Abstract
Kvantitativt fange utviklingsprosesser er avgjørende for å utlede mekanistiske modeller og nøkkelen til å identifisere og beskrive mutante fenotyper. Her protokoller presenteres for å forberede embryoer og voksen C. elegans dyr for kort- og langsiktig time-lapse mikroskopi og metoder for sporing og kvantifisering av utviklingsprosesser. Metodene som presenteres er alle basert på C. elegans stammer tilgjengelige fra Caenorhabditis Genetics Center og på åpen kildekode programvare som enkelt kan implementeres i alle laboratorie uavhengig av mikros systemet som brukes. En rekonstruksjon av en 3D-celle-form modellen ved hjelp av modellering programvare IMOD, manuell sporing av fluoresceinmerkede subcellulære strukturer ved hjelp av multi-purpose bildeanalyse program Endrov, og en analyse av kortikal kontraktile strømmer med PIVlab (Time-Løst Digital Particle Bilde velocimetry verktøy for MATLAB) vises. Det diskuteres hvordan disse metodene kan også distribueres to kvantitativt fange andre utviklingsprosesser i ulike modeller, for eksempel, celle sporing og avstamning sporing, sporing av vesikkel flyt.
Introduction
Med de stadige forbedringer av fluorescerende proteiner, genom prosjektering, lysmikroskopi, og data soft- og hardware, er det nå mulig å registrere utviklingen av mange modellorganismer ved enestående rom-tid-oppløsning. Dette gjør forskerne å stille spørsmål som ikke kunne tas opp tidligere eller å revidere kjente utviklingsprosesser for å søke etter oversett aspekter. Denne utviklingen har skapt innen kvantitativ utviklingsbiologi, som tar sikte på å trans kvalitative, uformelle modeller i kvantitative modeller av grundige målinger og statistiske analyser.
Sporing av celler og subcellulære strukturer har gjort det mulig å utlede kvantitative modeller for embryoutvikling, nervesystem-aktivitet, eller celledeling 1-12. Ved å spore celledeling rester under tidlig utvikling av C. elegans embryo, vi kunne nylig avsløre at de følger en stereoskrev banen og utgjør viktig polariserende faktorer 13,14.
Her blir protokoller presenteres som gjør kvantitative utviklingsbiologi tilnærminger tilgjengelig for ikke-eksperter. Fokuset ligger på tre rett fram, fritt tilgjengelige verktøy som er gjennomfør i noen lab som har tilgang til standard konfokalmikroskopi og datamaskiner. Disse inkluderer en protokoll for å generere 3D-celleformer, en protokoll for å spore celledeling rester, og en protokoll for å kvantitativt beskrive kortikale actomyosin dynamikk. Den nematode C. elegans er brukt som et eksempel tilfellet er imidlertid de metoder og verktøy behandlet her, er egnet for en rekke spørsmål i andre biologiske modeller, for eksempel, dyrkede celler, vev eksplantater, organoids eller sfæroider Embryoer andre, etc.
Vanligvis noen av analysene er vist her kan også utføres med den populære open source verktøy ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; eller FIJI, de 'batterier inkludert' versjon av ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) hvor mange plugins for ulike kvantitative analyser er tilgjengelige. Imidlertid programmene diskutert her, er utformet for å håndtere spesifikke problemer.
For det første, IMOD, et bildebehandlings, modellering og visnings pakke kan benyttes for 3D-rekonstruksjoner av seriesnitt fra elektron eller lysmikroskopi 15. IMOD inneholder også verktøy for visning av 3D-data fra alle retninger. Dernest Endrov, et Java-program utviklet for å utføre bildeanalyse, databehandling, og annotering av nettverk eller spor (blant annet) på grunnlag av en utvidet plugin arkitektur, med ImageJ plugin kompatibilitet 16. Den inneholder over 140 bildebehandlingsoperasjoner og en utvidbar brukergrensesnitt som modell og rådata vises separat. Kildekoden finner du på https://github.com/mahogny/Endrov. For det tredje, PIVlab, en MATLAB verktøy for digital partikkel bilde velocimetry som tillater brukeren å kvantitativt og kvalitativt analysere partikkelstrømmer felt 17. Bruken av dette programmer krever en MATLAB lisens som inkluderer Bildebehandling Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab er et program utviklet for å kvantitativt beskrive flyten. Den beregner hastighetsfordeling, størrelse, virvling, divergens, eller skjær innenfor bilde par eller serier. For dette, det cross-korrelerer små områder av bildene (kalt 'pasninger "i protokollen delen) av et bilde paret å utlede den mest sannsynlige partikkel fortrengning. Dette krysskorrelasjon gir en korrelasjonsmatrise som kan analyseres i rommet eller i frekvensdomenet ved å bruke enten direkte krysskorrelasjon eller en hurtig Fourier transformasjon (FFT), henholdsvis.
