Introduction
Yaşa bağlı hastalıklar modern toplumda giderek yaygın hale gelmektedir. tıp bilimi geliştirir ve yaşam beklentisi arttıkça, nüfus yaşlanmaya devam ve bu hastalıkların yükü büyür. Etkili tedaviler zayıflatıcı koşullarının etkisini azaltmak için gerekli olan ancak birçok durumda zor kalır. Sadece nedenlerini ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların patolojisi anlayarak bilim adamları müdahale stratejileri potansiyel terapötik hedefleri belirlemek ve geliştirmek için başlayabilir. Yaygın yaşla ilgili koşullar, Parkinson hastalığı (PD) ve yaşla alakalı maküler dejenerasyon (AMD) gibi nörodejeneratif bozukluklar yer alır. PD insanlarda nörodejenerasyon neden olduğu yaygın bir hareket bozukluğudur. En PD hastalar 50 yaşından sonra titreme, bradikinezi ve sertlik dinlenme gibi belirtiler gösterir. Erken başlangıçlı ayrıca vakaların yaklaşık% 10'unda görülmektedir.
AMD, körlüğün önde gelen nedenidir olduğunuyaşlı, giderek zarar fotoreseptör ve göz retina pigment epiteli (RPE). Merkezi görme engelli ama periferal görme genellikle etkilenmez edilir. AMD iki biçimi vardır. "Kuru" şeklinde, RPE ve Bruch membranı (BM) arasındaki druzen formu olarak bilinen hücre dışı protein yatakları, coğrafi atrofiye lider ve merkezi görme bulanıklığı. daha şiddetli "ıslak" biçim RPE ve fotoreseptör katmanlar halinde BM genelinde koroid gelen neovaskülarizasyon sonuçları ve retina dokusunun kalıcı hasara neden olan retina altında hamorrhaging yol açabilir. kromozom 1 ve 10q26 lokusu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu duyarlılık 2 (ARMS2) ve kompleman faktör H (CFH): genom dernek çalışmaları daha önce bu hastalığa artan duyarlılığı ile alakalı ve ilgi iki bölgesini tespit edilir loci belirledik yüksek sıcaklık gereksinimi faktörü A1 (HtrA1) genleri 1-5 bulunmaktadır 3-6 ıslak ya da kuru formları da ilişkilendirilebilir.
CFH C3 aktivasyonunu inhibe ederek kompleman sisteminin alternatif yol (AP) bir negatif düzenleyicisi olarak işlev görür. Bir tek nükleotid polimorfizmi (SNP) nedeniyle C ikamesi 1 bir T'ye histidin ile ekson 9 tirozin 402 değişimini neden AMD riski ile bağlantılı olmuştur. AMD AP nedeniyle CFH fonksiyon kaybı değil SNP bir nedensel rolü net değildir çalıp düzeni bozulmuş olduğuna inanılmaktadır. Bir hipotez pozitif yüklü histidin protein ve heparin sülfat 1,7 proteinleri-reaktif C etkileşim bağlamak için CFH yeteneğini inkâr düşünülmektedir olmasıdır. Gelen CFH Y402H in vitro çalışmalar varyantları arasında fonksiyonel farkları üzerinden çelişkili sonuçlar sağlamak, ve işi de vivo <em> CFH - / - hümanize CFH 8 devam etmektedir ifade fareler. Gen farelerde eksik olan, ancak ARMS2, primat genomuna HtrA1 arasında beslenir. HtrA1 bir serin proteaz, ancak ARMS2 zayıf bir şekilde karakterize edilir. AMD-ilişkili odağı SNP arasındaki bağlantı dengesizliği zor bu bölgedeki genlerin bireysel mutasyonların riskine katkılarını belirlemek amacıyla yaptığı, ancak son çalışma bu neovaskülarizasyon yol açar yerine ARMS2 daha HtrA1 aşırı ifadesi olduğunu öne sürdü ve subretinal protein mevduat 9-11. Ancak, bu lokusunda genlerin yakınlığı rastgele eklenen transgenlerin kullanılarak incelenebilir edilemez etkileşimleri izin verebilir.
