Introduction
加齢関連疾患は、現代社会でますます普及してきています。医学が向上し、平均余命が増加すると、人口は年齢に続き、これらの疾患の負担が大きくなります。有効な治療法は衰弱させる条件の影響を軽減するために必要であるが、多くの場合、とらえどころのないまま。唯一の加齢に伴う疾患の原因と病態を理解することによって、科学者たちは、潜在的な治療標的を同定し、介入のための戦略を開発するために始めることができます。一般的な加齢関連状態は、パーキンソン病（PD）及び加齢性黄斑変性症（AMD）などの神経変性疾患が挙げられます。 PDは、ヒトにおいて神経変性によって引き起こされる最も一般的な運動障害です。ほとんどのPD患者は、年齢の50年後振戦、動作緩慢、剛性を休んなどの症状を示しています。早期発症はまた、症例の約10％において観察されています。
AMDは失明の主要な原因であります目の中の高齢者、漸進的にダメージを与える光受容体および網膜色素上皮（RPE）。中心視力が損なわが、周辺視野は、一般的に影響を受けません。 AMDの2つの形式があります。 「ドライ」の形式では、RPEとブルッフ膜（BM）との間のドルーゼンの形として知られている細胞外タンパク質の沈着は、地理的萎縮につながると中心視力のぼやけ。より深刻な「ウェット」フォームRPEと感光層へのBM全体の脈絡膜から新生血管形成の結果とは、網膜組織に永久的な損傷を引き起こす網膜の下にhamorrhagingにつながることができます。染色体1および10q26座、加齢性黄斑変性症の感受性2（ARMS2）との補体因子H（CFH）：ゲノムワイド関連研究では、以前にこの疾患に感受性の増加に関連付けられており、関心の2つの領域を同定された遺伝子座を同定しました高温要件因子A1（HTRA1）遺伝子が1-5位置しています3-6の湿潤または乾燥形態のいずれかに関連付けることができます。
CFHはC3の活性化を阻害することによって補体系の代替経路（AP）の負の調節因子として作用します。一塩基多型（SNP）が原因でC置換1〜Tにヒスチジンとエクソン9におけるチロシン402の交換を引き起こし、AMDのリスクの増加に関連しています。 AMDでは、APが原因CFHの機能の喪失が、SNPは因果的役割は不明である果たしているかどうかを誤調節されると考えられています。 1つの仮説は、正に荷電したヒスチジンは、タンパク質C反応性タンパク質、およびヘパリン硫酸1,7相互作用に結合するCFHの能力を無効にすると考えられることである。CFH Y402Hのインビトロ研究は、変異体間の機能の違い上矛盾する結果を提供し、 中in vivoでの作業<EM> CFH - / -ヒトCFHを発現するマウスは、8進行中です。遺伝子は、マウスには存在しないもののARMS2は、霊長類ゲノムにおけるHTRA1の上流に位置します。 HTRA1は、セリンプロテアーゼであるが、ARMS2が不十分に特徴付けられます。 AMD関連遺伝子座におけるSNPの間の連鎖不均衡は、それが困難なこの地域の遺伝子の個々の突然変異のリスクへの寄与を決定するために作られましたが、最近の研究は、それが血管新生につながるというARMS2よりHTRA1の過剰発現があることが示唆されていると網膜下のタンパク質沈着9-11。しかし、この遺伝子座における遺伝子の近接は、ランダムに挿入された導入遺伝子を用いて研究することができないの相互作用を可能にすることができます。
AMDに加えて、セリンプロテアーゼのhtrAのファミリーは、多くのヒトの疾患に関連しています。すべてhtrAのタンパク質は、少なくとも1つのC末端PDZドメインに続くセリンプロテアーゼドメインを含みます。 HTRA1、HtrA3とHtrA4はグラムを共有しますシグナルペプチド、インスリン様成長因子結合ドメイン、カザールプロテアーゼインヒビタードメイン、セリンプロテアーゼドメインおよびPDZドメインからなるeatest相同性。 HtrA2は異なるミトコンドリア局在配列からなるN末端 、膜貫通ドメインおよびプロテアーゼおよびPDZドメイン12-16に続いてアポトーシス結合ドメインの阻害剤を持っています。