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Biology

में विकास की प्रक्रिया पर नज़र रखने और बढ़ाता Published: December 16, 2015 doi: 10.3791/53469
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, 1
1Buchmann Institute for Molecular Life Sciences and Institute of Biochemistry II, School of Medicine, Goethe University
* These authors contributed equally

Abstract

मात्रात्मक विकास की प्रक्रिया पर कब्जा उत्परिवर्ती phenotypes की पहचान करने और वर्णन करने के लिए यंत्रवत मॉडल और कुंजी को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ प्रोटोकॉल भ्रूण और वयस्क सी तैयारी के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं एलिगेंस छोटी और लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए जानवरों और विकास की प्रक्रिया की ट्रैकिंग और मात्रा का ठहराव के लिए तरीकों। प्रस्तुत तरीकों सभी सी के आधार पर कर रहे हैं आसानी से इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोपी प्रणाली की स्वतंत्र रूप से किसी भी प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है कि Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र से उपलब्ध है और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर पर एलिगेंस उपभेदों। मॉडलिंग सॉफ्टवेयर IMOD का उपयोग कर एक 3 डी सेल आकार मॉडल की एक पुनर्निर्माण,-fluorescently लेबल subcellular संरचनाओं बहुउद्देश्यीय छवि विश्लेषण कार्यक्रम Endrov, और PIVlab का उपयोग cortical सिकुड़ा प्रवाह के एक विश्लेषण का उपयोग करने का मैनुअल ट्रैकिंग (समय हल डिजिटल कण छवि velocimetry MATLAB के लिए उपकरण) दिखाए जाते हैं। यह टी इन तरीकों में भी तैनात किया जा सकता है कि कैसे चर्चा की हैओ मात्रात्मक पुटिका प्रवाह की ट्रैकिंग, ट्रेसिंग अलग अलग मॉडल, जैसे, सेल ट्रैकिंग और वंश में अन्य विकास की प्रक्रिया पर कब्जा।

Introduction

फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जीनोम इंजीनियरिंग, प्रकाश माइक्रोस्कोपी, और कंप्यूटर नरम और हार्डवेयर के स्थिर सुधार के साथ, यह अभूतपूर्व spatio- लौकिक संकल्प पर कई मॉडल जीवों के विकास के रिकॉर्ड करने के लिए अब संभव है। यह शोधकर्ताओं पहले से संबोधित नहीं किया जा सकता है कि सवाल पूछने के लिए या अनदेखी पहलुओं के लिए खोज करने के क्रम में जाना जाता है विकास की प्रक्रिया को फिर से आना अनुमति देता है। इस प्रगति को पूरी तरह से माप और सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा मात्रात्मक मॉडल में गुणात्मक, अनौपचारिक मॉडल बदलने के लिए करना है जो मात्रात्मक विकास जीव विज्ञान के क्षेत्र छिड़ गया है।

ट्रैकिंग कोशिकाओं और subcellular संरचनाओं भ्रूण विकास, तंत्रिका तंत्र गतिविधि, या कोशिका विभाजन 1-12 की मात्रात्मक मॉडल प्राप्त करने के लिए यह संभव बना दिया है। सी के प्रारंभिक विकास के दौरान कोशिकाओं के विभाजन के अवशेष पर नज़र रखने से एलिगेंस भ्रूण, हम वे एक स्टीरियो पालन पता चलता है कि हाल ही में कर सकता हैपथ टाइप और गठन में महत्वपूर्ण ध्रुवीकरण 13,14 कारकों।

इधर, प्रोटोकॉल मात्रात्मक विकास जीव विज्ञान गैर विशेषज्ञों के लिए सुलभ बनाने के दृष्टिकोण है कि प्रस्तुत कर रहे हैं। फोकस मानक confocal माइक्रोस्कोपी और कंप्यूटर के लिए उपयोग किया है कि किसी भी प्रयोगशाला में लागू कर रहे हैं कि तीन सीधे आगे, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध उपकरणों पर स्थित है। ये 3 डी सेल आकार उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल, कोशिका विभाजन के अवशेष को ट्रैक करने के लिए एक प्रोटोकॉल, और मात्रात्मक cortical actomyosin गतिशीलता का वर्णन करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल हैं। निमेटोड सी एलिगेंस एक अनुकरणीय मामले के रूप में प्रयोग किया जाता है, हालांकि, यहाँ पर चर्चा के तरीकों और उपकरणों आदि अन्य जैविक जैसे मॉडल, संवर्धित कोशिकाओं, ऊतक explants, organoids या spheroids, दूसरे भ्रूण में सवालों की एक किस्म के लिए अनुकूल हैं

आम तौर पर, यहाँ दिखाया विश्लेषण के कुछ भी (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index लोकप्रिय खुला स्रोत उपकरण ImageJ के साथ किया जा सकता है।एचटीएमएल; या फिजी, अलग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कई plugins उपलब्ध हैं, जिसके लिए ImageJ के संस्करण, http://fiji.sc/Fiji) 'बैटरी शामिल'। हालांकि, कार्यक्रमों यहाँ पर चर्चा की विशिष्ट समस्याओं से निपटने के लिए तैयार कर रहे हैं।

