Bu araçlar çekirdekleri dışındaki yapıların takibi amaçlayan zaman uygulamak daha karmaşık olabilir. Takip edilmelidir, özellikle yapının rağmen, bu programlar genellikle görüntü büyük miktarda veri analiz edilecektir zaman çok faydalıdır. Önemlisi, yukarıda belirtilen yazılım modülüne arasındaki uyumluluk vardıres.
Diğer model sistemleri ile çalışan (örn, embriyolar sinek, memeli kültür hücreleri, vs), burada sunulan metotlar, yukarıda tarif edildiği gibi ortolog yapıları izlemek için çok uygundur. Daha da önemlisi, bağımsız vs. soruşturması kapsamında model sistemi, farklı hücre içi yapılar, örneğin, sentrozomlar, nükleol, mikro parçacıklar, kesecikler, bir kolaylıkla sadece satın alma parametreleri nesne parça tam yakalayan sağlamak üzere ayarlanması gerekir, izlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
