用于研究与人类衰老相关疾病基因的转基因小鼠表型分析方案

摘要

本文介绍了一种利用小鼠作为模型系统，通过反向遗传学方法研究与人类疾病相关的基因家族的策略，并描述了相应的小鼠表型分析流程。由于HtrA2基因缺陷的小鼠表现出帕金森样症状，因此该表型分析方案侧重于鉴定神经系统缺陷。

摘要

与年龄相关的疾病正变得越来越普遍，随着人口老龄化，其带来的负担持续加重。尽管迫切需要有效的治疗方法来减轻这些致残性疾病的危害，但在许多情况下，有效的治疗手段仍然难以实现。只有深入理解与衰老相关疾病的病因和病理机制，科学家才能开始识别潜在的治疗靶点，并制定相应的干预策略。最常见的与年龄相关的疾病包括神经退行性疾病，如帕金森病和失明。年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人失明的首要原因。全基因组关联研究此前已鉴定出与该疾病易感性相关的基因位点，并确定了两个重点关注区域：补体因子H（CFH）基因以及位于10q26的位点，后者包含年龄相关性黄斑病变易感基因2（ARMS2）和高温需求因子A1（HtrA1）基因。CFH是补体系统旁路途径（AP）的负调控因子，而HtrA1是一种细胞外丝氨酸蛋白酶。ARMS2位于灵长类基因组中HtrA1的上游，但在小鼠基因组中该基因缺失。为了研究这些基因的作用，已建立了人源化敲入小鼠品系 Cfh 和 ARMS2，敲除 Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 和 HtrA4 以及条件性神经元基因敲除 HtrA2 生成了这些小鼠。在所有基因工程小鼠中，只有全身性或神经组织特异性缺失 HtrA2 的小鼠表现出明显的表型。为了对这些小鼠进行彻底而系统的分析，建立了一个初步的表型分析方案，该方案包含一系列与两种主要关注疾病相关的测试：年龄相关性黄斑变性（AMD）和帕金森病。可通过适当的实验对基因修饰小鼠进行检测，以鉴定可能与人类相关疾病有关的表型。本文介绍了一项以线粒体为重点的表型分析方案，并展示了相关测试的代表性结果。

引言

与年龄相关的疾病在现代社会中日益普遍。随着医学科学的进步和预期寿命的延长，人口持续老龄化，这些疾病的负担也随之加重。为了减轻致残性疾病带来的影响，亟需有效的治疗方法，但在许多情况下，此类疗法仍难以实现。只有深入理解与衰老相关疾病的病因和病理机制，科学家才能开始识别潜在的治疗靶点，并制定干预策略。常见的年龄相关疾病包括神经退行性疾病，例如帕金森病（PD）和年龄相关性黄斑变性（AMD）。帕金森病是人类因神经退行性变引起的最常见运动障碍。大多数帕金森病患者在50岁以后出现静止性震颤、运动迟缓和肌强直等症状。约10%的病例中也观察到早发性发病。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致老年人失明的首要原因，会逐渐损害眼部的光感受器和视网膜色素上皮（RPE）。中心视力受损，但周边视力通常不受影响。AMD有两种类型。在"干性"类型中，RPE与布鲁赫膜（BM）之间会形成被称为玻璃膜疣的细胞外蛋白沉积物，导致地图样萎缩和中心视力模糊。更严重的"湿性"类型则是由于脉络膜通过BM向RPE和光感受器层发生新生血管化，可能引起视网膜下出血，造成视网膜组织的永久性损伤。全基因组关联研究此前已鉴定出与该疾病易感性相关的多个位点，并确定了两个重点关注区域：位于1号染色体上的补体因子H（CFH）基因，以及10q26位点，后者包含年龄相关性黄斑病变易感基因2（ARMS2）和高温需求因子A1（HtrA1）基因^1-5。这些等位基因的组合以剂量依赖的方式增加患AMD的....

方案

伦理声明：涉及动物的研究均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的建议，并符合耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定。

1. 转基因小鼠的行为学测试

注意：所有小鼠应接受相同的测试流程，以尽量减少因适应抓取操作而产生的差异。每次测试应在每天的同一时间进行。

1. 新生小鼠后肢测试
   注意：后肢测试从出生后第（P）4天至P10每天进行一次，用于评估后肢近端肌肉的力量、无力情况及疲劳程度。
   1. 将小鼠转运至测试区域，并在测试前静置30分钟。
   2. 准备测试装置：用70%乙醇清洁一个50 ml锥形管，将两个（P4-P8）或一个（P9-P10）棉球推至管底，并将锥形管固定于垂直位置。
   3. 从笼中取出一只仔鼠并记录体重。在非测试期间，将仔鼠置于加热垫上的暂存托盘中。
   4. 轻轻将新生仔鼠的后肢悬挂在锥形管边缘上方，使其朝向管底的棉球方向向下。记录其拉拽尝试次数，并使用秒表测量其跌落潜伏期。
   5. 重复测试一次，然后用记号笔标记仔鼠。之后，通过脚趾剪切法识别P6日龄仔鼠。 测试结束后，用原笼垫料轻轻擦拭仔鼠，再放回原笼。
   6. 用70%乙醇擦拭锥形管。
   7. 依次对下一仔鼠进行测试，直至整窝仔鼠全部完成测试。
   8. 丢弃棉球和锥形管。所有....

