Отслеживание и Количественная процессов развития в<em> С. Элеганс</em> Использование инструментов с открытым кодом
Summary
Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.
Abstract
Количественно захвата процессы развития имеет решающее значение для получения механистической модели и ключ для идентификации и описания мутантных фенотипов. Здесь представлены протоколы для подготовки эмбрионов и взрослых С Элеганс животных для кратко- и долгосрочного покадровой микроскопии и методы для отслеживания и количественной оценки процессов развития. Методы, представленные основаны на С. штаммы Элеганс, доступные в Caenorhabditis генетический центр и на программное обеспечение с открытым исходным кодом, которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории независимо от системы, используемой микроскопии. Реконструкция модели сотового формы 3D с помощью моделирования программного обеспечения УПМ, руководство отслеживания флуоресцентно-меченых субклеточных структур с помощью программы анализа изображений многоцелевой Endrov и анализ корковой потока сократительной используя PIVlab (времяразрешенная Измерение скорости частиц изображения цифровой Инструмент для MATLAB) показаны. Это обсуждается, как эти способы могут быть развернуты тО количественном захватить другие процессы развития в различных моделях, например, отслеживания клеток и рода трассировки, отслеживание пузырьков потока.
Introduction
С стабильное улучшение флуоресцентных белков, генной инженерии, световой микроскопии и компьютерного программного и аппаратного обеспечения, теперь можно записать развитие многих организмов модели с беспрецедентной пространственно-временным разрешением. Это позволяет исследователям задавать вопросы, которые не могут быть рассмотрены ранее или вновь известные процессы развития в целях поиска недооцененных аспектов. Этот прогресс вызвал поле количественного биологии развития, которая направлена на преобразование качественные, неформальные модели в количественных моделей по капитальному измерений и статистического анализа.
Отслеживание клетки и субклеточные структуры позволило вывести количественные модели эмбрионального развития, деятельности нервной системы, или клеточного деления 1-12. Отслеживая деление клеток остатки в начале развития C. Элеганс эмбрионов, мы могли недавно показали, что они следуют стереонабрали путь и составляют важный поляризационный факторы 13,14.
Здесь представлены протоколы, которые делают количественный биологии развития подходов доступны для неспециалистов. В центре внимания лежит на трех прямо вперед, свободно доступных инструментов, которые осуществимыми в любой лаборатории, имеющей доступ к стандартной конфокальной микроскопии и компьютеров. Они включают в себя протокол для создания 3D-клеточные формы, протокол для отслеживания деление клеток остатки, и протокол количественно описать динамику корковых актомиозин. Нематода C. Элеганс используется в качестве иллюстративного случае, однако, методы и средства, рассмотренные здесь, подходит для различных вопросов в других биологических моделей, например, культивируемые клетки, ткани эксплантатов, органоидам или сфероидов, других эмбрионов и т.д.
Вообще, некоторые из анализов, показанных здесь также может быть выполнена с помощью популярного инструмента ImageJ с открытым исходным кодом (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.HTML; или Фиджи, "включенные батареи" версию ImageJ, http://fiji.sc/Fiji~~HEAD=dobj), для которых многие плагины для различных количественного анализа доступны. Тем не менее, программы обсуждаются здесь предназначены для решения конкретных проблем.
Во-первых, УПМ, обработки изображения, моделирование и отображение люкс может быть использован для реконструкции 3D серийных срезов из электрона или световой микроскопии 15. УПМ также содержит инструменты для просмотра 3D-данные из любой ориентации. Во-вторых, Endrov, программа Java, предназначены для выполнения анализа изображения, обработку данных и аннотацию сетей или дорожек (среди прочих) на основе расширенной архитектуры плагина, с совместимостью плагина ImageJ 16. Она содержит более 140 операций обработки изображений и расширяемую пользовательский интерфейс, в котором модель и исходные данные отображаются отдельно. Ее исходный код можно найти на https://github.com/mahogny/Endrov. В-третьих, PIVlab, А МATLAB инструмент для изображения велосиметрии цифровой частиц, что позволяет пользователю количественно и качественно проанализировать поля течения частиц 17. Использование этой программы требует лицензии MATLAB, которая включает изображение Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab это программа, предназначенная для количественного описания потока. Он рассчитывает распределение скоростей, величины, вихря, расхождение или сдвига в течение пары изображений или серии. Для этого кросс-коррелирует небольшие участки изображения (называемые путевок "в разделе протокола) в пары изображений для получения наиболее вероятного перемещения частиц. Это кросс-корреляция дает корреляционную матрицу, который может быть проанализированы в домене пространства или частоты, используя либо прямой кросс-корреляции или быстрого преобразования Фурье (БПФ), соответственно.
Оборудование, используемое здесь является инвертированный микроскоп оснащен Нипкова ('') прядильной диска, на EMCCD, 488 и 561 нм стандарт твердое телолазеры, и 20x воздуха или 40x или 60x план / апохромат масляной или водной погружения целей. Тем не менее, это также возможно выполнить покадровой обработки с другими методами визуализации, например, точечно, line- или лист-сканирующей лазерной микроскопии на основе, многофотонной микроскопии, а также эпи-флуоресцентной микроскопии в сочетании с деконволюции или структурированным освещение. Преимущество использования системы Нипкова диска является чрезвычайно быстро захвата изображений, особенно если потоковый режим (непрерывное движение и сканирование объекта в измерении г) доступен. Кроме того, для улучшения разрешения, в 1,5 раза увеличительное удлинитель перед EMCCD могут быть использованы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Через объекта слежения в развитии, в частности ядерной слежения, стало возможным выяснить центральные механизмы формирования паттерна С. Элеганс эмбриогенеза 1,23,24. Расширение этой стратегии в более высокой пропускной способности, это было недавно можно раскрыть дополнител…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18×18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24×60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab – Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
