Abstract
Количественно захвата процессы развития имеет решающее значение для получения механистической модели и ключ для идентификации и описания мутантных фенотипов. Здесь представлены протоколы для подготовки эмбрионов и взрослых С Элеганс животных для кратко- и долгосрочного покадровой микроскопии и методы для отслеживания и количественной оценки процессов развития. Методы, представленные основаны на С. штаммы Элеганс, доступные в Caenorhabditis генетический центр и на программное обеспечение с открытым исходным кодом, которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории независимо от системы, используемой микроскопии. Реконструкция модели сотового формы 3D с помощью моделирования программного обеспечения УПМ, руководство отслеживания флуоресцентно-меченых субклеточных структур с помощью программы анализа изображений многоцелевой Endrov и анализ корковой потока сократительной используя PIVlab (времяразрешенная Измерение скорости частиц изображения цифровой Инструмент для MATLAB) показаны. Это обсуждается, как эти способы могут быть развернуты тО количественном захватить другие процессы развития в различных моделях, например, отслеживания клеток и рода трассировки, отслеживание пузырьков потока.
Introduction
С стабильное улучшение флуоресцентных белков, генной инженерии, световой микроскопии и компьютерного программного и аппаратного обеспечения, теперь можно записать развитие многих организмов модели с беспрецедентной пространственно-временным разрешением. Это позволяет исследователям задавать вопросы, которые не могут быть рассмотрены ранее или вновь известные процессы развития в целях поиска недооцененных аспектов. Этот прогресс вызвал поле количественного биологии развития, которая направлена на преобразование качественные, неформальные модели в количественных моделей по капитальному измерений и статистического анализа.
Отслеживание клетки и субклеточные структуры позволило вывести количественные модели эмбрионального развития, деятельности нервной системы, или клеточного деления 1-12. Отслеживая деление клеток остатки в начале развития C. Элеганс эмбрионов, мы могли недавно показали, что они следуют стереонабрали путь и составляют важный поляризационный факторы 13,14.
Здесь представлены протоколы, которые делают количественный биологии развития подходов доступны для неспециалистов. В центре внимания лежит на трех прямо вперед, свободно доступных инструментов, которые осуществимыми в любой лаборатории, имеющей доступ к стандартной конфокальной микроскопии и компьютеров. Они включают в себя протокол для создания 3D-клеточные формы, протокол для отслеживания деление клеток остатки, и протокол количественно описать динамику корковых актомиозин. Нематода C. Элеганс используется в качестве иллюстративного случае, однако, методы и средства, рассмотренные здесь, подходит для различных вопросов в других биологических моделей, например, культивируемые клетки, ткани эксплантатов, органоидам или сфероидов, других эмбрионов и т.д.
Вообще, некоторые из анализов, показанных здесь также может быть выполнена с помощью популярного инструмента ImageJ с открытым исходным кодом (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.HTML; или Фиджи, "включенные батареи" версию ImageJ, http://fiji.sc/Fiji~~HEAD=dobj), для которых многие плагины для различных количественного анализа доступны. Тем не менее, программы обсуждаются здесь предназначены для решения конкретных проблем.
Во-первых, УПМ, обработки изображения, моделирование и отображение люкс может быть использован для реконструкции 3D серийных срезов из электрона или световой микроскопии 15. УПМ также содержит инструменты для просмотра 3D-данные из любой ориентации. Во-вторых, Endrov, программа Java, предназначены для выполнения анализа изображения, обработку данных и аннотацию сетей или дорожек (среди прочих) на основе расширенной архитектуры плагина, с совместимостью плагина ImageJ 16. Она содержит более 140 операций обработки изображений и расширяемую пользовательский интерфейс, в котором модель и исходные данные отображаются отдельно. Ее исходный код можно найти на https://github.com/mahogny/Endrov. В-третьих, PIVlab, А МATLAB инструмент для изображения велосиметрии цифровой частиц, что позволяет пользователю количественно и качественно проанализировать поля течения частиц 17. Использование этой программы требует лицензии MATLAB, которая включает изображение Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab это программа, предназначенная для количественного описания потока. Он рассчитывает распределение скоростей, величины, вихря, расхождение или сдвига в течение пары изображений или серии. Для этого кросс-коррелирует небольшие участки изображения (называемые путевок "в разделе протокола) в пары изображений для получения наиболее вероятного перемещения частиц. Это кросс-корреляция дает корреляционную матрицу, который может быть проанализированы в домене пространства или частоты, используя либо прямой кросс-корреляции или быстрого преобразования Фурье (БПФ), соответственно.