哺乳類HTRA1は、そのプロテアーゼドメイン17-20の活性部位における基質誘導性のリモデリングによって調節され、HtrA2はまた、プロテアーゼ活性21を抑制するセリンプロテアーゼとPDZドメインの相互作用によって調節することができます。興味深いことに、PDZドメインはHtrA3 16と同様の規制を付与することが表示されません。 htrAのプロテアーゼはまた、外因性因子によって調節することができる。それは、最近HTRA1およびプロトポルフィリン22とHtrA2の間の調節的相互作用は、p38 MAPキナーゼの活性化によってリン酸化によって調節することができるが存在することが実証されましたPINK1依存的23で経路。マウスでのhtrAのファミリーの個々のメンバーの削除は、しかし、機械的な影響はほとんどが部分的に目に見える表現型の欠如に不明確である、文書化されています。
HTRA1は、タンパク質品質管理において重要な機能を果たしており、その制御ミスまたは変異は、関節炎、癌およびAMD 3,4,24-32のリスクの増加など、さまざまなヒト疾患と関連しています。加速中の非神経組織の結果から、その損失は33-37老化しつつ神経組織におけるHtrA2機能の喪失は、ヒトおよびマウスにおけるPDの表現型と関連しています。 HtrA3の調節不全は、子癇前症および癌38,39の特定の種類を含む、疾患に関連しています。アップレギュレーションHtrA4のは、子癇前症患者の胎盤で観察されているが、ノックアウトマウスは明白な表現型40,41は表示されません。いくつかのノックアウトマウスで観察された表現型の欠如がありましたhtrAのファミリーメンバー間の補償の結果であると仮定：それはHtrA4とHTRA1両方がHtrA4 41の削除時にHTRA1により補償を可能にする、タンパク質のTGF-Bファミリーと相互作用すると考えられています。同様に、HTRA1とHtrA3がドメイン相同性の高い学位を持っているので、それらが相補機能42を持っているかもしれないと考えられています。しかし、一般的なターゲット43を調節するために競合する、htrAのタンパク質は、部分的に拮抗的役割を有し得ることが示唆されています。
さらに、これらのリスクを調査するためには、3つのヒト化ノックインマウス系統が生成された要因。 CFH TM1（CFH * 9）jhohとCFH TM2（CFH * 9）jhohは 、CFH遺伝子のエキソン9はヒト相同体のエクソン9で置換されている。CFHのTM1（CFH * 9）jhohは、非疾患関連チロシンをコード化するにはY402H、リスク関連SNPを運ぶjhoh CFH TM2（CFH * 9）に対し、402位の残基、。に人間ARMS2シーケンスtm1jhoh ARMS2は HTRA1の上流領域を標的としました。以前34に記載されているように loxP隣接STOP配列遺伝子配列の上流に配置されなく含まUBICプロモーターの下流には、Rosa26遺伝子プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを発現する、OzCreマウスと交配することによって切除しました。加えて、これらのノックインライン、CFHおよびHTRA1（CFH tm1jhohとHTRA1のtm1jhoh）、ならびに他の既知のhtrAのファミリーメンバーの条件付きノックアウト対立遺伝子が生成されました：HtrA2（HtrA2のtm1jhoh）、HtrA3（HtrA3 のtm1jhoh）とHtrA4（ HtrA4のtm1jhoh）。エクソン3、HTRA1;生殖ノックアウトは、欠失は、フレームシフトおよび/ または活性ドメイン（CFHの削除を引き起こすように、loxP部位で特定のエキソンに隣接するように設計された動物にOzCreマウスを交配することによって作成されたエクソン2-3、HtrA2：エクソン2-4、HtrA3。エクソン3、HtrA4。エクソン4-6）34,41。また、34に記載されている、;ガラス転移温度（Tg（NES-CRE）1Kln / J HtrA2 FLOX）HtrA2の神経削除は、 ネスチンのプロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを使用して削除しました。 HtrA2を欠くマウスのみ、いずれかの全身または神経組織では、パーキンソン病の表現型を呈する、明確な表現型を示しました。