सबसे पहले, IMOD, एक छवि प्रसंस्करण, मॉडलिंग और प्रदर्शन सूट इलेक्ट्रॉन या प्रकाश माइक्रोस्कोपी 15 से धारावाहिक वर्गों के 3D पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। IMOD भी किसी भी अभिविन्यास से 3 डी डेटा को देखने के लिए उपकरण शामिल हैं। दूसरे, Endrov, ImageJ प्लगइन संगतता 16 के साथ, नेटवर्क या एक विस्तारित प्लगइन वास्तुकला के आधार पर (दूसरों के बीच) पटरियों की छवि विश्लेषण, डाटा प्रोसेसिंग, और एनोटेशन प्रदर्शन करने के लिए बनाया गया एक जावा प्रोग्राम। यह 140 से अधिक छवि प्रसंस्करण संचालन और मॉडल और कच्चे डेटा अलग से प्रदर्शित कर रहे हैं जिसमें एक विस्तृत यूजर इंटरफेस में शामिल है। इसके स्रोत कोड https://github.com/mahogny/Endrov पर पाया जा सकता है। तीसरा, PIVlab, एक एममात्रात्मक और गुणात्मक कण प्रवाह क्षेत्र 17 का विश्लेषण करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है कि डिजिटल कण छवि velocimetry के लिए ATLAB उपकरण। इस प्रोग्राम का उपयोग प्रसंस्करण उपकरण बॉक्स (http://mathworks.com) छवि भी शामिल है कि एक MATLAB लाइसेंस की आवश्यकता है। PIVlab मात्रात्मक प्रवाह का वर्णन करने के लिए कार्यक्रम तैयार किया है। यह छवि जोड़े या श्रृंखला के भीतर वेग वितरण, परिमाण, vorticity, विचलन, या कतरनी खरीदते हैं। इस के लिए, यह सबसे संभावित कण विस्थापन प्राप्त करने के लिए एक छवि जोड़ी की (प्रोटोकॉल अनुभाग में 'नामक गुजरता') छवियों के छोटे क्षेत्रों पार संबद्ध। इस पार से संबंध प्रत्यक्ष पार से संबंध या क्रमश: एक तेजी से फूरियर परिवर्तन (FFT), या तो उपयोग अंतरिक्ष या आवृत्ति डोमेन में विश्लेषण किया जा सकता है कि एक संबंध मैट्रिक्स अर्जित करता है।

यहां इस्तेमाल किया उपकरण एक Nipkow ('कताई') डिस्क, एक EMCCD, 488 और 561 एनएम मानक ठोस के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप हैराज्य पराबैंगनीकिरण, और तेल या पानी विसर्जन उद्देश्यों apochromat 20x हवा या 40x या 60x योजना /। हालांकि, यह अन्य इमेजिंग तौर तरीकों के साथ समय व्यतीत इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए भी संभव है, जैसे, point-, लाइन- या deconvolution या संरचित के साथ संयुक्त चादर स्कैनिंग लेजर आधारित माइक्रोस्कोपी, बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी, साथ ही महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी रोशनी। एक Nipkow डिस्क प्रणाली का उपयोग करने का लाभ यह है कि एक स्ट्रीमिंग मोड (निरंतर आंदोलन और z आयाम में वस्तु की स्कैनिंग) उपलब्ध है, खासकर अगर बहुत तेजी से छवि अधिग्रहण है। इसके अलावा, संकल्प में सुधार करने के लिए, EMCCD के सामने एक 1.5 गुना आवर्धक भरनेवाला इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Protocol

सी के 1. तैयारी एलिगेंस भ्रूण समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए microbeads का उपयोग

  1. M9 बफर की एक बूंद में एक कीड़ा लेने (प्लैटिनम तार) का उपयोग करके गर्भवती वयस्क कीड़े स्थानांतरण और सख्ती आंदोलनकारी और फिर एक दांत लेने / विंदुक टिप पर मुहिम शुरू की एक आँख चाबुक का उपयोग कर M9 के एक बगल ड्रॉप करने के लिए प्रत्येक कीड़ा स्थानांतरित पहले से बैक्टीरिया को साफ या एक उठाई गिलास केशिका का उपयोग करें।
  2. , 4 HPO, 5 ग्राम सोडियम क्लोराइड M9 बफर (1 एल M9 बफर 3 जी 2 के.एच. शामिल पीओ 4, 6 ग्राम 2 ना में 20 माइक्रोन व्यास polystyrene मोती 10 गुना युक्त फैलाव पतला, और वाष्पदावी (20 मिनट, 120 डिग्री के बाद सी),) एक 1 एम MgSO 4 समाधान का एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. पतली गिलास केशिका के किसी भी प्रकार से एक मुँह पिपेट बनाओ (जैसे, बिंदु केशिकाओं या केशिकाओं इंजेक्शन सुई खींचने के लिए इस्तेमाल किया पिघलने), रबर, सिलिकॉन या इसी तरह की सामग्री ट्यूबिंग (आदर्श पारदर्शी) के एक मोटे तौर पर 0.5 मीटर लंबा टुकड़ा, एक 200 μlपिपेट टिप, एक 200 μl पीसीआर ट्यूब का ढक्कन, छोटे सीरिंज के लिए एक हाइड्रोफोबिक फिल्टर (जैसे।, एक 0.2-0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार और 15-50 मिमी व्यास नायलॉन, PTFE या इसी तरह की सामग्री फिल्टर), और एक 1000 μl विंदुक टिप । मुँह पिपेट इस प्रकार का कोई जैविक सामग्री प्रयोगकर्ता के साथ संपर्क में प्राप्त कर सकते है।
  4. ट्यूबिंग में पहली टिप के साथ 200 μl विंदुक टिप डालने से पिपेट को इकट्ठा करने और इस्तेमाल किया केशिका के व्यास से मेल खाता है कि एक केंद्रीय छिद्र है जो एक पीसीआर ट्यूब का ढक्कन के साथ प्लग। एक बहुत ही बताया सूआ या तैयारी सुई छिद्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. एक पतली केशिका ड्रा और छिद्र में डालें। ट्यूबिंग के दूसरे छोर में फिल्टर डालें और चित्रा (1) मुँह टुकड़े के रूप में एक 1000 μl विंदुक टिप डालें।
  6. एक साफ रेजर ब्लेड या छुरी के साथ योनी में transversely कीड़े के काटने से गर्भवती वयस्कों काटना।
    नोट: आमतौर पर, कई भ्रूण ई होगीकाटने के बाद xpulsed। जल्दी भ्रूण की जरूरत है हालांकि, अगर वे कभी कभी एक आँख चाबुक या नुकीली सुई का उपयोग कर शव से रिहा किया जाना है।
  7. मुँह पिपेट का उपयोग इस बूंद में एक 24x60 मिमी कवर कांच और हस्तांतरण भ्रूण पर पतला पॉलीस्टीरिन मनका फैलाव (~ 4 μl) की पिपेट एक बूंद।
  8. ध्यान से एक छोटी सी (जैसे, 18x18 या 20x20 मिमी) जगह बूंद के शीर्ष पर गिलास को कवर किया और ड्रॉप पूरी तरह से बाहर फैल गया है सुनिश्चित करें।
    नोट: बूंद भी छोटे गिलास को कवर के किनारों को छूने के लिए पर्याप्त नहीं छोटा होना चाहिए।
  9. तरलीकृत वैसलीन के साथ माउंट सील। 24x60 मिमी कवर पर्ची पक्ष पर विसर्जन के तेल की एक बूंद जोड़ें और 'समय चूक माइक्रोस्कोपी' अनुभाग के लिए आगे बढ़ें।