Utstyret som brukes her er en invertert mikroskop utstyrt med en Nipkow ('spinner') plate, en EMCCD, 488 og 561 nm standard solid-state laser og 20x luft eller 40x eller 60x plan / apochromat olje- eller vannrednings målsettinger. Det er imidlertid også mulig å utføre time-lapse avbildning med andre bildediagnostikk, f.eks punkt-, linje- eller ark-scanning laser-baserte mikroskopi, multi-foton mikroskopi, samt epi-fluorescens mikroskopi i kombinasjon med dekonvolusjon eller strukturert belysning. Fordelen med å bruke en Nipkow plate system er ekstremt rask bildeoverføring, spesielt hvis en streaming-modus (kontinuerlig bevegelse og scanning av objektet i z dimensjon) er tilgjengelig. I tillegg, for å forbedre oppløsning, kan en 1,5 ganger forstørrende ekstender foran EMCCD benyttes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av C. elegans Embryoet for Time-lapse Mikros bruker mikroperler
- Overfør gravid voksne ormer ved hjelp av en orm plukke (platinatråd) i en dråpe M9 buffer og rydde av bakterier ved først kraftig agitering og deretter overføre hver ormen til en tilstøtende dråpe M9 bruker et øye lash montert på en tann hakke / pipettespissen eller bruke en spiss glass kapillær.
- Fortynne spredning inneholder 20 mikrometer i diameter polystyrenperler 10-fold i M9 buffer (1 L M9 buffer inneholder 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, og etter autoklave (20 min, 120 ° C), tilsett en ytterligere 1 ml av en 1 M oppløsning MgSO4).
- Foreta en munn pipette fra enhver type tynn glasskapillar (f.eks, smeltepunkt kapillærer eller kapillærer som brukes til å trekke kanyler), en omtrent 0,5 m langt stykke av gummi, silikon eller lignende materiale rør (ideelt sett transparent), en 200 plpipettespissen, lokket på en 200 pl PCR-rør, et hydrofobt filter for små sprøyter (f.eks., en 0,2 til 0,45 um porestørrelse og 15-50 mm diameter nylon, PTFE eller lignende materiale filter), og en 1000 mL pipettespiss . Denne type munn pipette sikrer at ingen biologisk materiale kan komme i kontakt med experimenter.
- Monter pipette ved å sette 200 ul pipettespissen med spissen først inn i røret, og koble den med lokket av et PCR-rør som har en sentral perforering som samsvarer med diameteren av det kapillære anvendes. En meget spisse syl eller preparater ålen kan brukes til å generere perforeringen.
- Tegn en tynn kapillær og sett den inn i perforeringen. Sett filteret inn i den andre enden av røret, og sette inn en 1000 mL pipettespiss som munnstykket (figur 1).
- Dissekere gravid voksne ved å kutte ormer tvers på vulva med et rent barberblad eller skalpell.
MERK: Vanligvis vil mange embryoer være expulsed etter klipping. Men hvis tidlige embryoer er nødvendig, de noen ganger må bli løst fra kadaveret som bruker et øye lash eller spiss nål. - Pipette en dråpe av den fortynnede polystyrenkule spredning (~ 4 pl) på en 24x60 mm dekkglass og overføre embryo inn i denne slipp ved hjelp av munnen pipette.
- Plasser forsiktig en liten (f.eks 18x18 eller 20x20 mm) dekke glass på toppen av fallet og sørge for at fallet har fullt spredt ut.
MERK: Nedgangen bør også være liten nok til ikke å berøre kantene av det lille dekselet glass. - Tett mount med flytende vaselin. Tilsett en dråpe nedsenking olje på 24x60 mm dekkglass side og fortsett til "Time-lapse Mikroskopi" -delen.