関心のこれらの遺伝子のいくつかは、ミトコンドリア11,44-47に局在することが仮定されており、HtrA2の削除はパーキンソン表現型を生成し、ミトコンドリアと神経学を中心とした表現型の計画はここに記載されており、関心の試験からの代表的な結果が提供されているので、 。初期の表現型のスケジュールが2メインに関連する一連のテストからなる、設立された徹底的かつ系統的、加齢関連疾患の人間を調査するために製造し、遺伝的に改変マウスを調べるために興味のある疾患：AMDおよびパーキンソン。
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Protocol
倫理文：動物に関わる研究は、実験動物の管理と使用に関するガイドとイェール大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）における衛生勧告の国立研究所に準拠して実施しました。
遺伝子改変マウスの1行動試験
注：すべてのマウスは取り扱いに慣れの違いを制限するために、同じ試験レジメンに供されるべきです。試験日の同じ時間に毎回実行されるべきです。
- 新生児後肢テスト
注：後肢試験は、近位後肢の筋肉の強さ、弱さや疲労を評価するために、P10に生後日（P）4から毎日行われています。- 交通マウステストエリアへと試験前に30分間休ませることができます。
- Tの底部に2つ（P4-P8）または1（P9-P10）、コットンボールを押し込み、70％エタノールを用いて50mlコニカルチューブを洗浄することにより、試験装置を準備宇部および垂直位置に固定します。
- ケージから1子犬を削除し、重量を記録します。テストが行われていないときはいつでも熱パッドの上にトレイを保持するの子犬を保管してください。
- そっとそれはコットンボールに向かって下向きにされるように、円錐管の縁の上に新生児の後肢を一時停止します。作られたプル試行回数をカウントし、ストップウォッチを使用して落下するレイテンシを測定します。
- マーカーで子犬にラベルを付け、その後もう一度繰り返します。その後、つま先のクリッピングによってP6仔を識別します。交換する前に、ホームケージから寝具で穏やかに子犬をこします。
- 70％エタノールでコニカルチューブを拭きます。
- 全体のゴミがテストされるまで、次の子犬でのテストを繰り返します。
- コットンボールと円錐管で廃棄してください。 70％エタノールですべての機器を清掃してください。
- 離乳観察試験
注：離乳観察試験は、運動と一般的な活動のレベルを獲得するためにP19からP21に毎日投与されます。- 検査領域Aに搬送マウスndは試験前に30分間休ませることができます。
- 70％エタノールで洗浄することにより、基材上に2インチの正方形の6x6のグリッドでマークされたプレキシグラスのテストボックスを用意します。全体ボックス視野にあるような側に映像機器を設定します。セットアップと新規性を導入することを避けるために、毎日同じことを周囲に保ちます。
- 清潔保持カップにケージや場所から1離乳を削除してください。レコードの重み。
- マウスの識別番号、年齢およびテストの日付で、テスト識別カードを撮影して、ビデオ録画を開始します。中央広場にカップを保持してから、マウスを転送します。 3分間の時間は、試験中、マウスの両方の前足が横断する行数をカウントします。
- きれいなケージとエンドビデオ録画にマウスを返します。
- 70％エタノールで試験装置を清掃してください。
- すべてのゴミがテストされるまで、その後ホームケージにすべての仔を返す繰り返します。
- 70％エタノールですべての検査機器を清掃してください。
- ワイヤメッシュグリップ強度試験
注：握力試験はP22とP26との間の交互の日に行われ、神経筋の強度を評価します。- テストエリアへの交通マウスとは、試験前に30分間のホームケージで休むことができます。
- 70％エタノールでプレキシガラスボックスとメッシュグリッドを洗浄することにより、装置を準備します。箱の底にプチプチを置き、紙でカバーしています。
- 個々の保持カップに入れる3のグループに別々のマウス、。