एडल्ट सी 2. तैयारी एलिगेंस पशु समय चूक माइक्रोस्कोपी Nanobeads प्रयोग करने के लिए

नोट: सामान्य में, वयस्क जानवरों के बढ़ते के लिए प्रोटोकॉल रेफरी से प्रोटोकॉल का रूपांतरण है। 18।इस प्रोटोकॉल के साथ, यह वयस्क जानवरों के लंबी अवधि के समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए संभव है।

  1. एक 1.5% तैयार M9 बफर में agarose समाधान (w / v), फोड़ा (1 मिनट, नहाने के पानी या माइक्रोवेव में 100 डिग्री सेल्सियस)। इस आंत और / या जननद के कुछ हिस्सों के बाहर निकालना के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के बाद से agarose की उच्च सांद्रता के उपयोग की सिफारिश नहीं की है।
  2. दो खुर्दबीन स्लाइड प्रत्येक पर टेप के 2-3 परतों के नीचे रहो। टेप के साथ दो स्लाइड्स के बीच टेप के बिना एक स्लाइड रखें।
  3. एक विंदुक टिप का उपयोग करें और मध्य स्लाइड के केंद्र में गर्म agarose समाधान की एक बूंद जगह है। यह प्रत्येक पक्ष पर टेप परतों के द्वारा समर्थित है कि इतनी जल्दी ड्रॉप पर एक और स्लाइड जगह। यह लगभग 10 मिमी व्यास का एक दौर और फ्लैट अगर पैड का निर्माण करेगा।
  4. पैड पर (v) डब्ल्यू / (2.6% है, जो undiluted,) 100 एनएम मनका समाधान की एक बूंद डाल दिया। एक कीड़ा लेने के साथ बूंद में 1-10 साफ वयस्क कीड़े स्थानांतरण। प्रॉट के रूप में समझाया 18x18 मिमी कवर कांच और वैसलीन के साथ सीलocol 1।

3. समय चूक माइक्रोस्कोपी

  1. खुर्दबीन स्लाइड या कांच कवर सैंडविच पर विसर्जन के तेल की एक बूंद रखो। नमूना पता लगाने के लिए कम बढ़ाई (5x या 10x लेंस) में brightfield का प्रयोग करें।
    नोट:, जैसे (सी भ्रूण एलिगेंस के लिए विशेष रूप से) के रूप में संभव के रूप में ज्यादा नीली बत्ती, करने के लिए निवेश की सीमा / मिल नमूना ध्यान केंद्रित लेकिन इसके बजाय brightfield का उपयोग करने के लिए महामारी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग नहीं करते।
  2. उच्च आवर्धन (40x या 60x उद्देश्यों) को बदलने के लिए, (केंद्रीय विमान या अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के आधार पर नमूने के ऊपर / नीचे विमानों, या तो) को ध्यान में नमूना लाने के लिए।
  3. 1 माइक्रोन दूरी पर 30 विमानों के लिए नमूना अंतराल सेट हर 1min दर्ज की गई। एक स्वचालित xy- या xyz चरण उपलब्ध है मामले में, कई स्थानों एक सत्र में दर्ज किया जा सकता है। प्रतिदीप्ति इमेजिंग स्विच करने के लिए और फिर से ध्यान केंद्रित की जाँच करें।
    नोट: अब थोड़ा जोखिम बार उपयोग बल्कि, उच्च लेजर शक्तियों का उपयोग कर से बचने की कोशिशबहुत कम तीव्रता पर। उपाय गतिशीलता सीमा होती फसलों जो संतृप्ति, से बचने के लिए छवि अधिग्रहण कार्यक्रम में या ImageJ में, या तो सही दूर छवियों का अधिग्रहण और भी अत्यधिक विकिरण जोखिम का मतलब है।
  4. समय चूक श्रृंखला शुरू रिकॉर्डिंग।
    नोट:, कलाकृतियों का विश्लेषण करने को बाहर निकाल नमूना स्कैनिंग के बीच लंबे समय (3-10 मिनट) समय अंतराल के साथ शुरू करते हैं और धीरे-धीरे वांछित अंतराल के लिए अस्थायी नमूना बढ़ाने के लिए। एक सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन जब दोनों ही मामलों में विकासात्मक समय के साथ-साथ अंत अंक समान होना चाहिए। इसके अलावा, यह phototoxicity और जीवित रहने की दरों का आकलन करने के लिए अक्सर आवश्यक है। इसलिए, लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी के बाद पर्वत से नमूना ठीक हो और वे रहते / विकसित करने के लिए जारी रखने या नहीं।