2. Utarbeidelse av Adult C. elegans Dyr for Time-lapse Mikros hjelp Nanobeads
MERK: Generelt er protokollen for montering voksne dyr en tilpasning av protokollen fra ref. 18.Med denne protokollen, er det mulig å utføre langtids time-lapse konfokal mikroskopi av voksne dyr.
- Fremstille en 1,5% (w / v) agarose oppløsning i M9 buffer, koke (1 min, 100 ° C i vannbad eller mikrobølgeovn). Bruken av høyere konsentrasjoner av agarose er ikke anbefalt fordi dette kan føre til ekstrudering av tarmen og / eller deler av gonade.
- Stikke ned 2-3 lag med teip på to objektglass hver. Plasser et lysbilde uten bånd mellom de to lysbilder med tape.
- Bruke en pipettespiss og plassere en dråpe av den varme agarose løsning i midten av den midtre glide. Raskt sted et annet lysbilde til dråpe slik at den støttes av båndlagene på hver side. Dette vil skape en rund og flat agar pad på rundt 10 mm diameter.
- Sette en dråpe 100 nm kuleløsning (ufortynnet, som er 2,6% (w / v)) på puten. Overfør 1-10 rengjøres voksne ormer i rulle med en orm hakke. Forsegle med 18x18 mm dekkglass og vaselin som forklart i Protocol en.
3. Time-lapse mikros
- Sett en dråpe nedsenking olje på objektglass eller dekselet glass sandwich. Bruk lysfelt ved lav forstørrelse (5x eller 10x objektiver) for å finne prøven.
MERK: Begrense eksponering for blått lys så mye som mulig (særlig for C. elegans embryo), for eksempel, ikke bruk epi-fluorescens mikroskopi for å finne / fokusere prøven men bruk lysfelt i stedet. - Bytt til høyere forstørrelse (40x eller 60x mål), ta prøven i fokus (enten sentrale plan eller topp / bunn plan av prøven, avhengig av oppkjøpet programvare).
- Still samplingsintervaller til 30 fly på en mikrometer avstand registreres hver 1min. I tilfelle en automatisert XY eller xyz-scenen er tilgjengelig, kan flere flekker tas opp i én økt. Bytt til fluorescens bildebehandling og sjekk fokus på nytt.
MERK: Prøv å unngå å bruke høy laser krefter, heller bruke litt lengre eksponeringstiderved svært lave intensiteter. Mål kjøpte bilder med en gang, enten i bildet anskaffelsesprogrammet eller i ImageJ å unngå metning, som avlinger dynamikken spenner og betyr også dreven stråling. - Start opptak time-lapse-serien.
MERK: For å utelukke analysere gjenstander, start med lang (3-10 min) tidsintervaller mellom sample scanning og gradvis øke tidsmessig prøvetaking til ønskede intervaller. Developmental timing så vel som sluttpunkt i begge tilfeller bør være lik når det utføres en statistisk analyse. Dessuten er det ofte nødvendig å vurdere fototoksisitet og overlevelse. Derfor gjenopprette prøven fra fjellet etter langsiktig time-lapse mikroskopi og sjekke om de fortsetter å utvikle / live.
4. gjenreise en 3D-Cell Shape modell med IMOD
MERK: IMOD programvare er tilgjengelig fra IMOD nettside: http://bio3d.colorado.edu/imod/. Installasjon av programvaren er beskrived der. Når du bruker Windows OS, har en Unix verktøykasse som skal installeres, som også kan finnes som en pakke på IMOD nettsiden. Videre er det en utmerket samlet 3dmod innføring tilgjengelige på IMOD webside (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).
- Åpne Unix shell og skriv inn "imod". Den IMOD åpnes. Velg filen med rådata (helst en stablet tif eller lignende) for å generere en 3D-modell.
- Finn bunnen og toppen av objektene i Zap vinduet ved hjelp av informasjonsvinduet (opp og ned rulle verktøyet).
- Starte sporing celle skisserer. Viktigere, sikre at hver celle er ett objekt. Begynn med den øverste plan i hver celle og lage den første kontur dit ved hjelp av informasjonsvinduet. Bla nedover i z og opprette en ny kontur for hver z-planet.