Оборудование, используемое здесь является инвертированный микроскоп оснащен Нипкова ('') прядильной диска, на EMCCD, 488 и 561 нм стандарт твердое телолазеры, и 20x воздуха или 40x или 60x план / апохромат масляной или водной погружения целей. Тем не менее, это также возможно выполнить покадровой обработки с другими методами визуализации, например, точечно, line- или лист-сканирующей лазерной микроскопии на основе, многофотонной микроскопии, а также эпи-флуоресцентной микроскопии в сочетании с деконволюции или структурированным освещение. Преимущество использования системы Нипкова диска является чрезвычайно быстро захвата изображений, особенно если потоковый режим (непрерывное движение и сканирование объекта в измерении г) доступен. Кроме того, для улучшения разрешения, в 1,5 раза увеличительное удлинитель перед EMCCD могут быть использованы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление С Элеганс эмбрионов для Интерв микроскопии с использованием микрошариков
- Перевести беременных взрослых червей с помощью червя выбор (из платиновой проволоки) в каплю M9 буфера и отчистить бактерии сначала энергично агитировать, а затем передать каждый червь соседней капли M9 с помощью глаз плеть установленный на зубной Pick / пипетки или использовать острый стеклянный капилляр.
- Развести дисперсии, содержащей 20 мкм диаметром полистирольные шарики в 10 раз M9 буфера (1 л M9 буфер содержит 3 г КН 2 РО 4, 6 г Na 2 HPO 4, 5 г NaCl, и, после автоклавирования (20 мин, 120 ° С), добавить еще 1 мл раствора 1 М MgSO 4).
- Сделайте рот пипеткой из любого типа тонкого стеклянного капилляра (например, температура плавления капилляры или капилляры, используемые, чтобы вытащить инъекционных игл), грубо 0,5 м длинный кусок резины, силикона или подобного материала труб (в идеале), прозрачный 200 мклпипетки, крышка 200 мкл ПЦР-пробирку, гидрофобный фильтр для малых шприцев (например., 0.2-0.45 мкм размер пор и 15-50 мм в диаметре нейлон, тефлон или подобного материала фильтра а) и 1000 мкл пипетки , Этот тип рот пипеткой гарантирует, что ни биологический материал не может войти в контакт с экспериментатором.
- Сборка пипетку, вставив наконечник пипетки 200 мкл кончиком сначала в трубку и подключить его с крышкой трубки ПЦР, который имеет центральную перфорацию, что соответствует диаметру капилляра используется. Очень указал шило или препарат иглу можно использовать для генерации перфорации.
- Нарисуйте тонкую капиллярную и вставьте его в перфорации. Вставьте фильтр в другом конце трубки и вставьте наконечник пипетки на 1000 мкл, как рот кусок (Рисунок 1).
- Проанализируйте беременных взрослых червей, сокращая поперек на вульвы чистой бритвой или скальпелем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, многие эмбрионы будут электроннойxpulsed после резки. Однако, если в начале эмбрионы нужны, они иногда должны быть освобождены от туши с использованием плеть глаз или заостренный иглы. - Внесите одну каплю разбавленного полистирола борта дисперсии (~ 4 мкл) на 24x60 мм в покровного стекла и эмбрионов передачи в этой капли, используя рот пипеткой.
- Осторожно поместите небольшой (например, 18x18 или 20x20 мм) покрытие стекла сверху капли и убедитесь, что капля полностью распространяться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Падение также должны быть достаточно мала, чтобы не коснуться края небольшой покровного стекла. - Печать на гору с сжиженного вазелином. Добавить каплю иммерсионного масла на 24x60 мм крышка скольжения стороны и приступить к разделу "покадровой микроскопии.
