Funksjonell Komplemente Analysis (FCA): En laboratoriearbeid designet og implementert for å supplere Opplæring i biokjemiske mekanismer

Summary

Valideringen av enzymatiske aktiviteter som er involvert i biokjemiske mekanismer kan belyses ved hjelp av funksjonell komplemente analyse (FCA). Er beskrevet i dette manuskriptet er den FCA-analysen viser den enzymatiske aktiviteten av enzymer involvert i metabolismen av aminosyrer, bakteriell strenge reaksjon og bakteriell peptidoglykan biosyntese.

Abstract

Funksjonell komplementering assay (FCA) er en in vivo-assay som er mye brukt for å belyse funksjonen / rollen til gener / enzymer. Denne teknikken er svært vanlig i biokjemi, genetikk og mange andre disipliner. En omfattende oversikt over teknikken for å supplere undervisningen av biokjemiske mekanismer knyttet til aminosyrer, peptidoglykan og bakteriell strengere reaksjon er rapportert i dette manuskriptet. To cDNA fra modell anlegg organisme Arabidopsis thaliana som er involvert i metabolismen av lysin (L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) og tyrosin aminotransferase (tyrB) som er involvert i metabolismen av tyrosin og fenylalanin er uthevet. I tillegg bakteriell peptidoglykan anabole veien er spesielt markert ved analyse av UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso-2,6-diaminopimelate ligase (Mure) genet fra bakterien Verrucomicrobium spinosum involvert i tver-linking av peptidoglykan. Bakterie strengere reaksjon er også rapportert gjennom analyse av rsh (r ELA / s POT h omolog) bifunksjonell genet er ansvarlig for en hyper-slimaktig fenotype i bakterien Novosphingobium sp. Fire eksempler på FCA presenteres. Videoen vil fokusere på tre av dem, nemlig lysin, peptidoglykan og strengere reaksjon.

Introduction

Funksjonell komplementering i sammenheng med å belyse funksjonen (e) / rolle (r) av et gen som er definert som evnen til en spesiell homologt eller ortologe gen for å gjenopprette en bestemt mutant med en fenotypen til villtype-tilstand når det homologe eller ortologe genet blir innført i cis eller trans til det mutante bakgrunnen. Denne teknikken har blitt mye brukt til å isolere og identifisere funksjonen (e) / rolle (r) av mange gener. Et spesielt eksempel er isolering og identifisering av orotidine-5-fosfat dekarboksylase fra Candida albicans ved hjelp av ura3-mutant av S. cerevisiae og pyrF mutant av E. coli. ¹ Forfatterne har brukt denne teknikken for å belyse funksjon av gener som er involvert i metabolismen av aminosyrer, peptidoglykan og strengere reaksjon i sine forskningsprogrammer og har innarbeidet denne teknikken i sine undervisningsopplegg i Biotechnology og molekylær biovitenskap (BMB) program ved Rochester Institute of Technology (RIT).

Forfatterne lære grunnleggende av Plant biokjemi / patologi (FPBP) (Hudson) og Bioseparations: Prinsipper og praksis (BPP) (Hudson / Savka), to øverste divisjon valgfag laboratoriebaserte kurs i BMB-programmet ved RIT. Siden noen av temaene som er omtalt i kursene er tilknyttet deres forskningsinteresser, har forfatterne tatt mange av de teknikker og eksperimentelle verktøy som brukes i sine respektive forskningsprogrammer i disse to laboratoriebaserte kurs. Et slikt eksempel er funksjonell komplementering som et laboratorium oppgave å forsterke kompen materialene knyttet til amino acid metabolism fra planter, peptidoglykan og den strenge responsen metabolismen fra bakterier.