- Gjør det samme for så mange celler som nødvendig for å modellere i 3D. Ikke glem å opprette et nytt objekt når du starter med en ny celle.
NERK: Det er mange forskjellige måter for kontur sporing og flere nyttige plugins. Vennligst besøk IMOD nettside og online tutorials for detaljer. I det tilfelle som er vist her, har standardinnstilling blitt brukt. - Åpne "Model View" vinduet for å inspisere objekter og deres konturer.
- I "Model View" verktøylinjen velg "Edit" - "Objekter". Respektive redigeringsvinduet åpnes.
- Å modellere celler som fylles og lukkede objekter, velger du "Mesh" som "Tegn Datatype" og "Fill" som "tegnestil". Klikk på "Rullende" i rullbare valget nederst til venstre i vinduet. Sjekk alternativet "Cap" i valget nederst til høyre. Sjekk så mange objekter som er nødvendig, og klikk "Mesh All". Programmet vil generere solide objekter fra stabler av konturer. Den z-samplingsfaktoren kan justeres ved å endre "Z-skala" i "Vis" -vinduet.
- Flytt / rotere 3D målsettingert ("Edit" - "View") og lagre stillbilder eller video ("File" - "Snap Tiff As ..." eller "Film / Montage").
5. Tracking fluorescensmerkede Structures med Endrov
MERK: For å spore celledeling rester, bruk en stamme med en kjernefysisk eller plasmamembran markør for celle identifikasjon (f.eks H2B, PH-PLC-d1) og celledeling rest markør (f.eks nmy-2, ZEN-4 ). Den kjernefysiske eller plasmamembran markør er viktig å finne ut hvilke celle arver celledeling rest.
- For rask lasting og brukervennlighet, har rådata som skal konverteres til en tiff-fil (for eksempel i ImageJ). Deretter åpner Endrov og laste ned filen som skal analyseres ved å velge "Load file" fra filmenyen. Klikk på "2D viewer" -ikonet på verktøylinjen.
- Justere histogram ved å klikke på "Fit range" -ikonet (det blå ikonet nederst i høyre hjørneav Endrov skjermen). Sett XYZ-oppløsning ved å gå til "Data" - "filnavn" - "Imageset" - "Channel" - "Set XYZ-oppløsning". Taste inn verdiene for X, Y og Z, for eksempel, 5, 5, 1 dersom X og Y-oppløsning er 0,2 mikrometer, og hver prøve 1 um Z.
- For kommentere kjernene, flytte til flyet av interesse og klikk på "2D viewer". Velg "Lineage" fra rullegardinmenyen og velg "New avstamning".
- Ved å klikke og dra på kjernen, kan det merkes. For å nevne kjernen, høyreklikk og velg "Gi nytt navn partikkel" fra rullegardinmenyen. Slik øker eller reduserer diameteren av sirkelen, drar du pilen ikonet som vises på venstre side av den markerte sirkelen. For å markere midtplanet til kjernen, klikk på høyre ikon. Ved bruk av en plasmamembran markør, kan en stor kule trekkes som dekker det meste av cellen.
- For å fortsette i tid og fly, velg "Frame" og "Z"alternativene nederst verktøylinjen. Etter å ha gått til neste tidspunkt, justere plasseringen eller størrelsen på sirkelen som markerer kjernen tilsvarende. Gjenta dette til de spores cellen deler seg.
- Når det er en celledeling, merker datter kjerner og bytte til "Lineage viewer". Dette kan velges ved å klikke på "Windows" -ikonet på verktøylinjen øverst. Mark alle tre kjerner samtidig, gå til "Lineage" i den øverste verktøylinjen og velg "Associate forelder".
- Når celle sporing er ferdig, bytter du til kanalen markerer celledeling rest for sporing. Å skifte kanal, klikk på filnavnet nederst i venstre hjørne på verktøylinjen. Den celledeling rest (eller hvilken som helst annen struktur) kan spores som beskrevet ovenfor for kjernen.
- Når du returnerer til programvaren etter stengetid, er det nødvendig å gå til "2D Viewer" - "Lineage" - "Edit" og klikke på avstamning nummer som skal redigeres.
6. Analysere Kortikal actomyosin Flow med PIVlab
MERK: PIVlab er en fritt tilgjengelig programvare fra: http://pivlab.blogspot.de/; det kan påberopes fra i Matlab kommandolinje miljø ved å skrive PIVlab_GUI. Når du arbeider med PIVlab, anbefales det å lagre bildet serien i en egen mappe.