4. IMOD साथ एक 3 डी सेल आकार मॉडल पुनर्निर्माण

नोट: http://bio3d.colorado.edu/imod/: IMOD सॉफ्टवेयर IMOD वेब पेज से उपलब्ध है। सॉफ्टवेयर की स्थापना का वर्णन हैवहाँ डी। विंडोज ओएस का उपयोग करते समय, एक यूनिक्स टूलकिट भी IMOD वेबपेज पर एक पैकेज के रूप में पाया जा सकता है, जो स्थापित हो गया है। इसके अलावा, IMOD वेबपेज (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html) पर उपलब्ध एक उत्कृष्ट संकलित 3dmod परिचय नहीं है।

  1. यूनिक्स खोल खोलें और "IMOD" में टाइप करें। IMOD विंडो खुलेगा। एक 3 डी मॉडल उत्पन्न होगा, जो कच्चे डेटा (आदर्श एक खड़ी TIF या समान) के साथ फ़ाइल का चयन करें।
  2. जानकारी खिड़की (अप और स्क्रॉल उपकरण नीचे) का उपयोग करके जैप खिड़की में वस्तुओं के नीचे और ऊपर का पता लगा।
  3. सेल की रूपरेखा अनुरेखण शुरू करो। महत्वपूर्ण बात है, प्रत्येक कोशिका एक वस्तु है कि यह सुनिश्चित करने। प्रत्येक कोशिका के ऊपर विमान के साथ शुरू और जानकारी विंडो का उपयोग कर वहाँ पहले समोच्च पैदा करते हैं। Z में नीचे स्क्रॉल करें और प्रत्येक Z-विमान के लिए एक नया समोच्च पैदा करते हैं।
  4. 3 डी में मॉडल के लिए जरूरत के रूप में के रूप में कई कोशिकाओं के लिए एक ही मत करो। एक नया सेल की शुरुआत के साथ जब एक नई वस्तु बनाने के लिए मत भूलना।
    एनOTE: समोच्च ट्रेसिंग और कई उपयोगी plugins के लिए कई अलग अलग तरीके हैं। जानकारी के लिए IMOD वेबपेज और ऑनलाइन ट्यूटोरियल जाएँ। यहाँ दिखाया मामले में, डिफ़ॉल्ट सेटिंग इस्तेमाल किया गया है।
  5. वस्तुओं और उनके आकृति का निरीक्षण करने के लिए "मॉडल देखें" विंडो खोलें।
  6. "वस्तुओं" - "मॉडल देखें" टूलबार में "संपादित करें" चुनें। संबंधित संपादन विंडो खुलेगा।
  7. "डेटा प्रकार ड्रा" और "ड्राइंग शैली" के रूप में "भरने" के रूप में "जाल" चुनें, भरा और बंद वस्तुओं के रूप में कोशिकाओं को मॉडल के लिए। विंडो के निचले बाएँ पर स्क्रॉल चयन में "Meshing" पर क्लिक करें। निचले सही पर चयन में विकल्प 'टोपी' की जाँच करें। आवश्यक के रूप में कई वस्तुओं की जाँच करें और "सभी जाल" पर क्लिक करें। कार्यक्रम की आकृति के ढेर से ठोस वस्तुओं उत्पन्न होगा। जेड-नमूने कारक "देखें" विंडो में "जेड पैमाने पर" बदलकर समायोजित किया जा सकता है।
  8. हटो / 3 डी ओर्ब बारी बारी सेटी ("संपादित करें" - "देखें") और फोटो या फिल्मों को बचाने ("फाइल" - "स्नैप झगड़ा के रूप में ..." या "मूवी / असेंबल")।

Endrov साथ 5. ट्रैकिंग fluorescently लेबल संरचनाएं

नोट: सेल पहचान (जैसे, H2B, पीएच-पीएलसी-डी 1) और एक कोशिका विभाजन के बचे हुए लोग मार्कर (उदाहरण के लिए एक परमाणु या प्लाज्मा झिल्ली मार्कर के साथ एक तनाव का उपयोग, कोशिका विभाजन के अवशेष को ट्रैक करने के लिए, Nmy -2, में ज़ेन-4 )। परमाणु या प्लाज्मा झिल्ली मार्कर कोशिका विभाजन के बचे हुए लोग विरासत में मिली है, जो सेल निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. तेजी से लोड और उपयोग में आसानी के लिए, कच्चे डेटा (ImageJ में, उदाहरण के लिए) एक झगड़ा फ़ाइल में परिवर्तित हो गया है। इसके बाद, खुले Endrov और फाइल लोड फ़ाइल मेनू से "लोड फ़ाइल" विकल्प चुनने के द्वारा विश्लेषण किया जाना है। उपकरण पट्टी पर "2 डी व्यूअर" आइकन पर क्लिक करें।
  2. नीचे दायें कोने में ("फ़िट रेंज" आइकन पर नीले आइकन पर क्लिक करके हिस्टोग्राम समायोजित करेंEndrov स्क्रीन के)। "फ़ाइल नाम" - - "Imageset" - करने के लिए "डाटा" जा रहा द्वारा xyz के संकल्प सेट "चैनल" - "xyz के संकल्प सेट करें"। एक्स और वाई संकल्प 0.2 माइक्रोन है जैसे अगर एक्स, वाई, जेड, 5, 5, 1 के लिए मूल्यों में टाइप करें और जेड में हर 1 माइक्रोन का नमूना
  3. नाभिक व्याख्या के लिए ब्याज के विमान में ले जाएँ और "2 डी व्यूअर" पर क्लिक करें। लटकती मेनू से "वंश" का चयन करें और "नया वंश" चुनें।
  4. क्लिक करके और नाभिक पर खींचकर, यह चिह्नित किया जा सकता। नाभिक करने के लिए, ठीक क्लिक करें और लटकती मेनू से "कण का नाम बदलें" चुनें। बढ़ाने या वृत्त के व्यास को कम करने के लिए, के रूप में चिह्नित वृत्त के बाईं पर प्रतीत होता है कि तीर आइकन खींचें। नाभिक के मध्य विमान को चिह्नित करने के लिए, सही आइकन पर क्लिक करें। एक प्लाज्मा झिल्ली मार्कर का उपयोग करते हैं, एक बड़े क्षेत्र सेल के सबसे को कवर किया जाएगा कि खींचा जा सकता है।
  5. समय और विमान में आगे बढ़ने के लिए, "फ्रेम" और "Z" चुनेंनीचे उपकरण पट्टी पर विकल्प। अगली बार बात करने के लिए जाने के बाद, उसके अनुसार नाभिक के निशान है कि वृत्त की स्थिति या आकार को समायोजित। नज़र रखी सेल विभाजित जब तक इस दोहराएँ।
  6. एक कोशिका विभाजन होता है तो बेटी नाभिक के निशान और "वंश दर्शक" के लिए स्विच। इस शीर्ष उपकरण पट्टी पर "विंडोज" आइकन पर क्लिक करके चुना जा सकता है। मार्क एक साथ सभी तीन नाभिक, शीर्ष टूलबार में "वंश" विकल्प के लिए जाने के लिए और "एसोसिएट जनक" का चयन करें।
  7. सेल ट्रैकिंग समाप्त हो गया है, पर नज़र रखने के लिए कोशिका विभाजन के बचे हुए लोग अंकन चैनल के लिए स्विच। चैनल स्विच करने के लिए, उपकरण पट्टी के नीचे बाएँ कोने पर फ़ाइल नाम पर क्लिक करें। नाभिक के लिए ऊपर वर्णित के रूप में कोशिका विभाजन के बचे हुए लोग (या किसी भी अन्य संरचना) लगाया जा सकता है।
  8. "वंश" - - "संपादित करें" और संपादित किया जाएगा कि वंश नंबर पर क्लिक करने के लिए बंद करने के बाद सॉफ्टवेयर की ओर लौटने, जब वह "2 डी व्यूअर" पर जाने के लिए आवश्यक है।

