Analisi Funzionale complementazione (FCA): Un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche Pathways
Summary
La convalida delle attività enzimatiche coinvolte in processi biochimici può essere chiarita utilizzando l'analisi complementazione funzionale (FCA). Descritto in questo manoscritto è il saggio FCA dimostrare l'attività enzimatica degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli amminoacidi, risposta stringente batterica e batterica biosintesi peptidoglicano.
Abstract
Saggio complementazione funzionale (FCA) è un test in vivo che è ampiamente utilizzato per chiarire la funzione / ruolo dei geni / enzimi. Questa tecnica è molto comune in biochimica, genetica e molte altre discipline. Una panoramica completa della tecnica per integrare l'insegnamento delle vie biochimiche inerenti agli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta stringente batterica è riportato in questo manoscritto. Due cDNAs dalla pianta modello thaliana organismo Arabidopsis che sono coinvolti nel metabolismo della lisina (L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL) e tirosina aminotransferasi (tyrB) coinvolti nel metabolismo di tirosina e fenilalanina sono evidenziate. Inoltre, il peptidoglicano batterico pathway anabolizzante è evidenziato attraverso l'analisi del -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (MURE) gene UDP N dal batterio Verrucomicrobium spinosum coinvolti nella croce-libreria di peptidoglicano. La risposta stringente batterica è riportato anche attraverso l'analisi del rsh (R ELA / s pot h Omolog) gene bifunzionale responsabile di un fenotipo iper-mucoide nel sp batterio Novosphingobium. Quattro esempi di FCA sono presentati. Nel video si concentrerà su tre di loro, vale a dire lisina, peptidoglicano e la risposta stringente.
Introduction
complementazione funzionale nel contesto di chiarire la funzione (s) / ruolo (s) di un gene viene definita come la capacità di un particolare omologo o gene orthologous ripristinare un particolare mutante con un fenotipo osservabile allo stato wild-type quando l'omologa o gene orthologous è introdotto in cis o trans in secondo piano mutante. Questa tecnica è stata ampiamente usata per isolare e identificare la funzione (s) / ruolo (s) di molti geni. Un esempio particolare è l'isolamento e l'identificazione di orotidina-5-fosfato decarbossilasi da Candida albicans utilizzando il mutante URA3 di S. cerevisiae e il mutante pyrF di E. coli. 1 Gli autori hanno usato questa tecnica per chiarire la funzione dei geni che sono coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta rigorosi nei loro programmi di ricerca e hanno incorporato questa tecnica nei loro programmi di insegnamento in Biotechnology e Bioscience Molecolare (BMB) programma al Rochester Institute of Technology (RIT).
Gli autori insegnano Fondamenti di Biochimica delle piante / Pathology (FPBP) (Hudson) e Bioseparations: principi e le pratiche (BPP) (Hudson / Savka), due corsi di base di divisione superiore di laboratorio elettiva nel programma BMB al RIT. Dal momento che alcuni degli argomenti che vengono discussi nei corsi sono affiliati con i loro interessi di ricerca, gli autori hanno incorporato molte delle tecniche e strumenti sperimentali che vengono utilizzati nei rispettivi programmi di ricerca in questi due corsi di laboratorio-based. Un esempio è complementazione funzionale come un esercizio di laboratorio per rinforzare i materiali delle lezioni relative al metabolismo degli aminoacidi da piante, peptidoglicano e la stringente metabolismo risposta da batteri.