- ワイヤーメッシュの中央に最初のマウスを置き、ゆっくりとプレキシガラス箱の底に柔らかい表面上に10〜20センチメートルを反転。ストップウォッチを使用して落下するレイテンシを測定します。マウスがない場合は60秒が経過した後にテストを終了秋。
- カップを保持するマウスを返し、70％エタノールでメッシュを拭くとプチプチの上に紙を交換してください。最初に戻る前にグループ内の残りの2匹のマウスに試験を行います。各マウスは、合計3回テストが完了するまで繰り返します。
- きれいなケージにグループを戻し、残りの基に進みます。どのグループでも、3匹のマウスよりも少ない場合、5分間トライアル回復間隔が許可されていることを確認。
- ホームケージにすべてのマウスを返し、70％エタノールで紙ときれいな検査機器を処分。
網膜構造の2.検討
- 腹腔内ケタミン注射（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）により、P30-35に動物Anaesthetize。フットパッドをつまんで麻酔の深さを評価し、IACUCガイドラインに沿って、応答の不存在下でのみ進行します。 4％PFA / PBS 48で灌流します。
- 目を削除するには、切開SIで肌をきれいに頭蓋底の皮膚を切断する前に、70％エタノールでTE。 70％エタノールで頭蓋骨とクリーンを露出する肌をバックピール。きれいな楽器を使用して、慎重に眼窩に到達し、目を露出するように頭蓋骨を切断。優しくソケットから目を削除し、PBSですすぎ、視神経を切断。
- 室温で10分間、4％PFA / PBS中で目を修正しました。
- PBSを含む小さなペトリ皿に目を置きます。ステッチ除去はさみを使用して角膜の中央に小さな切開を行います。角膜と強膜の間のエッジを切断することにより、角膜を削除します。アイリスを削除するには、ピンセットを使用します。最後に、所定の位置に網膜無傷でレンズを残して、RPE層をはがします。
注意：4％PFA / PBSの固定がRPEを簡単に網膜の外側から剥離することを可能にするRPEの剥離の原因となります。 - 再修正室温で15分間、4％PFA / 30％スクロース/ PBSでPBSを含むペトリ皿に目を返す前に。 lenは引き出しそれとともに硝子体をもたらし、鉗子を使用してね。
- 一晩4℃で30％スクロースでCryoprotect。
- 最適切削温度化合物（OCT）と新鮮な10月を含む埋め込む金型への転送でコート目。矢状面は、できるだけ少ない動きを用いて気泡の導入を避ける、すくい面と平行になるように目を向けます。ドライアイス/エタノール浴中で金型を浸漬することにより、フラッシュ凍結。 -80℃で保存をブロックします。
- クライオスタットを用いて、20μmの矢状切片をカットし、前洗浄スライド上に集めます。
- 標準的なプロトコル49に従ってヘマトキシリンおよびエオシンで染色切片。明視野顕微鏡のために装備光学顕微鏡を用いた画像。
3.組織化学染色
- 試料調製
- オープンドロップ吸入イソフルラン過剰摂取（プロピレングリコール中30％）を使用して、P30-35で動物を安楽死させます。停止によって安楽死を評価します呼吸、心拍およびフットパッドをつまんに対する応答の欠如。 IACUCのガイドラインに沿って、頸椎脱臼および臓器摘出により死亡を確認。
- 頭蓋底の皮膚を切開する前に、70％エタノールで切開部位の皮膚をきれいに、脳を削除します。 70％エタノールで頭蓋骨とクリーンを露出する肌をバックピール。きれいな楽器を使用して、慎重に頭蓋骨を切断し、脳を露出するように除去します。膜を外し、静かに頭蓋骨の空洞から脳を削除します。 PBSですすいでください。
- 新鮮な10月を含む埋め込む金型に10月中の脳と転送コート。矢状面は、できるだけ少ない動きを用いて気泡の導入を避ける、すくい面と平行になるように脳を方向付けます。 -80℃のドライアイス/エタノール浴とストア内の金型を浸漬することにより、フラッシュ凍結。
- クライオスタットを用いて、10μmの矢状切片をカットし、前洗浄スライド上に集めます。
<LI> NADHジアホラーゼ染色 - 1Lの脱イオン水に5.72グラムのTris-HClおよび1.66グラムのトリス塩基を溶解することにより、0.05 Mトリス緩衝液、pH 7.6を準備します。 6週間まで4℃で保管してください。