Tre av aminosyre trasé fra planter som er omtalt i FPBB kurset er at av lysin (lys), tyrosin(Tyr) og fenylalanin (Phe). Den lys veien er markert i løpet på grunn av viktigheten av aminosyren som en essensiell aminosyre for alle dyr spesielt mennesker siden dyr mangler den genetiske maskineri for å syntetisere lys de novo. I tillegg ble det nylig oppdaget at planter anvender en vei for syntesen av lys som er vesentlig forskjellig fra det av bakterier. Dette funnet ble delvis tilrettelagt av funksjonell komplementering av E. coli diaminopimelate (DAP) mutanter ved hjelp av et gen som koder for enzymet L, L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) fra modellen planten Arabidopsis thaliana. ² varianten veier for syntese av lys gjennom det mellomliggende diaminopimelate er vist i figur 1. I tillegg , syntesen av lys letter gjennom aspartat avledet familie av aminosyrer som er sterkt regulert. ^3. i tillegg til deres viktighet i protein synthesis, trasé for Tyr og Phe er uthevet gitt deres betydning i å tjene som forløperforbindelser for anabolisme av styrene forbindelser involvert syntesen av planteforsvars forbindelser som:. alkaloider, lignins, flavonoider, isoflavonoids, hydroxycinnamic syre blant annet ^fire Tyr og Phe trasé er også uthevet for å vise forskjellen mellom anlegget og bakterie anabole veier. I bakterier, blir enzymet tyrosin aminotransferase (TyrB) som er involvert i den anabolisme av begge aminosyrer, mens det i planter, er enzymet primært involvert i nedbrytningen av Tyr og Phe, og er ikke involvert i den anabolisme av disse aminosyrer. (Figur 2). ⁴

Forskjellene mellom Gram positive og Gram negative bakterier om strukturen av peptidoglykan (PG) er uthevet i FPBP kurset. PG av Gram-negative bakterier er av interesse angående plantepatologi basert på det faktum at de flesteplantepatogener er Gram negative. En fersk vurdering av de 10 bakterie phyto-patogener avdekket at alle er Gram negative. Bakteriene var fra slektene:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya og Pectobacterium ⁵ En av de kjemiske forskjeller ved sammenligning av PG-stammen av Gram-negative og Gram-positive bakterier er differansen mellom tverrbindings amino- syrene med begge typer. Det første trinnet for den annen tverrbinding av PG forekommer i det cytoplasmatiske trinnet med PG anabolisme og lettes ved de enzym UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- meso-2,6-diaminopimelate ligase (Mure) (Figur 3A). Mure katalyserer tilsetningen av en bestemt diaminforbindelse i tredje posisjon av peptidet stammen. ⁶ I de fleste Gram-negative bakterier, nest siste lys forløper, meso -diaminopimelate ( <em> m -DAP) tjener som tverrbindings aminosyre og lys tjener samme rolle i PG for de fleste Gram-positive bakterier (figur 3B). ^7. Dette skyldes det faktum at både m -DAP og lys eie to amin grupper og er i stand til å danne to peptidbindinger for peptid stilk tverrbinding.

I Bioseparations: Principles and Practices (BPP) Selvfølgelig er forskjellene mellom åpne og lukkede systemer for dyrking av bakterier og hvordan nærings nivåer vil endre seg betydelig i begge systemer på grunn av miljøendringer diskutert. Disse hendelsene er knyttet til regulatoriske endringer som kalles en "gire ned" eller "gire opp" utløst av sult eller en tilstrekkelig tilførsel av aminosyrer eller energi. Den "gire ned" respons kan oppstå når en bakteriekultur overføres fra en rik og kompleks medium til et kjemisk definert medium med en enkelt karbonkilde. Denne endringen i miljøet fører til rask cessasjon av tRNA og rRNA syntese. Dette opphøret resulterer i mangel på ribosomer, protein og DNA-syntese, selv om biosyntesen av aminosyrer blir oppregulert.

Etter "gire ned" respons, er de eksisterende ribosomene som brukes til å fremstille nye enzymer for å syntetisere aminosyrene som ikke lenger er tilgjengelig i medium eller miljø. Etter en periode av tid, blir rRNA-syntesen og nye ribosomer montert og den populasjon av bakterieceller begynner å vokse selv om ved en redusert hastighet. Hendelsesforløpet er kalt "strenge reaksjon" eller "streng kontroll" og er et eksempel på global mobil forskriften, og kan betraktes som en mekanisme for å justere cellens biosyntetiske maskineri for å kompensere for tilgjengeligheten av de nødvendige underlag og energibehov . ⁸ strengere reaksjon gjør dermed bakterier å reagere raskt på fluks av næringsstoffer i miljøet og bidrar og ENHAnser evnen av bakterier for å konkurrere i miljøer som kan endre seg raskt med hensyn til næringsstoffer og eller substrat tilgjengelighet. ^8-9