    6. PIVlab साथ cortical actomyosin प्रवाह का विश्लेषण

    नोट: PIVlab से एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर है: http://pivlab.blogspot.de/; यह PIVlab_GUI लिखकर मैटलैब कमांड लाइन वातावरण के भीतर से लागू किया जा सकता है। PIVlab के साथ काम करते हैं, यह एक अलग फ़ोल्डर में छवि श्रृंखला बचाने के लिए सिफारिश की है।

    1. "फाइल" मेनू से एक नया सत्र शुरू करो। "लोड छवियों" बटन पर क्लिक करके छवि फ़ाइलों को लोड करें।
    2. अनुक्रमण शैली 1-2, 2-3 चयन करें ... और इच्छित छवियों के अनुक्रम में शामिल है कि निर्देशिका पर जाएँ। छवियों का चयन करें और "जोड़ें" बटन और आयात पर क्लिक करें।
    3. "विश्लेषण सेटिंग्स" के लिए जाओ और "बहिष्करण (आरओआई, मास्क)" का चयन करें। वैकल्पिक रूप से, प्रेस "Ctrl + ई"। छवि / एस (भ्रूण के बाहर यानी, क्षेत्र) के अवांछित भाग निष्क्रिय करने के लिए "वर्तमान फ्रेम के लिए मुखौटा (एस) ड्रा" बटन का प्रयोग करें।
    4. "PIV सेटिंग" का चयन शुक्रवार"विश्लेषण सेटिंग" मेनू ओम। वैकल्पिक रूप से, प्रेस "Ctrl + एस"। वांछित PIV एल्गोरिथ्म के रूप में "FFT खिड़की विरूपण" चुनें।
      नोट: फास्ट फूरियर परिवर्तन (FFT) कम्प्यूटेशनल लागत कम कर देता है, लेकिन संकेत अच्छी तरह से शोर से ऊपर है और अध्ययन के कणों का विस्थापन (6.5 देखें) का विश्लेषण किया आधा पास क्षेत्र से अधिक नहीं है, अगर है की सिफारिश की ही है।
    5. बाद में छवियों के बीच तीव्रता पार सहसंबंध के लिए पूछताछ के क्षेत्र हैं, जिनमें तीन गुजरता है, के लिए निम्न मान दर्ज करें: 1 दर्रा: पूछताछ 64 पिक्सल के क्षेत्र 32. दर्रा 2 के एक कदम के साथ: पूछताछ 32 पिक्सल का क्षेत्र 16 के एक कदम के साथ । ड्रॉप डाउन मेनू खिड़की विरूपण से "रैखिक" का चयन करें। उप पिक्सेल विस्थापन के आकलन के लिए गाऊसी 2 * 3 सूत्री विधि चुनें।
    6. का चयन करें "विश्लेषण!" विश्लेषण मेनू और बटन का उपयोग से एक विश्लेषण शुरू करने के लिए "सभी फ्रेम विश्लेषण"।
    7. पोस्ट प्रोसेसिंग के लिए "" वेक्टर सत्यापन "से चयन; पोस्ट प्रसंस्करण "मेनू और 7 के लिए मानक विचलन (STDEV) फिल्टर सीमा निर्धारित है और सभी फ्रेम करने के लिए लागू होते हैं।
    8. "साजिश" मेनू से "डेटा को संशोधित / मानकों को निकाले जाते हैं" चुनें। लटकती मेनू से "वैक्टर [पिक्सल / फ्रेम]" का चयन करें। वैक्टर और उच्च मार्ग फिल्टर की चिकनाई समायोजित करें और सभी फ्रेम करने के लिए लागू होते हैं।
    9. सभी फ्रेम का मतलब वैक्टर की गणना करने के लिए 1 "फ्रेम इस्तेमाल" सेट करने के लिए: अंत और "मतलब वैक्टर गणना" बटन पर क्लिक करें।