- NADH溶液（0.05 Mトリス緩衝液中で2.25 mMのNADH）を準備します。 -20℃で小分けし、店舗。
- NBT溶液（0.05 Mトリス緩衝液中の2.5mMのニトロブルーテトラゾリウム）を準備します。ガラス瓶に6週間まで4℃で保管してください。
- 染色溶液を作製し、各スライドに1ミリリットルを追加するために、NADH溶液およびNBT液を等量を兼ね備えています。 30分間加湿チャンバー中、37℃でインキュベートします。
- 吸引染色液との dH 2 Oで3回洗浄し
- 昇順と降順のアセトン濃度で3回ずつ洗浄/のdH 2 0（30％、60％、90％、60％、30％）を、室温で2分間。
- dH 2 Oで3回すすぎ、水性媒体とのセクションをマウントします。明るいFのために装備光学顕微鏡を用いた画像ield顕微鏡。ブルー染色は、酵素活性に相当します。
- コハク酸脱水素酵素組織化学染色
- 0.2 Mナトリウム一塩基性リン酸/のdH 2 Oおよび0.2 Mナトリウム二塩基性リン酸/のdH 2 Oを準備
- 20部のナトリウム二塩基性リン酸3部の一塩基性リン酸を組み合わせることにより、0.2 Mリン酸緩衝液、pH 7.6にします。
- 染色溶液（0.1 Mコハク酸ナトリウム、0.2 Mリン酸緩衝液中の1.25 M NBT）を準備し、各スライドに1ミリリットルを追加します。 60分間加湿チャンバー中、37℃でインキュベートします。
- 吸引染色液とのdH 2 Oで3回洗浄
- 昇順で3回ずつ洗浄し、アセトンの濃度を下降/のdH 2 O（30％、60％、90％、60％、30％）を、室温で2分間。
- dH 2 Oで3回すすぎ、水性媒体とのセクションをマウントします。明視野顕微鏡のために装備光学顕微鏡を用いた画像。ブルー染色はアンに対応しますzymatic活動。
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Representative Results
このセクションでは、これらの方法を用いて得られる結果の例を説明します。後肢試験では、プル試行回数が行われ、待ち時間は、毎日のための2つの連続した試験にわたって合計される落下します。この試験は、減少筋強度を有するマウスを区別するために、遺伝的に異なる群を比較するために使用することができ、図1AのHtrA2のtm1jhoh（HTRA2 KO）マウス- B還元しP4-6から落下するプルし、待ち時間の数の変化を示しません同腹子（HTRA2 WT）と比較して、P7-10での神経筋強度、インチ加齢に伴う強度の予想増加は、野生型動物でも観察可能です。離乳観察試験では、総活性は、テストの3日連続にわたって平均（線が飼育やイベントをグルーミング、トラバース）すべてのイベントを合計することによって評価することができます。また、イベントの各特定のタイプとすることができるindividuallyは分析しました。ここでは代表的な結果は、WT同腹仔と比較して、HTRA2 KOマウスの減少した活性を実証し、提示されています。これらのデータは、総活性を定量的に測定し、群（ 図1C）間で比較することができることを示しています。各試験日に実施した3つの反復からの毎日の平均値を算出することにより、グリップ力の差を定量化することも可能です。 HTRA2 KOマウスは、同腹子対照と比較すると、より短い待ち時間でマニフェスト強度の低下が（ 図1D）を落下します。
網膜のH＆E染色は、網膜の構造を調べると（ 図2）と比較することが可能な画像を生成します。網膜を構成する細胞型の層は明らかに遺伝的グループ間の比較を可能に描写されています。ここでは、tm1jhoh HtrA2 '; HtrA3 tm1jhohマウスは、HtrA2と比較して、網膜の構造に変化を示しません