2. Подготовка взрослых С Элеганс Животные для Покадровый микроскопии с использованием Nanobeads
ПРИМЕЧАНИЕ: В общем, протокол для монтажа взрослых животных является адаптацией протокола с реф. 18.С этим протоколом, то можно выполнить долгосрочную покадровой конфокальной микроскопии взрослых животных.
- Приготовьте 1,5% (вес / объем) раствора агарозы в буфере M9, кипения (1 мин, 100 ° С на водяной бане или микроволновой печи). Применение более высоких концентраций агарозы не рекомендуется, поскольку это может привести к экструзии кишечника и / или частей гонад.
- Придерживайтесь вниз 2-3 слоя ленты на двух микроскопа каждый. Поместите слайд без ленты между двумя горками с лентой.
- Использование пипетки и помещают одну каплю горячего раствора агарозы в центре средней слайда. Быстро установить другой слайд на капли так, что она поддерживается слоев ленты с каждой стороны. Это создаст круглые и плоские агар площадку около 10 мм диаметром.
- Поместите каплю раствора 100 нм шарик (неразбавленной, что 2,6% (вес / объем)) на площадку. Перевести 1-10 очищенных взрослых червей в капли с червячной выбор. Печать с 18x18 мм защитным стеклом и вазелин, как описано в Protocol 1.
3. Покадровый микроскопии
- Нанесите каплю иммерсионного масла на предметное стекло или бутерброд покровного стекла. Используйте светлого при малом увеличении (5x или 10x линзы), чтобы найти образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничить воздействие синего света как можно больше (в частности, для C. Элеганс эмбрионов), например, не использовать эпи-флуоресцентной микроскопии, чтобы найти / сосредоточиться образца, но вместо этого использовать светлого. - Перейдите на более высоком увеличении (40x или 60x цели), довести образец в фокусе (либо центральную плоскость или верхнее / нижнее самолеты образца, в зависимости от программного обеспечения, приобретения).
- Установите интервалы выборки до 30 самолетов в 1 мкм расстояния записываются все 1мин. В случае автоматизированной ху или хуг стадии доступно, несколько пятен могут быть записаны в одной сессии. Переключитесь на флуоресценции и снова проверьте фокусировку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь избегать использования высокой мощности лазера, а использовать немного дольше времени экспозициипри очень низких интенсивностей. Мера полученных изображений сразу, либо в программе захвата изображений или ImageJ, чтобы избежать насыщения, культур диапазоне динамика, а также означает, чрезмерного воздействия излучения. - Начало записи серии покадровой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы исключить артефакты анализа, начать с длинными (3-10 мин) промежутки времени между сканированием образца и постепенно увеличивать временной выборки для желаемых интервалов. Развивающие времени, а также конечные точки в обоих случаях должна быть похожа при выполнении статистического анализа. Кроме того, часто бывает необходимо оценить фототоксичности и Выживаемость. Таким образом, восстановить экземпляр с горы после долгосрочного покадровой микроскопии и проверить, продолжают ли они развиваться / живая.
4. Реконструкция 3D-модель сотового Shape с УПМ
ПРИМЕЧАНИЕ: программное обеспечение УПМ доступна на веб-странице IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/~~HEAD=pobj. Установка программного обеспечения описатьD там. При использовании ОС Windows, Unix, инструментарий должен быть установлен, который также можно найти в пакете на веб-странице IMOD. Кроме того, есть превосходно составлена 3dmod введение доступна на веб-странице IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html~~HEAD=pobj).
- Откройте оболочку Unix и введите в "ИМУ". Окно УПМ откроется. Выберите файл с необработанными данными (в идеале сложены TIF или аналогичных), из которых для генерации 3D-модель.
- Найдите низ и верх объектов в окне Зап помощью информационного окна (до и вниз прокрутка инструмента).
- Начните отслеживание клеточных очертания. Важно отметить, что гарантировать, что каждая ячейка является одним объектом. Начните с верхней плоскостью каждой ячейке и создать первый контур там с помощью информационного окна. Прокрутите г и создать новый контур для каждого г-плоскости.
- Сделайте то же самое для, как многие клетки, как нужно моделировать в 3D. Не забудьте создать новый объект, когда, начиная с новой ячейки.