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Representative Results

प्रोटोकॉल 2, 3, और 4, जंगली प्रकार सी में जननग्रन्थि के समय चूक इमेजिंग का उपयोग करके एलिगेंस वयस्कों के लिए किया जाता है (तनाव OD58 (यूएनसी-119 (ed3) तृतीय; ltIs38 [pAA1; पाई -1 :: GFP :: पीएच (PLC1delta1) + यूएनसी-119 (+)]), एक germline प्रमोटर से एक झिल्ली मार्कर व्यक्त )। जननद के मोड़ पर केंद्रित है, जनन कोशिकाओं के एक 3 डी मॉडल माइक्रोस्कोपी डेटा (चित्रा 2) से उत्पन्न होता है। यह मॉडल कोशिकाओं पारगमन समीपस्थ हाथ करने के लिए बाहर का फार्म, जबकि सेल के आकार में परिवर्तन का विश्लेषण करने की अनुमति देता है प्राक्ष के संगठन और प्राक्ष करने के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं के संपर्क के आकार का पता चलता है (यह भी देखें http: //www.wormatlas। org / उभयलिंगी / रोगाणु% 20line / Germframeset.html)।

इसके बाद, प्रोटोकॉल 1, 3, और 5 सी की लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं itIs37 [पाई-1P :: mCherry :: H2B :: पाई -1 3'UTR + यूएनसी-119 (+)]; stIs10226 (यूएनसी-119 (ed3) तृतीय तनाव RW10226 की एक अंतर है जो एलिगेंस भ्रूण (तनाव CHP52 [उसकी -72 प्रमोटरसाथ उसकी -24 :: mCherry translational संलयन जाने-858 3 'UTR + यूएनसी-119 (+)]) और तनाव LP162 (Nmy -2 (cp13 [Nmy-2 :: + GFP LoxP]) आई)। इस तनाव में, यह एक GFP CRISPR के माध्यम से फ्रेम में एकीकृत किया गया है, जहां genomically संशोधित गैर पेशी मायोसिन द्वितीय ठिकाना / Cas9 प्रौद्योगिकी 19 के माध्यम से दोनों (mCherry-हिस्टोन संलयन प्रोटीन के माध्यम से) नाभिक और कोशिका विभाजन अवशेष (पालन करने के लिए संभव है ) दो रंग समय चूक माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3 का उपयोग करते समय एक साथ छोड़ दिया है, पैनल)। Endrov में दोनों संरचनाओं के lineaging द्वारा प्राप्त मॉडल कोशिका विभाजन के बचे हुए लोग विरासत 13,14 के पहले वर्णित टकसाली पैटर्न दिखा। इसके अलावा, lineaging डेटा, प्रत्येक कोशिका और कोशिका विभाजन बचे हुए लोग (चित्रा 3, सही पैनल) और कोशिका विभाजन के बचे हुए लोग हठ के समय के लिए पटरियों से और साथ ही सेल को सहसंबंध (Nmy -2 GFP -signal के आधार पर) विभाजन के समय <(प्राप्त किया जा सकताए.बी.ए. वंश केवल) के लिए दिखाया मजबूत> चित्रा 4,। इसके अलावा में एक प्लाज्मा झिल्ली मार्कर का उपयोग करते हैं, यह कोशिका विभाजन के बचे हुए लोग internalization का समय बिंदु निरीक्षण करने के लिए भी संभव है।

अंत में, उच्च अस्थायी समाधान कॉर्टिकल गैर पेशी मायोसिन द्वितीय (Nmy -2 GFP) (क z ढेर रिकॉर्डिंग के बीच 5 एस के अंतराल) के साथ प्रोटोकॉल 1, 3, और 6, अल्पकालिक समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जाता है। यहाँ ध्यान जंगली प्रकार और भ्रूण रो GTPase को सक्रिय प्रोटीन RGA -3 20,21 के लिए आरएनएआई समाप्त बीच इस प्रवाह की तुलना द्वारा कॉर्टिकल ध्रुवीकरण प्रवाह की गतिशीलता में मतभेद पर स्थित है। RGA -3 आरएनएआई भ्रूण में प्रवाह इस धुरी के orthogonal है, जबकि हाल ही में टिप्पणियों 22 के लिए इसी प्रकार, जंगली प्रकार भ्रूण में प्रवाह, मुख्य रूप से भ्रूण की लंबी अक्ष (चित्रा 5, बाएं पैनल) के साथ है। यह लगातार समय बिंदुओं overlaying से या PIV analys से आसानी से स्पष्ट है(चित्रा 5, नीचे पैनल) है।

कॉर्टिकल प्रवाह कणों डेटा की सटीक व्याख्या के लिए स्पष्ट रूप से हल किया जा सकता है, ताकि इन मतभेदों का निरीक्षण करने के लिए, यह एक नमूना अंतराल चुनने के लिए महत्वपूर्ण है। छोटे समय के अंतराल (≤5 सेकंड) बड़े विस्थापन और लापता वैक्टर से बचने के लिए सिफारिश कर रहे हैं। पूछताछ खिड़की कणों के आकार का विश्लेषण किया जा सकता है (कॉर्टिकल कणिकाओं) को समायोजित करने के लिए इतना बड़ा होना चाहिए। पड़ोसी पूछताछ खिड़कियों के बीच ओवरलैप वेक्टर रिक्ति को कम करने की अनुमति देता है और इस तरह ग्रिड में वैक्टर की संख्या बढ़ जाती है।