図1：行動遺伝的に操作されたマウスの表現型 HtrA2のtm1jhoh（HTRA2 KO）マウスは、説明行動試験にかけ、野生型（HTRA2 WT）同腹子対照と比較しました。 （A - B）後肢懸垂試験は、P4-P10からWTとKO新生児に行われ、神経筋の減少を実証しました。KO動物における強度（WT：N = 28、KO：N = 19）。 （A）KO仔は、最初のWT兄弟としてプル試行同様の数を作るが、後の時点で作られた試みの減少を示しています。 （B）落ちるKO新生児」の待ち時間も、最初は正常であるが、以降P7から減少します。 （C）離乳観測総活性スコアは、WT同腹仔と比較してKO動物で減少し、これらのマウスの活性低下と一致して（WT：N = 19、KO：N = 12）しました。 （D）KO動物もHTRA2 KOマウスの減少握力を実証し、メッシュ反転テスト中に落下する待ち時間の削減を持っていた（WT：N = 17、KO：N = 9）。データは平均±SEM（＃0.1 <P <0.05、* P <0.05、** P <0.001、*** P <0.001独立t検定による）を表します。この図は、パターソンらから変更されている。34 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
図2： 網膜のH＆E染色 、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色網膜のセクションでは、網膜層の輪郭を描く、構造体の検査を可能にします。ここではP35 HtrA2 WTからの切片; HtrA3 tm1jhoh（A）とHtrA2のtm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh（B）の表示正常な網膜構造。 RPE：網膜色素上皮、OS：外側セグメント、IS：内部セグメント、ONL：外顆粒層、OPL：外網状層、INL：内顆粒層、IPL：内網状層、GCL。神経節細胞層。スケールバー= 1mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：呼吸器複合体活性 NADHジアホラーゼ（複合体I）およびコハク酸デヒドロゲナーゼ（複合体II）の活動のための組織化学的染色はP25のHtrA2 FLOX / FLOXの横断脳切片上で実施した; Tgは（NES-CRE）1Kln / J（NesKO）と。 HtrA2 + / FLOX; Tgは（NES-CRE）1Kln / J（NesWT）同腹子。 NADHジアホラーゼの酵素活性は、小脳（Crbl、B）とNesWTコントロール（A、C）と比較してNesKO脳の線条体（D）に減少したが、されていない大脳皮質における（E - F）。 SDH活性は、同様にNesWT対照と比較してNesKOマウスの小脳及び線条体（H、J）に（G、I）を減少させたが、大脳皮質に変化がないされている（K - L）が 。スケールバー=200μmです。この図は、パターソンら 34から変更されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
堅牢な治療法は、ヒトの老化に関連した条件を衰弱させるの影響を制限するために必要な、しかし、彼らは多くの条件のためにとらえどころのないままにされています。潜在的な治療標的を識別し、介入のための戦略を開発するには、加齢に伴う疾患の原因や病態を最初に理解しなければなりません。ていないこれらの遺伝子は、以前にヒトでの研究で条件にリンクされている場合でも、興味の疾患に関連する明確な表現型を有するすぐに存在するすべての遺伝的に改変マウス。したがって、より体系的な研究が必要とされ、遺伝的に改変されたマウスは、ヒトでの関連疾患に関連する可能性の表現型を識別するために、適切な実験に供されるべきです。
無数の行動試験は、マウス50,51における神経学的機能をアッセイするために存在します。本明細書で概説行動試験は、ヒトの調査結果と実際の表現型に基づいて仮説を立てた表現型に適しているOBSEマウスでrved。また、これらのテストは、行動実験を行うにはほとんど、あるいは経験のない研究室で実行するのが簡単です。そこに洗練された機器のための要件はありませんが、適切に収集されたときの結果は有意義で有益であり、神経筋欠陥を有することが期待される遺伝的に改変されたマウスの表現型を調べるための最初のステップとして、それらが有用となります。得られたデータは、潜在的に、より洗練された試験装置を用いて、さらなる検査の焦点を指示するために使用することができます。