- Start en ny økt fra "Fil-menyen". Laster bildefilene ved å klikke på "Last bilder" -knappen.
- Velg sekvense stil 1-2, 2-3, ... og navigere til katalogen som inneholder sekvensen av ønskede bilder. Velg bildene, og klikk på "Legg til" knappen og import.
- Gå til "Analyser innstillinger" og velg "ekskluderinger (ROI, maske)". Alternativt kan du trykke "Ctrl + E". Bruk knappen "Tegn maske (er) for gjeldende ramme" for å inaktivere uønsket del av bilde / s (dvs. området utenfor embryo).
- Velg "PIV innstillinger" from den "Analyser innstillinger" -menyen. Alternativt kan du trykke "Ctrl + S". Velg "FFT vindu deformasjon", som ønsket PIV-algoritmen.
MERK: Fast Fourier transformasjon (FFT) reduserer beregningskostnad, men anbefales bare signalet er godt over støy, og hvis forskyvning av partiklene studerte ikke overskrider halvparten av pass området analyseres (se 6.5). - Angi de følgende verdier for de tre passeringer, som er det området av utspørrings intensitet for krysskorrelasjon mellom påfølgende bilder: Bestått 1: avlesning område av 64 bildeelementer med et trinn med 32. Pass 2: avlesning område på 32 bildeelementer med et trinn med 16 . Velg "lineær" fra Window deformasjon nedtrekksmenyen. Velg Gaussian 2 * 3-punkts metoden for sub-pixel forskyvning estimering.
- Velg "Analyser!" fra Analyse-menyen, og bruk knappen "Analyze alle rammer" for å begynne en analyse.
- For etterbehandling velg "Vector validering" fra "; Post behandling "-menyen og sette standardavvik (stdav) filter terskelen til 7 og gjelder for alle rammer.
- Velg "Utled parametere / endre data" fra "Plot" -menyen. Velg "vektorer [px / ramme]" fra rullegardinmenyen. Juster glatthet av vektorer og høy pass filter og gjelder for alle rammer.
- For å beregne gjennomsnitts vektorer av alle rammer, satt de "Brukte frames" til en: enden og klikk på "Beregn gjennomsnitts vektorer" -knappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å bruke protokoller 2, 3 og 4, time-lapse avbildning av gonadene i villtype C. elegans voksne er utført (stamme OD58 (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), uttrykker en membran markør fra en kimlinje promoter ). Med fokus på begynnelsen av gonade er en 3D-modell av kjønnsceller generert fra mikroskopi data (figur 2). Denne modellen gjør det mulig å analysere endringer i cellestørrelsen, mens cellene transitt danner den distale til den proksimale arm, viser organiseringen av rachis og størrelsen av kontaktene i enkeltceller til rachis (se også http: //www.wormatlas. org / hermafroditt / bakterie% 20line / Germframeset.html).
Neste, protokoller 1, 3 og 5 brukes til å utføre langsiktig time-lapse mikroskopi av C. elegans embryoer (stamme CHP52 som er en krysning av belastning RW10226 (UNC-119 (ED3) III; itIs37 [pie-1p :: mCherry :: H2B :: pie-en 3'UTR + unc-119 (+)]; stIs10226 [hans-72 promoterHIS-24 :: mCherry translasjonelle fusjons med la-858 3 'UTR + unc-119 (+)]) og stamme LP162 (nmy-2 (cp13 [nmy-2 :: GFP + loxP]) I.). I denne stamme er det mulig å følge begge kjerner (gjennom mCherry-histon-fusjonsproteiner) og celledelings restene (gjennom genomisk modifiserte ikke-muskel myosin II locus hvor et GFP har blitt integrert i rammen gjennom CRISPR / Cas9 teknologi 19 ) samtidig ved hjelp av to-farge time-lapse mikroskopi (figur 3, venstre panel). Modellene som oppnås ved lineaging av begge strukturer i Endrov viser den tidligere beskrevne konvensjon mønster av celledeling rest arv 13,14. Videre, fra lineaging data, sporene for hver celle og celledeling rest (figur 3, høyre panel), og tidspunktet for celledeling rest persistens (basert på nmy-2 GFP -signal) samt korrelasjon til cellen divisjon timing kan skaffes (<strong> Figur 4, vist for Aba avstamning only). Ved bruk av en plasmamembran markør i tillegg, er det også mulig å observere tidspunktet for celledelingen rest internalisering.
