El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em> C. elegans</em> Uso de las herramientas de código abierto
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
Cuantitativamente capturar los procesos de desarrollo es crucial para derivar modelos mecanicistas y clave para identificar y describir los fenotipos mutantes. Aquí se presentan los protocolos para la preparación de los embriones y de adultos C. elegans animales para microscopía de lapso de tiempo corto y largo plazo y los métodos para el seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo. Los métodos presentados se basan en C. cepas disponibles desde el Caenorhabditis Centro de Genética y en software de código abierto elegans que se pueden implementar fácilmente en cualquier laboratorio independiente del sistema de microscopía utilizado. Una reconstrucción de un modelo de células en forma de 3D usando el IMOD software de modelado, seguimiento manual de las estructuras subcelulares marcadas con fluorescencia utilizando el polivalente programa de análisis de imágenes Endrov, y un análisis de flujo contráctil cortical usando PIVlab (Resuelta en el Tiempo Digital por imágenes de partículas Velocimetría Herramienta para MATLAB) se muestran. Se discute cómo estos métodos también se pueden implementar to cuantitativamente capturar otros procesos de desarrollo en diferentes modelos, por ejemplo, el seguimiento de la célula y del linaje de rastreo, seguimiento del flujo de vesículas.
Introduction
Con las mejoras constantes de las proteínas fluorescentes, la ingeniería del genoma, microscopía óptica y soft y hardware, ahora es posible grabar el desarrollo de muchos organismos modelo con resolución espacio-temporal sin precedentes. Esto permite a los investigadores hacen preguntas que no podían ser abordadas con anterioridad o para revisitar los procesos de desarrollo conocidos con el fin de buscar los aspectos pasados por alto. Este progreso ha despertado el campo de la biología del desarrollo cuantitativo, cuyo objetivo es la transformación de los modelos cualitativos e informales en los modelos cuantitativos mediante mediciones exhaustivas y análisis estadísticos.
Seguimiento células y estructuras subcelulares ha hecho posible obtener modelos cuantitativos del desarrollo embrionario, la actividad del sistema nervioso, o división celular 1-12. Mediante el seguimiento de los restos de la división celular durante el desarrollo temprano de la C. elegans embrión, podríamos recientemente revelan que siguen un estéreoruta escrito y constituyen importantes factores de polarización 13,14.
Aquí, los protocolos se presentan que hacen biología cuantitativa del desarrollo se acerca accesible para los no expertos. La atención se centra en tres herramientas recta hacia adelante, libremente disponibles que son implementables en cualquier laboratorio que tiene acceso a la microscopía confocal estándar y computadoras. Estos incluyen un protocolo para generar formas de células en 3D, un protocolo para realizar un seguimiento de los restos de la división celular, y un protocolo para describir cuantitativamente la dinámica actomyosin corticales. El nematodo C. elegans se utiliza como un caso ejemplar, sin embargo, los métodos y herramientas descritos aquí son adecuados para una variedad de preguntas en otros modelos biológicos, por ejemplo, células cultivadas, explantes de tejido, organoides o esferoides, otros embriones, etc.
En general, algunos de los análisis que se muestran aquí también se puede realizar con el popular herramienta ImageJ código abierto (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; o FIJI, las "baterías incluidas" versión de ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) para los que se dispone de muchos plugins para diferentes análisis cuantitativos. Sin embargo, los programas aquí descritos están diseñados para hacer frente a problemas específicos.
En primer lugar, IMOD, el procesamiento de imágenes, el modelado y la suite de pantalla puede ser utilizado para reconstrucciones en 3D de secciones seriadas de electrones o microscopía de luz 15. IMOD también contiene herramientas para la visualización de los datos 3D a partir de cualquier orientación. En segundo lugar, Endrov, un programa Java diseñado para realizar análisis de imágenes, procesamiento de datos, y la anotación de las redes o pistas (entre otros) sobre la base de una arquitectura de plugin extendida, con ImageJ compatibilidad plug-in 16. Contiene más de 140 operaciones de procesamiento de imágenes y una interfaz de usuario extensible en el que el modelo y los datos brutos se muestran por separado. Su código fuente se puede encontrar en https://github.com/mahogny/Endrov. En tercer lugar, PIVlab, un MHerramienta MATLAB para partículas digital de imagen velocimetría que permite al usuario analizar cuantitativa y cualitativamente campos de flujo de partículas 17. El uso de estos programas requiere una licencia de MATLAB que incluye la Imagen Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab es un programa diseñado para describir cuantitativamente el flujo. Se calcula la distribución de velocidad, magnitud, vorticidad, divergencia o cizalla dentro de pares de imágenes o series. Para esto, es cruzada correlaciona áreas pequeñas de las imágenes (llamados 'pases' en la sección de protocolo) de un par de imágenes para derivar el desplazamiento de partículas más probable. Esta correlación cruzada se obtiene una matriz de correlación que se puede analizar en el dominio del espacio o de la frecuencia usando cualquiera de correlación cruzada directo o una transformación rápida de Fourier (FFT), respectivamente.
El equipo utilizado aquí es un microscopio invertido equipado con un Nipkow ('hilar') del disco, un EMCCD, 488 y 561 nm sólido-estándarláseres de estado, y 20x o 40x o aire 60x / plan apochromat objetivos inmersión en aceite o agua. Sin embargo, también es posible realizar formación de imágenes de lapso de tiempo con otras modalidades de imagen, por ejemplo, punto-, de línea o microscopía de barrido de hoja basado en láser, microscopía multi-fotón, así como microscopía de epi-fluorescencia combinado con deconvolución o estructurada iluminación. La ventaja de usar un sistema de disco de Nipkow es la adquisición de imágenes extremadamente rápido, especialmente si un modo de transmisión (movimiento continuo y de exploración del objeto en la dimensión z) está disponible. Además, para mejorar la resolución, un extensor de aumento 1,5 veces en la parte delantera de la EMCCD se puede utilizar.
Protocol
Representative Results
Discussion
A través de seguimiento de objetos en el desarrollo, en particular, de seguimiento nuclear, ha sido posible dilucidar los mecanismos centrales de modelado de C. elegans embriogénesis 1,23,24. Ampliando esta estrategia para un mayor rendimiento, ha sido recientemente posible descubrir reglas de modelado adicionales y proponer un método de cómo deducir patrones gobierna de novo 10. Para muchos mutantes, sin embargo, los defectos de modelado precisas son todavía desconocidos. Lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
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