आकृति 1
चित्रा 1. एक मुँह पिपेट कोडांतरण वाम:। फिल्टर के साथ एक मुँह पिपेट इकट्ठा करने के लिए आवश्यक भागों। अधिकार:। इकट्ठे पिपेट करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
जननद बारी क्षेत्र के चित्रा 2. एक 3 डी मॉडल शीर्ष वाम:। समय चूक माइक्रोस्कोपी डेटा से एक ही समय बिंदु के 3 डी प्रोजेक्शन। शीर्ष मध्य और सही: माइक्रोस्कोपी डेटा का 3 डी मॉडल। नीचे:। सेल प्राक्ष संपर्कों के विवरण में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
। नाभिक और कोशिका विभाजन के अवशेष वाम चित्रा 3. ट्रैकिंग: समय चूक माइक्रोस्कोपी डेटा से 3 डी अनुमानों। मध्य: फोटो दोनों नाभिक (रंगीन क्षेत्रों) और कोशिका विभाजन के अवशेष (ग्रे क्षेत्रों) ट्रैकिंग से प्राप्त मॉडल की। अधिकार: फोटोकोशिका विभाजन के बचे हुए लोगों पर नज़र रखने से। अवशेष के लिए रास्तों को भी दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
एक प्रतिनिधि भ्रूण से ए.बी.ए. sublineage। प्रजातियों के लिए चित्रा 4. सेल और कोशिका विभाजन बचे हुए प्रजातियों दिखाए जाते हैं। कोशिका विभाजन वर्गों द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। प्रत्येक टिक मार्क 1 मिनट से मेल खाती है। कोशिका विभाजन के अवशेष बचे हुए उत्पन्न होता है, जिसके दौरान विभाजन से उठता है कि बेटियों के नाम पर रखा गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
PIV शीर्ष के साथ cortical सिकुड़ा प्रवाह की चित्रा 5. विश्लेषण: प्रारंभ (पहली पंक्ति) और PIVlab साथ वेक्टर क्षेत्र की गणना करने के लिए इस्तेमाल समय खिड़की के अंत (दूसरी पंक्ति) को दर्शाती है कि समय चूक माइक्रोस्कोपी से 3 डी प्रोजेक्शन पोस्टरों।। पैनल की तीसरी पंक्ति समय खिड़की के सभी समय अंक की ओवरले से पता चलता है। नीचे:। PIVlab द्वारा प्राप्त वेक्टर क्षेत्रों में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1

वीडियो 1 -। जननद बारी क्षेत्र के 2. एक 3 डी मॉडल आंकड़ा से संबंधित वीडियो कोशिकाओं खंड के लिए इस्तेमाल विमानों के पूरे ढेर के माध्यम से स्क्रॉल के साथ शुरू होता है। ढेर के बाद एक 3 डी अधिकतम प्रक्षेपण एक्स और (के साथ और खंडों जननद के प्राक्ष के बिना) वाई कुल्हाड़ियों के चारों ओर घूर्णन 3 डी segementation मॉडल के आधार पर पीछा किया, दिखाया गया है।

फिल्म 2

वीडियो 2 - नाभिक और कोशिका विभाजन के अवशेष वाम 3. ट्रैकिंग चित्रा से संबंधित:। समय चूक माइक्रोस्कोपी डेटा से 3 डी अनुमानों। मध्य: दोनों नाभिक (रंगीन क्षेत्रों) और कोशिका विभाजन के अवशेष (ग्रे क्षेत्रों) ट्रैकिंग से प्राप्त मॉडल। अधिकार: कोशिका विभाजन अवशेष और उनके प्रक्षेप पथ। स्केल बार 10 माइक्रोन =।

मूवी 3

_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> वीडियो 3 - PIV साथ cortical सिकुड़ा प्रवाह की 5. विश्लेषण चित्रा से संबंधित PIVlab स्केल पट्टी के साथ वेक्टर क्षेत्र की गणना करने के लिए इस्तेमाल एक प्रतिनिधि जंगली प्रकार और RGA -3 आरएनएआई भ्रूण की 3 डी अधिकतम प्रक्षेपण समय चूक रिकॉर्डिंग।। = 10 माइक्रोन।

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Discussion

विकास में ट्रैकिंग वस्तु के माध्यम से, विशेष रूप से परमाणु ट्रैकिंग में, यह सी के मध्य patterning के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए संभव हो गया है एलिगेंस 1,23,24 embryogenesis। उच्च throughput के लिए इस रणनीति का विस्तार, यह अतिरिक्त patterning के नियमों को उजागर करने और patterning परिणाम निकालना करने के लिए कैसे एक विधि नए सिरे से 10 नियम प्रस्ताव करने के लिए हाल ही में संभव हो गया है। कई म्यूटेंट के लिए, तथापि, सटीक patterning के दोषों को अभी भी अज्ञात है। यहाँ वर्णित विधि उनकी व्याख्या करने में सहायक हो सकता है कि उपकरण हैं। महत्वपूर्ण बात है, यह कई अन्य मॉडल प्रणाली सी की तरह एक अपरिवर्तनीय विकास का पालन नहीं करते कि हालांकि हाल के वर्षों में स्पष्ट हो गया है एलिगेंस, वस्तु ट्रैकिंग और मात्रात्मक ट्रैकिंग डेटा के विश्लेषण के विकास तंत्र और रोग के तंत्र की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

यह या तो बहुत होगा जहां यहाँ दिखाया तरीकों स्थिति में विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल हैंक्रमश: वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर उपकरणों को लागू करने के लिए और अधिक जटिल और / या स्वयं उत्पन्न सॉफ्टवेयर समाधान, या बस भी महंगा लागू करने के लिए चुनौतीपूर्ण। महत्वपूर्ण बात है, यहाँ पर चर्चा उपकरण लोड और स्वतंत्र रूप से वे दर्ज किया गया है, जो साधन पर किसी भी डेटा का विश्लेषण करने के शोधकर्ता सक्षम। मालिकाना छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जाता है, तो इसके अलावा, ImageJ के मालिकाना प्रारूप में डेटा लोड और मानक प्रारूपों (जेपीईजी, झगड़ा) में उन्हें बचा सकता है कि जैव प्रारूप प्लगइन प्रदान करता है।