Den strenge responsen har en vesentlig rolle i genekspresjon når tilgjengeligheten av aminosyrer, karbon, nitrogen, fosfat og fettsyrer er begrenset. ^8,10-14 Denne streng reaksjon er koordinert av to nukleotider, guanosin tetrafosfat (ppGpp) og guanosin pentaphosphate (pppGpp) ofte referert sammen som alarmone (p) ppGpp. Når for eksempel aminosyrer er begrenset, noe som kan føre til en flaskehals i proteinsyntese-the alarmone, guanosin 3,5- (bis) pyrofosfat (ppGpp), avledet fra anabolisme av guanosin 3-difosfat 5-trifosfat (pppGpp) akkumulerer i cellen. Endringen i (p) ppGpp nivå er involvert i ekspresjon av gener som regulerer responsen for å overvinne mangelen på substrater i miljøet som er direkte involvert i cellevekst og utvikling;t. To av gener som er involvert i denne prosessen kalles RELA og Spot. Rela er en ribosom-assosiert (p) ppGpp syntetase som er involvert i responsen til opphopning av uladede tRNA som er et resultat av aminosyren begrensning. Spot fungerer som en bifunksjonell (p) ppGpp syntetase og hydrolase. Den syntetase aktivitet av Spot er involvert i respons på mangel av karbon og fettsyre sult. ⁸ De RELA / sted homologer er utbredt i planter og bakterier og er referert til som Rsh for R ELA / S POT h omologs. ^{8,10 -12,16} en fersk manuskript viste at det er en spesifikk Rsh protein som er involvert i syntesen av disse alarmones fra bakterien Novosphingobium sp Rr 2-17. ¹⁷

Her presenterer vi fire biokjemiske mekanismer tjoret til de funksjonelle komplemente analyser. Komplemente analyser som er skissert i dette manuskriptet gir en vei å eksplmalm under anvendelse av denne in vivo-analyse som et middel for å identifisere og karakterisere eller enzymer som er forutsagt å ha ukjent / antatte funksjon (er) eller som læreverktøy for å supplere undervisningen av biokjemiske mekanismer.

Protocol

MERK: Forfatterne er villige til å gi bakteriestammer og rekombinante plasmider å lette inkorporering av funksjonell komplemente analyse for undervisningsformål for personer som er interessert. De plasmider som ble brukt for å lette funksjonelle komplemente eksperimenter er oppført i Tabell 1. 1. Bygging av plasmider for Funksjonell Komplemente Kloning av Diaminopimelate aminotransferase (dapL) for Funksjonell Komplemente. Forsterke dapL åpen lesera…

Representative Results

Bakteriestammene som er ansatt i de ulike funksjonelle komplemente analyser er oppført i tabell 2. Funksjonell komplemente analyse: L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) E. coli dobbel mutant AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) havner en mutasjon i dapE genet og en fullstendig sletting av DAPD genet (figur 1).</s…

Discussion

Mange av kursene som er en integrert del av bioteknologi og molekylær biovitenskap pensum ved Rochester Institute of Technology har et laboratorium komponent i tillegg til foredrag del av kurset. Læreplanen for studieåret 2014-2015 inneholder totalt 48 kurs, 29 av dem inneholder et laboratorium komponent som representerer ca 60%. Et slikt kurs er Fundamentals of Plant biokjemi og patologi (FPBP), en blandet forelesning / laboratoriekurset og Bioseparations: Prinsipper og praksis (BPP), et laboratorium basert kurs. </…

Materials

E. coli mutants	Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Electroporator	Biorad-USA	1652100
Electroporation Cuvettes	Biorad-USA	1652082
Temperature controlled incubator	Generic
Microcentrifuge	Generic
Luria Agar	Thermofisher Scientific	22700025
Luria Broth	Thermofisher Scientific	12795084
M9 Medium	Sigma-Aldrich	63011
Potato Dextrose Medium	Fisher Scientfic	DF0013-15-8
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminopimelate	Sigma-Aldrich	92591
Thymine	Sigma-Aldrich	T0376
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
Phenlylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartate	Sigma-Aldrich	A9256
Valine	Sigma-Aldrich	V0500
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Tetracyline	Sigma-Aldrich	87128
Taq DNA polymerase	Thermofisher Scientific	10342-020
Platinum pfx DNA polymerase	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific	15224-041
E coli Dh5-alpha	Thermofisher Scientific	18258012
E coli Top10	Thermofisher Scientific	C4040-03
pET100D/topo vector	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vector	Thermofisher Scientific	K2030-01