NПРИМЕЧАНИЕ: Есть много разных способов для отслеживания контура и нескольких полезных плагинов. Пожалуйста, посетите веб-страницу ИМУ и электронные учебники для деталей. В случае, показанном здесь, был использован по умолчанию. - Откройте окно "Модель" Просмотр инспектировать объекты и их контуры.
- В "Модель" панели инструментов View выберите "Edit" - "объекты". Соответствующее окно редактирования откроется.
- Для моделирования клеток, заполненных как и закрытых объектов, выберите "Mesh", как "Draw Тип данных" и "Fill", как "стиль рисования". Нажмите на кнопку "цепляя" в прокрутки выбора в левом нижнем углу окна. Проверьте опцию "шапка" в выборе справа внизу. Проверьте, как много объектов, как необходимо и нажмите "Сетка всех». Программа будет генерировать твердые предметы из штабеля контуров. Z-выборки фактор может регулироваться изменением "Z-шкалу» в окне «Вид».
- Переместить / вращать 3D объективистскиет ("Редактировать" - "Просмотр") и сохранять снимки или видео ("Файл" - "Привязка Tiff как ..." или "Кино / Монтаж").
5. Отслеживание флуоресцентно меченных структуры с Endrov
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы отслеживать деление клеток остатки, использовать штамм с ядерной или плазматической мембраны маркера для идентификации клеток (например, H2B, PH-PLC-d1) и деления клеток остатка маркера (например, NMY-2, ZEN-4 ). Ядерная мембрана или плазма маркер важно определить, какая ячейка наследует деление клеток остаток.
- Для быстрой загрузки и простоту использования, исходные данные должны быть преобразованы в файл формата (например, в ImageJ). Далее, открытая Endrov и загрузите файл для анализа, выбрав опцию "Загрузить файл" в меню файла. Нажмите на иконку "2D просмотра" на панели инструментов.
- Отрегулируйте гистограмму, нажав на значок "Установить диапазон" (синий значок в правом нижнем углуэкрана Endrov). Установите XYZ-разрешение, перейдя в "Data" - "имя файла" - "ImageSet" - "Канал" - "Установить XYZ-разрешение". Введите значения для X, Y, Z и, например, 5, 5, 1, если X и Y разрешение 0,2 мкм и попробовать каждый 1 мкм в Z.
- Для комментирования ядра, двигаться к плоскости интересов и нажмите на кнопку "2D зрителя". Выберите "Lineage" из выпадающего меню и выберите "Новый род».
- По перетаскивая на ядре, он может быть отмечен. Чтобы назвать ядро, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Переименовать частицу" из выпадающего меню. Чтобы увеличить или уменьшить диаметр круга, перетащите значок со стрелкой, который появляется слева от отмеченного круга. Чтобы отметить центральную плоскость ядра, нажмите на правый значок. При использовании плазматической мембране маркер, большой сферы могут быть сделаны, которые будут покрыть большую часть клетки.
- Чтобы продолжить во времени и плоскости, выберите "Кадр" и "Z"Варианты на нижней панели инструментов. Пройдя к следующей точке времени, отрегулируйте положение и размер круга, что знаменует собой ядро соответственно. Повторите это, пока гусеничных клетка делится.
- Когда есть деление клеток, отмечают дочерних ядер и перейти к "Lineage зрителя". Это может быть выбран, нажав на иконку "Windows" на верхней панели. Отметить все три ядра одновременно, перейдите к опции «Lineage» в верхней панели инструментов и выберите «ассоциированным родителя».
- Когда отслеживание сотового закончена, включите канал, посвященной деление клеток остаток для отслеживания. Для переключения каналов, нажмите на имя файла в нижнем левом углу панели инструментов. Разделение клеток остаток (или любой другой структуры) могут быть отслежены, как описано выше для ядра.
- При возвращении с программным обеспечением после закрытия, необходимо перейти по "2D Viewer" - "Lineage" - "Изменить" и нажмите на номер клонов, которые будут редакцией.
6. Анализируя кортикальной актомиозин Flow с PIVlab
ПРИМЕЧАНИЕ: PIVlab является свободно доступное программное обеспечение с: http://pivlab.blogspot.de/; он может быть вызван из командной строки среды Matlab, набрав PIVlab_GUI. При работе с PIVlab, рекомендуется сохранить серию изображений в отдельную папку.