Tre dei percorsi di aminoacidi dalle piante che sono discussi nel corso FPBB sono quello della lisina (LYS), la tirosina(Tyr) e fenilalanina (phe). Il percorso lys è evidenziata in corso per l'importanza degli aminoacidi come un amminoacido essenziale per tutti gli animali in particolare gli esseri umani poiché gli animali non hanno la macchina genetica di sintetizzare lys de novo. Inoltre, è stato recentemente scoperto che le piante utilizzano un percorso per la sintesi di lys che è significativamente diversa da quella dei batteri. Questa scoperta è stata parzialmente facilitato da complementazione funzionale del E. coli diaminopimelate (DAP) mutanti utilizzando un gene che codifica l'enzima L, L-diaminopimelate aminotransferasi (DapL) dalla pianta modello Arabidopsis thaliana. 2 I percorsi varianti per la sintesi del lys attraverso la diaminopimelate intermedi sono mostrati in Figura 1. Oltre , la sintesi di lys facilita attraverso l'aspartato derivato famiglia di amminoacidi che è altamente regolata. 3 Oltre alla loro importanza in synt proteineESI, i percorsi per tyr e phe sono evidenziate data la loro importanza nel servire come composti precursori per l'anabolismo di composti fenilpropanoidi prevede la sintesi di composti difesa delle piante quali:. alcaloidi, lignine, flavonoidi, isoflavoni, acido idrossicinnamico tra gli altri 4 Il tyr e percorsi phe sono state evidenziate anche per mostrare la differenza tra l'impianto e percorsi di anabolizzanti batteriche. Nei batteri, l'aminotransferasi tirosina (TyrB) è coinvolto nella anabolismo dei due amminoacidi, che nelle piante, l'enzima è principalmente coinvolto nel catabolismo di tyr e phe e non è coinvolta nella anabolismo di questi aminoacidi. (Figura 2). 4
Le differenze tra Gram positivi e Gram negativi per quanto riguarda la struttura del peptidoglicano (PG) sono evidenziati nel corso FPBP. Il PG dei batteri Gram negativi è di interesse rispetto patologia vegetale in base al fatto che la maggior partepatogeni delle piante sono Gram negativi. Una recente revisione per quanto riguarda i primi 10 batteriche fito-patogeni ha rivelato che tutti sono Gram-negativi. I batteri erano dalla generi:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya e Pectobacterium 5 Una delle differenze chimiche confrontando lo stelo PG di batteri Gram positivi negativi e Gram è la differenza tra la reticolazione amminico acidi di entrambi i tipi. Il primo scatto di tale diverso reticolazione PG si verifica nella fase citoplasmatica di PG anabolismo ed è facilitata dall'enzima UDP N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (mûre) (Figura 3A). Mure catalizza l'aggiunta di un particolare composto diammina in terza posizione dell'asta peptide. 6 Nella maggior parte dei batteri Gram negativi, i lys penultimo precursore, meso -diaminopimelate ( <em> m -DAP) funge reticolazione aminoacidi e lys serve lo stesso ruolo nel PG della maggior parte dei batteri Gram-positivi (Figura 3B). 7 Questo è dovuto al fatto che sia m -DAP e lys possiedono due ammina gruppi e sono in grado di formare due legami peptidici per stelo peptide cross-linking.
Nei Bioseparations: Principles and Practices corso (BPP), le differenze tra i sistemi aperti e chiusi per la coltivazione di batteri e come nutriente livelli cambierà in modo significativo in entrambi i sistemi a causa di cambiamenti ambientali sono discussi. Questi eventi sono legati a cambiamenti normativi chiamato "spostamento verso il basso" o "Shift up" attivati da fame o un adeguato apporto di aminoacidi o di energia. La risposta "scalare" può verificarsi quando una coltura batterica viene trasferito da un supporto ricco e complesso ad un mezzo chimicamente definito con una singola fonte di carbonio. Questo cambiamento nell'ambiente porta alla rapida Cessazione della sintesi tRNA e rRNA. Questa cessazione comporta la mancanza di ribosomi, proteine e la sintesi del DNA, anche se la biosintesi degli amminoacidi sono upregulated.