同様に、多くの技術が、組織52内の呼吸機能を評価するために存在します。 ATP合成、酸素消費量またはミトコンドリア膜電位の変化の速度を測定することは、ミトコンドリア機能の重要な読み出しですが、彼 らは、特定の試薬 や機器52-55を必要とする 、複雑で時間を実行するのにかかる可能性があります。さらに、それらはしばしばmitochondのレベルに制限されますRIONまたは細胞、培養細胞、溶解物または単離されたミトコンドリアに依存します。組織化学染色は、時間やリソースの大規模な投資なしにミトコンドリア機能障害を同定するのに有用で最初のステップです。また、組織切片を染色する能力は、それ自体役立つ迅速例えば他の技術と同様に明らかではないかもしれない地域差、HtrA2欠損脳で観察された酵素染色の面積固有の損失を特定します。技術は、呼吸能力の倍数変化を測定する能力が制限されるが、それは、より複雑な方法を用いて追求することができる定義された脳の領域をマッピングします。
この表現型のスケジュールの中に提示された技術は、実施するのが簡単ですが、適切に特定のステップを実行すると、実験の成功に不可欠です。行動表現型については、細心の注意が変動イントロを制限するために、毎日同じ時間、同じ場所で行われているテストを確保するために注意する必要があります場所の新規性によって、または概日リズムの違いによって生さ。機器は、同様の理由で、毎日同じ方法で組織されるべきです。部屋の組織は、新規性の小さな変化が大きく、マウスの活動に影響を与えることができる活性試験のために特に重要です。握力を測定する場合、研究者らは、マウスが反転する前に、メッシュの適切なホールドを持っていることを確かめるべきです。同様に、ケアが適切に後肢試験にリリースする前に子犬を一時停止するために取られなければならないか、テスト結果が収まるように短い待ち時間に偏っされます。
組織の表現型については、良好なセクションを得ることが不可欠です。解剖やアーティファクトが切片と解剖中に発生と形態を歪曲する前網膜の参考染色は、効果的な固定に依存します。組織化学染色は、酵素機能を維持するために解剖した後速やかに凍結する頭脳が必要ですが、インキュベーション時間は、同様にcriticaですリットル;温度や時間の長さの小さな変動は染色強度の違いを引き起こす可能性があります。可能な場合、サンプルは、グループ間の比較を可能にするために同時に処理されるべきです。
ここで、加齢関連疾患に関連した微妙な表現型、すなわち、AMDとPDを表示することが期待遺伝的に改変マウスを研究するために使用されるテスト計画は、記述されています。この表現型のスケジュールは、神経筋強度および活性の欠損を同定、ならびに関心対象の組織内の構造的および機能的欠陥を識別するために使用することができます。このスケジュールは、若い、遺伝子改変マウスでは早期の表現型の体系的な分析を提供します。将来的には、この方法は、AMDまたはPD関連表現型、ならびに明白に正常に見える原因不明のもので提示することが期待任意の遺伝的に改変されたマウスにも適用することができます。テストのシンプルさは重要な投資なしでテストできますが、さらなる秒を知らせるために使用することができますtudies。細胞の表現型で行動試験を組み合わせることによって、使用されるマウスの数を制限し、直接の生理学的状態を有する動物の性能を比較することが可能です。この表現型のスケジュールは、その後の研究の焦点を指示するために使用することができ、初期の分析を提供します。
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Acknowledgments
この研究のための資金は、シャクナゲ医療財団とイェール大学医学部ディーンの研究基金（JH）から来ました。私たちは行動実験のヘルプは博士クレアケーニッヒに感謝します。遺伝子操作したマウス系統はOzgene（パース、オーストラリア）で生成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
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