- Начать новую сессию меню "Файл". Загрузите файлы изображений, нажав кнопку "Load Images".
- Выберите стиль секвенирования 1-2, 2-3, ... и перейдите в каталог, который содержит последовательность требуемых изображений. Выберите изображения и нажмите на кнопку "Добавить" и импорта.
- Перейти к "Настройки Анализы" и выберите "Исключения (ROI, маска)". В качестве альтернативы, нажмите кнопку "Ctrl + E". Используйте кнопку "Draw маска (ы) для текущего кадра", чтобы инактивировать нежелательные части изображения / с (то есть, площадь вне эмбриона).
- Выберите "Настройки PIV" FRом меню "Анализы настройки". В качестве альтернативы, нажмите кнопку "Ctrl + S". Выберите "БПФ окна деформации" в качестве желаемого алгоритма PIV.
Примечание: быстрого преобразования Фурье (БПФ) уменьшает вычислительные затраты, но рекомендуется только сигнал значительно выше шума и если смещение частиц исследуемых не превышает половину площади прохода проанализированы (см 6.5). - Введите следующие значения для трех проходов, которые являются областью допроса для перекрестной корреляции между интенсивностью последующих изображений: Шаг 1: опрос площадь 64 пикселей с шагом 32. Пасс 2: опрос площадью 32 пикселей с шагом 16 . Выберите «линейный» от деформации окна выпадающего меню. Выберите метод Гаусса 2 * 3-точка для оценки суб-пикселей смещения.
- Выберите "Анализ"! от анализа меню и использовать кнопку "Анализ все кадры", чтобы начать анализ.
- Для постобработки выберите "ВЭП" от "; Обработка меню Сообщение "и установите стандартное отклонение (Stdev) порог фильтра 7 и применять ко всем кадрам.
- Выберите "Вывести параметры / изменять данные" из меню "Участок". Выберите "векторов [PX / кадр]" из выпадающего меню. Отрегулируйте плавность векторов и фильтр высоких частот и применять ко всем кадрам.
- Для расчета средних векторов всех кадров, установите "использованное кадров" до 1: конец и нажмите на кнопку "Рассчитать средние векторы".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При использовании протоколов 2, 3 и 4, покадровой визуализации половых желез в дикого типа C. Элеганс взрослых осуществляется (штамм OD58 (UNC-119 (ed3) III; ltIs38 [pAA1; пирог-1 :: GFP :: РН (PLC1delta1) + UNC-119 (+)]), выражая мембранный маркер из зародышевой линии промоутер ). Сосредоточение внимания на рубеже гонады, 3D модель зародышевых клеток формируется из данных микроскопии (рис 2). Эта модель позволяет анализировать изменения в размер ячейки в то время как транзит клетки формируют дальнем к ближнему руку, показывает организацию рахиса и размер контактов отдельных клеток к рахиса (см также HTTP: //www.wormatlas. орг / гермафродит / зародыш% 20line / Germframeset.html).
Далее, протоколы 1, 3 и 5 используются для выполнения долгосрочного покадровой микроскопии C. Элеганс эмбрионов (штамм CHP52 который является крест деформации RW10226 (UNC-119 (ed3) III; itIs37 [пирог-1P :: mCherry :: H2B :: пирог-1 3'UTR + UNC-119 (+)]; stIs10226 [его промоутер-72HIS-24 :: mCherry поступательное слияние с LET-858 3 'UTR + UNC-119 (+)]) и штамм LP162 (NMY-2 (cp13 [Nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). В этом деформации, можно следовать оба ядра (через mCherry-гистонов слитых белков) и деление клеток остатки (через genomically модифицированной немышечный миозина II локуса, где GFP был интегрирован в рамке через CRISPR / технологии Cas9 19 ) одновременно при использовании двухцветной покадровой микроскопии (рис 3, оставленные панели). Модели, полученные lineaging обеих структур в Endrov показать, описанный ранее стереотипные картины деления клеток остатка наследования 13,14. Кроме того, по данным lineaging, дорожек для каждой ячейки и деление клеток остатка (рис 3, правая панели) и время деления клеток остатка настойчивости (на основе NMY-2 GFP -СИГНАЛ), а также корреляции в клетку разделение времени могут быть получены (<сильный> Рисунок 4, показано только для ABA линии). При использовании плазматической мембране маркер Кроме того, также можно наблюдать момент времени клеточного деления остатка интернализации.