Dopo la risposta "scalare", i ribosomi esistenti siano utilizzati per produrre nuovi enzimi per sintetizzare gli amminoacidi non disponibili a medio o ambiente. Dopo un periodo di tempo, la sintesi rRNA e nuovi ribosomi sono assemblati e la popolazione di cellule batteriche comincia a crescere anche se ad un tasso ridotto. Il corso degli eventi è denominata "risposta stringente" o "controllo rigoroso" ed è un esempio di regolazione cellulare globale e può essere pensato come un meccanismo per la regolazione macchine biosintetica della cellula per compensare la disponibilità dei substrati necessari e fabbisogno energetico . 8 la risposta rigorosa consente quindi di batteri di rispondere rapidamente ai flussi di nutrienti nell'ambiente e contribuisce e ENHANCES la capacità dei batteri di competere in ambienti che possono cambiare rapidamente quanto riguarda nutrienti eo disponibilità di substrato. 8-9
La risposta stringente ha un ruolo fondamentale nel espressione genica quando la disponibilità di aminoacidi, carbonio, azoto, fosfato e acidi grassi sono limitati. 8,10-14 Questa risposta stringente è coordinata da due nucleotidi, guanosina tetrafosfato (ppGpp) e guanosina pentafosfato (pppGpp) comunemente indicata insieme come il alarmone (p) ppGpp. Ad esempio, quando gli amminoacidi sono limitati-che può portare ad un collo di bottiglia di proteine sintesi-la alarmone, guanosina 3,5- (bis) pirofosfato (ppGpp), derivato da anabolismo di guanosina difosfato 3-5-trifosfato (pppGpp) accumula nella cella. La variazione del livello di (p) ppGpp è coinvolto nella espressione dei geni che regolano la risposta a superare la mancanza di substrati per l'ambiente che sono direttamente coinvolti nella crescita cellulare e SVILUPPOt. Due dei geni che sono coinvolti in questo processo sono chiamati RELA e Spot. RelA è un (p) ppGpp sintetasi ribosoma-associata che è coinvolto nella risposta all'accumulo di tRNA caricate che è il risultato di limitazione aminoacidi. funzioni di punto come un bifunzionale (p) ppGpp sintetasi e idrolasi. L'attività sintetasi di spot è coinvolto nella risposta alla mancanza di carbonio e acido grasso inedia. 8 Le omologhi RelA / SPOT sono diffusi nelle piante e batteri e sono indicati come Rsh per R ELA / S pot h omologs. 8,10 -12,16 un recente manoscritto dimostrato che vi è una specifica proteina Rsh coinvolto nella sintesi di questi alarmones dal batterio Novosphingobium sp Rr 2-17. 17
Qui vi presentiamo quattro vie biochimiche impastoiati ai saggi di complementazione funzionale. I saggi di complementazione delineati in questo manoscritto fornisce una strada per explminerale di impiegare questo test in vivo come un mezzo per identificare e caratterizzare o enzimi che sono previsti ad avere funzione sconosciuta / putativa (s) o come strumenti didattici per integrare l'insegnamento di vie biochimiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molti dei corsi che sono parte integrante del Biotecnologie e Bioscienze molecolare curriculum presso il Rochester Institute of Technology hanno una componente di laboratorio in aggiunta alla quota lezione del corso. Il piano di studi per l'anno accademico 2014-2015 contiene un totale di 48 corsi, 29 dei quali contengono una componente di laboratorio che rappresentano circa il 60%. Un tale corso è Fondamenti di piante Biochimica e Patologia (FPBP), una conferenza / corso di laboratorio miscelati e Bioseparations: p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AOH e MAS riconosce il College of Science e Thomas H. Gosnell School of Life Sciences presso il Rochester Institute of Technology per il supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Stati Uniti National Science Foundation (NSF) premio a AOH MCB-1.120.541.
Materials
| E. coli mutants | Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/) | |
| Electroporator | Biorad-USA | 1652100 |
| Electroporation Cuvettes | Biorad-USA | 1652082 |
| Temperature controlled incubator | Generic | |
| Microcentrifuge | Generic | |
| Luria Agar | Thermofisher Scientific | 22700025 |
| Luria Broth | Thermofisher Scientific | 12795084 |
| M9 Medium | Sigma-Aldrich | 63011 |
| Potato Dextrose Medium | Fisher Scientfic | DF0013-15-8 |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K1377 |
| Diaminopimelate | Sigma-Aldrich | 92591 |
| Thymine | Sigma-Aldrich | T0376 |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 |
| Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 |
| Phenlylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 |
| Aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 |
| Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
| Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 |
| Gylcerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 |
| Tetracyline | Sigma-Aldrich | 87128 |
| Taq DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 10342-020 |
| Platinum pfx DNA polymerase | Thermofisher Scientific | 11708-013 |
| T4 DNA ligase | Thermofisher Scientific | 15224-041 |
| E coli Dh5-alpha | Thermofisher Scientific | 18258012 |
| E coli Top10 | Thermofisher Scientific | C4040-03 |
| pET100D/topo vector | Thermofisher Scientific | K100-01 |
| pCR2.1 Vector | Thermofisher Scientific | K2030-01 |
References
- Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5′-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
- Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
- Jander, G., Joshi, V., Last, R. L. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. , (2009).
- Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572 (2010).
- Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
- McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458 (2013).
- Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
- Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D., Neidhardt, F. C., Curtiss, R., Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
- Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
- Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
- Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D’Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
- Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
- Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
- Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183 (2012).
- Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
- Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439 (2011).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
- Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
- Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
- Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
- Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
- Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
- Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
- Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
- Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
- Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
- Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).