Til slutt, ved hjelp av protokoller 1, 3 og 6, kortsiktig time-lapse mikroskopi med høy tidsoppløsning (5s intervaller mellom å spille inn et z-stack) av kortikal ikke-muskel myosin II (nmy-2 GFP) er utført. Fokuset her ligger på forskjellene i dynamikken i kortikale polariserende flyt ved å sammenligne denne flyten mellom villtype og embryoer RNAi-utarmet for Rho GTPase aktiverer protein RGA-3 20,21. I likhet med nylige observasjoner 22, strømme i villtype-embryoer er hovedsakelig langs lengdeaksen av embryoet (figur 5, venstre panel), mens strømningen i RGA-3 RNAi embryo er vinkelrett på denne aksen. Dette er lett synlig fra overliggende påfølgende tidspunkter eller fra PIV analyser (figur 5, nedre paneler).
For å observere disse forskjeller, er det viktig å velge en samplingsintervallet slik at kortikale strømnings partikler kan løses entydig for nøyaktig tolkning av data. Mindre tidsintervaller (≤5 sek) anbefales for å unngå store bevegelser og manglende vektorer. Utspørrings vinduet skal være stor nok til størrelsen av partiklene som skal analyseres (cortical granuler). Overlappingen mellom naboutspørrings vinduene gjør det mulig å redusere avstanden mellom vektoren og således øker antallet vektorer i nettet.
Figur 1. Montere en munn pipette Venstre. Deler som kreves for å sette sammen en munn pipette med filter. Høyre:. Den sammensatte pipette VennligstKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. En 3D-modell av gonade turn region Øverst til venstre:. 3D projeksjon av et enkelt tidspunkt fra time-lapse mikros data. Øverst i midten og til høyre: 3D-modeller av mikroskopi data. Bunn:. Detaljer om celle-rachis kontakter Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sporing av kjerner og celledeling restene Venstre. 3D anslag fra time-lapse mikros data. Midten: Snapshots av modellen hentet fra sporing begge kjerner (fargede kuler) og celledeling rester (grå kuler). Høyre: Snapshotsfra celledeling rest sporing. Banene for restene blir også vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Cell og celledeling rest linjene for Aba sublineage. Linjene fra en representant embryo blir vist. Celledelinger er merket med firkanter. Hvert merke tilsvarer 1 min. De celledeling restene ble oppkalt etter døtrene som oppstår fra divisjonen under som er blitt igjen er generert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Analyse av kortikal kontraktile strømnings med PIV-topp:. 3D projeksjonsstill time-lapse mikroskopi som viser start (første rad) og utgangen (andre rad) i tidsvinduet brukt til å beregne vektorfeltet med PIVlab. Den tredje raden viser overlapping av alle tidspunkter i tidsvinduet. Bunn:. Vector felt innhentet av PIVlab Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1 -. Relatert til figur 2. En 3D-modell av gonade turn regionen starter Videoen med å bla gjennom hele bunken med brukte å segmentere cellene flyene. Etterpå en 3D maksimal projeksjon av stabelen er vist, etterfulgt av 3D-modellen segementation roterer rundt x- og y-aksene (med og uten den segment gonade s rachis).
Video 2 - relatert til figur 3. Sporing av kjerner og celledeling rester Venstre: 3D-projeksjoner fra time-lapse mikros data.. Middle: Den fås fra sporing begge kjerner (fargede kuler) og celledeling rester (grå kuler) modell. Høyre: celledeling rester og deres baner. Scale bar = 10 mikrometer.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Video 3 - relatert til figur 5. Analyse av kortikal kontraktile flyt med PIV 3D maksimal projeksjon time-lapse opptak av en representant villtype og RGA-3 RNAi embryo brukes til å beregne vektorfelt med PIVlab Scale bar.. = 10 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gjennom objektsporings i utvikling, spesielt kjernesporing, har det vært mulig å klargjøre sentrale mønstrings mekanismer C. elegans embryogenese 1,23,24. Utvide denne strategien til høyere gjennomstrømning, har det nylig blitt mulig å avdekke flere mønstringsregler og å foreslå en metode for hvordan å utlede mønster regler de novo 10. For mange mutanter, men de nøyaktige mønstrings mangler er fortsatt ukjent. Metodene som beskrives her er verktøy som kan være medvirkende i sin forklaring. Viktigere, har det blitt tydelig de senere årene at selv om mange andre modellsystemer ikke følger en invariant utvikling som C. elegans, objekt sporing og analyse av det kvantitative sporingsdata er et viktig verktøy for å identifisere utviklingsmessige mekanismer og mekanismer for sykdom.