Наконец, с помощью протоколов 1, 3 и 6, краткосрочный покадровой микроскопии с высоким временным разрешением (5S промежутках между записью г-стек) корковых немышечный миозина II (NMY-2 GFP) выполняется. В центре внимания здесь находится на различиях в динамике корковой поляризационного потока путем сравнения этот поток между дикого типа и эмбрионов РНК-интерференции истощенных за Ро GTPase белка, активирующего РГА-3 20,21. Подобно последним наблюдениям 22, текут в эмбрионах дикого типа преимущественно вдоль длинной оси зародыша (рисунка 5, слева панели), а поток в RGA-3 RNAi эмбриона ортогональна к этой оси. Это очевидными из наложения последовательных моментов времени или от PIV Analysэто (фиг.5, нижние панели).
Для наблюдения этих различий, важно выбрать интервал выборки, так что частицы коры потока может быть решена однозначно для точной интерпретации данных. Интервалы Меньше времени (≤5 сек) рекомендуется избегать больших перемещений и пропавших без вести векторов. Окно опроса должен быть достаточно большим, чтобы вместить размер частиц, которые будут проанализированы (кортикальных гранул). Перекрытие между соседними допроса окон позволяет сократить расстояние вектор и тем самым увеличивает количество векторов в сетке.
Рисунок 1. Сборка рот пипеткой Слева:. Части, необходимые для сборки рот пипеткой с фильтром. Справа:. Собранный пипетки ПожалуйстаНажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. 3D-модель гонад очередь регионе Вверху слева:. 3D проекция одной точке времени от данных микроскопии покадровой. Топ средняя и правая: 3D модели данных микроскопии. Внизу:. Подробная информация о сотовой Рахис контактов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Отслеживание ядер и деления клеток остатки Слева: 3D-проекции. По данным микроскопии покадровой. Средний: Снимки модели, полученной от отслеживания оба ядра (цветные сферы) и деление клеток остатки (серые сферы). Справа: Снимкиот клеточного деления остатка слежения. Пути для остатков также показаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Сотовые и деление клеток реликтовые клоны для ABA sublineage. Линий от представителя эмбриона показаны. Сотовые подразделения отмечены квадратами. Каждый галочка соответствует 1 мин. Деление клетки остатки были названы в честь дочерей, которые возникают от разделения, в течение которого остаток генерируется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Анализ потока корковой сократительной с PIV Top: 3D проекции. Кадры из покадровой микроскопии, что изобразить начало (первый ряд) и конец (вторая строка) временного окна, используемой для расчета векторное поле с PIVlab. Третий ряд панелей показывает наложение всех временных точках временного окна. Внизу:. Векторные поля, полученные PIVlab Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1 -., Связанные с Рисунок 2. 3D-модель разворота области гонад Видео начинается с прокруткой по всей пачки плоскостей, используемых для сегмента клетки. Впоследствии 3D максимальный выступ стек Показано, после чего 3D модели segementation вращающегося вокруг осей х и у (с и без позвоночного столба сегментированного гонад в).
Видео 2 - связаны с Рисунок 3. Отслеживание ядер и деления клеток остатки Слева: 3D проекции по данным микроскопии покадровой.. Средний: Полученный от отслеживания оба ядра (цветные сферы) и деление клеток остатки (серые сферы) модель. Справа: Деление клеток остатки и их траектории. Масштабная линейка = 10 мкм.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Видео 3 - связаны с Рисунок 5. Анализ потока корковой сократительной с PIV 3D максимальный выступ покадровой записи представительного дикого типа и РГА-3 РНК-интерференции эмбриона, используемой для расчета векторное поле с PIVlab бар Scale.. = 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Через объекта слежения в развитии, в частности ядерной слежения, стало возможным выяснить центральные механизмы формирования паттерна С. Элеганс эмбриогенеза 1,23,24. Расширение этой стратегии в более высокой пропускной способности, это было недавно можно раскрыть дополнительные правила паттерна и предложить метод, как вывести паттерна правила заново 10. Для многих мутантов, однако, точные дефекты паттерна до сих пор неизвестны. Методы, описанные здесь, являются инструментами, которые могут играть важную роль в их выяснения. Важно отметить, что это стало ясно в последние годы, что, хотя многие другие модели системы не следовать инвариантной развитие как С. Элеганс, отслеживание и анализ количественных данных отслеживания объекта является важным инструментом для определения механизмов развития и механизмы болезни.