结果

本部分描述了使用这些方法可获得结果的示例。在后肢试验中，每天连续进行两次测试，并将两次测试中的拉拽尝试次数和跌落潜伏期相加。该测试可用于比较遗传背景不同的组别，以区分神经肌肉力量减弱的小鼠。HtrA2^tm1jhoh（HTRA2 基因敲除，HTRA2 KO）小鼠在图1A-B中显示，在出生后第4至6天（P4-6）拉拽次数和跌落潜伏期无变化，但在出生后第7至10天（P7-10）出现神经肌肉力量下降，与同窝野生型小鼠（HTRA2 WT）相比存在差异。在野生型动物中，也可观察到随年龄增长而出现的力量增强。在断奶期观察试验中，可通过将测试连续三天内所有行为事件（穿越的格线数、直立和理毛行为）相加并取平均值来评估总活动量。或者，也可对每种特定类型的行为事件进行单独分析。此处展示了代表性结果，表明HTRA2基因敲除小鼠的活动量低于野生型同窝小鼠。这些数据表明，总活动量可在不同组间进行定量测量和比较（图1C）。通过计算每天三次重复测试的平均值，也可对.......

讨论

为了减轻与人类衰老相关疾病的致残性影响，迫切需要建立有效的治疗手段，但目前许多疾病仍缺乏有效的疗法。要确定潜在的治疗靶点并制定干预策略，首先必须了解与衰老相关疾病的病因和病理机制。即使某些基因在人类研究中已被证实与特定疾病相关，但并非所有经过基因修饰的小鼠都会立即表现出与目标疾病相关的明显表型。因此，需要开展更为系统的研究，并对基因修饰小鼠进行适当的实验，以识别可能与人类相关疾病有关的表型特征。

存在多种行为学测试方法，可用于检测小鼠的神经功能^50,51。本文所述的行为学测试方法适用于基于人类研究结果所推测的小鼠表型，以及实际观察到的小鼠表型。此外，这些测试方法操作简便，即使缺乏或仅有少量行为学实验经验的实验室也能顺利开展。这些测试无需复杂的仪器设备，只要规范操作，即可获得有意义且具有信息量的结果，因此可作为初步评估预期存在神经肌肉缺陷的基因修饰小鼠表型的第一步。所得数据可用于指导后续更深入测试的方向，必要时可采用更为复杂的测试装置进行进一步分析。

同样，目前存在多种用于评估组织呼吸功能的技术^5.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醇	Decon（Fisher Scientific）	435541
50 ml 离心管	Fisher Scientific	1443222
棉球	沃尔玛
加热垫	太阳光束	0000756-500-000
持物盘（冰格）	沃尔玛
电子秒表	GOGO	PC396
有机玻璃箱	在车间建造		12" 12"
Vixia HF R400 摄像机	佳能	8155B004
9 盎司透明杯	沃尔玛
1/4英寸金属网	家得宝	204331884（在线）/ 554219（店内）	12" 12"
气泡膜	VWR	470092-416
直型标本钳	VWR	82027-438
精细尖头解剖镊	VWR	82027-408
精细剪刀	VWR	82027-578
16% 多聚甲醛溶液	电子显微镜科学公司	15710
10x 磷酸盐缓冲液 pH 7.4	American Bioanalytical	AB11072-04000
蔗糖	JT Baker	4072-01
超白载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
苏木精染色液	Fisher Scientific（Ricca）	353016
伊红Y染色液	Fisher Scientific（Ricca）	2845-32
Tris 盐酸盐	Sigma	T3253
Tris	American Bioanalytical	AB02000-01000
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物	Sigma	N8129
氯化硝基四氮唑蓝	Sigma	N6876
丙酮	JT Baker	9006-05
磷酸二氢钠一水合物	Sigma	S9638
七水合磷酸氢二钠	Sigma	S9390
六水合琥珀酸钠二碱	Sigma	S2378
VectaMount 水性封片介质	Vector Laboratories	H-5501-60
盖玻片	Fisher Scientific	12-545-M	60 mm × 24 mm
AxioImager A1 显微镜	Zeiss
摄像机三脚架	亚马逊
最佳切割温度（OCT）	Fischer Scientific	23730571
冷冻切片  机器	Leica	CM1900	已停用，但已被 CM1950 取代