समय चूक माइक्रोस्कोपी पर भरोसा करते हैं कि सभी प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम सही परिस्थितियों का चयन करने के माइक्रोस्कोपी छवियों में पर्याप्त विपरीत प्राप्त करने के लिए, और एक ही समय में, नमूना के लिए विकिरण जोखिम को कम करना है। इस भारी इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के प्रकार पर निर्भर करता है और यह आम तौर पर इस तरह की कताई डिस्क या एकल विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी के रूप में तेजी से स्कैनिंग तकनीक का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। विशेष रूप से, cortical गतिशीलता के PIV, बिंदु स्कैनिंग के पुराने संस्करणों के लिएमाइक्रोस्कोप एक पर्याप्त संकल्प और वैध विश्लेषण प्रदर्शन करने की गति पर कॉर्टिकल संकेतों पर कब्जा करने की अनुमति के लिए बहुत धीमी गति से हो सकता है। इसलिए यह हमेशा ध्यान से विकिरण जोखिम का मूल्यांकन करने और नमूना की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ पर चर्चा प्रोटोकॉल भ्रूण माउंट करने के लिए micobeads उपयोग हालांकि इसके अलावा, यह सिर्फ तैयार करने के लिए थोड़ा और अधिक समय लेता है, लेकिन कम खर्चीला है और समान रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कुछ अनुभव के साथ जो agarose पैड, उपयोग करने के लिए भी संभव है। हालांकि, यह है कि यह किसी भी लकवाग्रस्त एजेंट, जैसे, levamisole के उपयोग से बचा जाता है के बाद से agarose पैड और nanobeads के संयोजन वयस्क कीड़े की लंबी अवधि के स्थिरीकरण के लिए बेहतर तरीका है कि बाहर बताया जाना चाहिए।

यह यहां चर्चा उपकरण वे पूरी तरह से स्वचालित डेटा विश्लेषण प्रदर्शन नहीं करते हैं क्योंकि उनकी सीमाएं हैं कि बताया जाना चाहिए। हालांकि, कोशिका विभाजन के अवशेष की तरह संरचनाओं के लिए, यह अक्सर ही है कि एक आणविक मार्कर की पहचान करने की चुनौती दे रहा हैविश्वसनीय नज़र रखने के लिए महत्वपूर्ण है जो इस संरचना, मानना। एक प्रमुख भविष्य चुनौती इसलिए मशीन सीखने और हम यहाँ पर चर्चा है कि करने के लिए उपयोग में आसान और खुले उपयोग सॉफ्टवेयर में अनुकूलनीय का पता लगाने / विभाजन एल्गोरिदम जैसी सुविधाओं सहित में निहित है। इन सुविधाओं में से कुछ लंबे समय के अंतराल पर दोहराया ट्रैकिंग के साथ सौदा कर सकते हैं कि विशेष रूप से सॉफ्टवेयर में, अन्य सॉफ्टवेयर मॉड्यूल में पाया जा सकता है, या उस के लिए तैयार कर रहे हैं जो ट्रैकिंग डेटा के बड़े सेट (उदाहरण के लिए, StarryNite / AceTree 25 या Nucleitracker4D 26, तुलना कर सकते हैं हिस्टोन-संलयन प्रोटीन या स्पिंडल 27 का उपयोग कर ट्रैक नाभिक, या सिमी बायोसेल 28)। इन उपकरणों नाभिक के अलावा अन्य संरचनाओं की ट्रैकिंग पर निशाना जब लागू करने के लिए और अधिक जटिल हो सकता है। नज़र रखी जानी चाहिए कि विशेष संरचना के होते हुए भी, इन कार्यक्रमों में आम तौर पर छवि डेटा की बड़ी मात्रा का विश्लेषण किया जाएगा जब बहुत मददगार रहे हैं। महत्वपूर्ण बात है, जैसा कि ऊपर उल्लेख सॉफ्टवेयर मॉड्यूलर के बीच अनुकूलता नहीं हैतों।

अन्य मॉडल सिस्टम के साथ काम कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, भ्रूण मक्खी, स्तनधारी संवर्धित कोशिकाओं, आदि), यहाँ प्रस्तुत तरीकों में भी जैसा कि ऊपर वर्णित orthologous संरचनाओं को ट्रैक करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, स्वतंत्र रूप से आदि जांच के तहत मॉडल प्रणाली, अलग subcellular संरचनाओं, जैसे, centrosomes, nucleoli, microparticles, पुटिकाओं के तत्काल ही अधिग्रहण पैरामीटर वस्तु पटरियों की पूरी कैप्चरिंग सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जाना है, पता लगाया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microscope Motic/VWR OT4005S Stereo microscope for dissection and mounting
Polybead Polystyrene Microspheres,  Polysciences 18329 Embryo mounting
20 µm
Polybead Polystyrene Microspheres,  Polysciences 876 Adult animal mounting
0.1 µm
Microscope slides VWR 631-0902 Adult animal mounting
Cover glass 18x18 mm VWR 631-1331 Embryo/adult mounting
Cover glass 24x60 mm VWR 631-1339 Embryo mounting
Scalpel VWR 233-5455 Embryo dissection
Silicone tubing VWR 228-1501 Tubing for mouth pipette
30 mm PTFE membrane filter NeoLab Jul-01 Filter for mouth pipette
Capillary tubes VWR 621-0003 Pipette tip for mouth pipette
Vaseline Roth E746.1 Embryo/adult mounting
Agar Roth 5210.5 Adult animal mounting
Potassium-di-hydrogenphosphate Roth P018.2 M9 buffer
Di-sodium- hydrogenphosphate Roth P030.2 M9 buffer
Sodium chloride Roth 3957.1 M9 buffer
VisiScope Spinning Disc Confocal System Visitron Systems n/a Confocal microscopy

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 106 मात्रात्मक जीव विज्ञान विकास समय चूक माइक्रोस्कोपी ट्रैकिंग 3 डी मॉडलिंग भ्रूण cortical प्रवाह
में विकास की प्रक्रिया पर नज़र रखने और बढ़ाता<em&gt; सी। एलिगेंस</em&gt; खुले स्रोत उपकरण का उपयोग
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Dutta, P., Lehmann, C., Odedra, D.,… More

Dutta, P., Lehmann, C., Odedra, D., Singh, D., Pohl, C. Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools. J. Vis. Exp. (106), e53469, doi:10.3791/53469 (2015).

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