Способы, описываемые здесь, особенно хорошо подходят в ситуации, когда она будет либо слишкомсложной для реализации более сложных и / или самостоятельно созданных программных решений, или просто слишком дорого для реализации коммерческих программных средств, соответственно. Важно отметить, что инструменты, рассмотренные здесь позволяет исследователю загрузить и анализировать любые данные, независимо от какой инструмент они были записаны. Кроме того, если используется проприетарное программное обеспечение получения изображений, ImageJ обеспечивает плагин Био-форматы, которые могут загружать данные в проприетарных форматов и сохранять их в стандартных форматах (JPEG, TIFF).
Важным шагом в всех протоколов, которые полагаются на время покадровой микроскопии выбрать условия право на получение достаточного контраста в микроскопии изображений, и, в то же время, чтобы уменьшить лучевую нагрузку на образце. Это в значительной степени зависит от типа микроскопа используются и как правило, рекомендуется использовать быстрые методы сканирования, такие как вращающийся диск или одной плоскости освещения микроскопии. В частности, для PIV корковых динамики, более старых версий точечного сканированиямикроскопы может быть слишком медленным, чтобы захватить корковых сигналы на достаточном разрешении и скорости выполнения действительные анализы. Поэтому всегда важно тщательно оценить лучевую и проверить жизнеспособность образца. Кроме того, хотя протоколы обсуждаемые здесь, используют micobeads смонтировать эмбрионов, это также можно использовать агарозные колодки, которые займет немного больше времени, чтобы подготовиться, но дешевле и с некоторым опытом в равной степени воспроизводимым. Тем не менее, следует отметить, что сочетание агарозном площадку и nanobeads является превосходным методом для долгосрочного иммобилизации взрослых червей, так как это позволяет избежать использования любого агента парализующим, например левамизол.
Следует отметить, что инструменты, рассмотренные здесь, имеют свои ограничения, поскольку они не выполняют полностью автоматизированный анализ данных. Тем не менее, для структур, таких как деления клеток остатков, часто сложные для идентификации молекулярного маркера, что только Sжит эту структуру, которая имеет решающее значение для надежного слежения. Поэтому Основной задачей будущего лежит в том числе функции, такие как машинного обучения и алгоритмов обнаружения адаптационных / сегментации в легкой в использовании программного обеспечения с открытым доступом, что мы обсуждаем здесь. Некоторые из этих функций можно найти в других программных модулей, в частности программного обеспечения, которые могут справиться с повторным отслеживания в течение более длительных интервалов времени, или что может сравниться больших наборов данных слежения (например, StarryNite / AceTree 25 или Nucleitracker4D 26, которые предназначены для трек ядер, используя белки гистона-фьюжн или шпинделей 27, или Сими BioCell 28). Эти инструменты могут быть более сложными для реализации, когда направленный на отслеживание других, чем ядер структур. Несмотря на конкретной структуры, которые должны быть отслежены, эти программы, как правило, очень полезно, когда будут проанализированы большие объемы данных изображения. Важно то, что совместимость между вышеупомянутой модулем программного обеспеченияES.
При работе с другими модельных системах (например, летать эмбрионов, млекопитающих культивируемые клетки и т.д.), методы, представленные здесь, также хорошо подходят для отслеживания ортологичные структуры, как описано выше. Что еще более важно, независимо от модели исследуемой системы, различных субклеточных структур, например, центросомах, ядрышек, микрочастицы, пузырьки и т.д., могут быть легко отслеживаются, только параметры сбора должны быть скорректированы, чтобы обеспечить полное захват объектов треков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