Metodene som vises her er spesielt godt egnet i den situasjonen hvor det enten ville være forutfordrende å gjennomføre mer komplekse og / eller egengenererte programvareløsninger, eller rett og slett for kostbart å gjennomføre kommersielle programvareverktøy, henholdsvis. Viktigere, verktøyene diskutert her aktiver forskeren å laste inn og analysere data uavhengig av hvilket instrument de har blitt registrert. Videre, hvis proprietær image oppkjøpet programvare brukes, gir ImageJ Bio-formater plugin som kan laste inn data i proprietære formater og lagre dem i standard formater (JPEG, TIFF).
Et kritisk trinn i alle protokoller som er avhengige av tidsforløp mikroskopi er å velge betingelsene på en riktig måte for å oppnå tilstrekkelig kontrast i mikroskopi bilder, og, på samme tid, for å redusere stråling til prøven. Dette er svært avhengig av type mikroskop som brukes, og det er generelt anbefalt å bruke raske skanning teknikker som spinning disk eller enkelt plan belysning mikroskopi. Spesielt for PIV av kortikale dynamikk, eldre versjoner av pek-skanningmikroskoper kan være for treg til å tillate fangst kortikale signaler på en tilstrekkelig oppløsning og hastighet for å utføre gyldige analyser. Det er derfor alltid viktig å nøye vurdere stråling og teste levedyktighet av prøven. I tillegg, selv om protokoller diskutert her bruke micobeads å montere embryoer, er det også mulig å anvende agarose pads, som bare tar litt mer tid til å fremstille, men er mindre kostbart og med litt erfaring like reproduserbar. Det bør imidlertid påpekes at kombinasjonen av agarose puten og nanobeads er overlegen metode for langvarig immobilisering av voksne ormer ettersom den unngår bruken av noe paralyserende middel, f.eks, levamisol.
Det bør påpekes at de verktøy som er omtalt her har sine begrensninger, da de ikke utfører fullt automatisert dataanalyse. Men for strukturer som celledeling rester, er det ofte vanskelig å identifisere en molekylær markør som bare sinneholder store mengder med denne strukturen, noe som er avgjørende for pålitelig sporing. En stor utfordring framover ligger derfor i blant annet funksjoner som maskinlæring og tilpasningsdyktig deteksjon / segmenteringsalgoritmer i lett-å-bruke og åpen tilgang til programvare som vi diskuterer her. Noen av disse funksjonene kan finnes i andre programvaremoduler, spesielt programvare som kan håndtere gjentatt sporing over lengre tidsintervaller, eller som kan sammenligne store sett med sporingsdata (f.eks StarryNite / AceTree 25 eller Nucleitracker4D 26, som er designet for å spore kjerner bruker histon-fusjonsproteiner eller spindler 27, eller Simi BioCell 28). Disse verktøyene kan være mer komplisert å gjennomføre når sikte på sporing av andre enn kjerner strukturer. Uavhengig av det spesielle strukturen som skal spores, disse programmene er generelt svært nyttig når store mengder bildedata vil bli analysert. Viktigere er det kompatibilitet mellom ovennevnte programvare modules.
Når det arbeides med andre modellsystemer (for eksempel, fly embryoer, pattedyr dyrkede celler, etc.), de fremgangsmåter som er presentert her er også godt egnet til å spore ortologe strukturer som beskrevet ovenfor. Enda viktigere, uavhengig av modellsystemet som undersøkes, forskjellige subcellulære strukturer, f.eks centrosomes, nucleoli, mikropartikler, vesikler, etc. lett kan spores, bare de innhentingsparametere må justeres for å sikre fullstendig fange av objekt spor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