AMD ek olarak, serin proteazları HtrA ailesinin bir çok insan hastalığı ile ilişkilendirilmiştir. Tüm HtrA proteinler, en az bir C-terminali PDZ alan adını bir serin proteaz alanı içermektedir. HtrA1, HtrA3 ve HtrA4 gr paylaşmakbir sinyal peptidi, insülin-benzeri büyüme faktörü bağlama alanı, bir Kazal proteaz inhibitörü etki, serin proteaz alanının ve PDZ alanından oluşan eatest homoloji. HtrA2 mitokondriyal yerelleştirme dizisi, zar geçiş alanı oluşan, farklı bir N-terminusa sahip ve apopitoz bağlayıcı alan inhibitörü proteaz ve PDZ etki 12-16 eklenmiştir. Memeli HtrA1 kendi proteaz etki 17-20 aktif sitesine alt-tabaka ile indüklenen yeniden düzenlenir ve HtrA2, proteaz aktivitesi 21 bastırır serin proteaz ve PDZ etki alanları arasındaki etkileşimi modüle edilebilir. İlginç bir şekilde, PDZ alan HtrA3 16 benzer ayarlaması gerçekleştirmek için görünmez. Bu en son HtrA1 arasında bir düzenleyici bir etkileşimin var olduğunu gösterdi ve 22 protoporphyrins ve HtrA2 p38 MAP kinazın aktivasyonu ile fosforilasyon ile regüle edilebilir: HtrA proteazlar ayrıca dış faktörler tarafından kontrol edilebilirBir PINK1 bağlı bir şekilde 23 yolu. Farelerde HtrA ailesinin bireysel üyelerin silinmesi ancak mekanik etkiler çoğunlukla kısmen görünür fenotip eksikliği belirsiz, belgelenmiştir.
HtrA1 protein kalitesi kontrolünde önemli bir rol oynar ve düzen bozukluğunun veya mutasyon, arterit, kanser ve AMD 3,4,24-32 riski de dahil olmak üzere bir çok farklı insana hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Hızlandırılmış nöral olmayan belirli dokular sonuçlarından da zarar 33-37, yaşlanma, nöral doku HtrA2 fonksiyon kaybı, insan ve farede PD fenotipleri ile ilişkilendirilmiştir. HtrA3 düzensizliği preeklampsi ve kanser 38,39 belirli türleri de dahil olmak üzere hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Up-regülasyon HtrA4 bir açık fenotip 40,41 göstermez preeklampsi hastalarında ama nakavt fareler plasentada gözlenmiştir. Bazı nakavt farelerde gözlenen fenotipleri eksikliği olmuşturHtrA aile üyesi arasında tazminat bir sonucu olabileceği varsayılmıştır: Bu HtrA4 ve HtrA1 hem HtrA4 41 silinmesi üzerine HtrA1 tazminat için izin proteinlerin TGF-B ailesi ile etkileşim olduğu düşünülmektedir. Benzer şekilde, HtrA1 ve HtrA3 alan homolojiler yüksek derecede sahip oldukları için tamamlayıcı fonksiyonlar 42 sahip olabilir düşünülmektedir. Ancak, HtrA proteinleri ortak hedefleri 43 düzenlemek için yarışan, kısmen antagonistik rollere sahip olabileceği öne sürülmüştür.
ayrıca bu riskini araştırmak için üç insanlaşmış knock-in fare hatları oluşturulmuştur faktörleri. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh ve CFH tm2 (CFH * 9) jhoh, CFH geninin ekson 9. İnsan homologunun ekson 9 ile değiştirilir CFH tm1 edilir (CFH * 9) jhoh olmayan hastalıklarla ilişkili tirozin kodlar Y402H, risk ilişkili SNP taşıyan jhoh CFH TM2 (CFH * 9) ise pozisyon 402 de kalıntı. İçindeİnsan ARMS2 sekansına tm1jhoh ARMS2 HtrA1 üst akışında bir bölgeyi hedef almıştır. Gen sekansı ancak dahil UbiC promotörün aşağı yukan yerleştirilmiş bir loxP-çevrili DURDURMA dizisi, daha önce tarif edildiği gibi 34, Rosa26 promoterinin kontrolü altında Cre rekombinaz ifade OzCre farelerinin geçerek çıkarıldı. Ilave olarak, bu knock-hatları CFH ve HtrA1 (CFH tm1jhoh ve HtrA1 tm1jhoh), hem de diğer bilinen HtrA aile üyeleri için koşullu nakavt aleli elde edilmiştir: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) ve HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Ekson 3, HtrA1;, germ-line Knockouts silme aktif etki (CFH bir çerçeve kayması ve / veya silinmesini neden böyle olduğunu loxP siteleri, belirli ekson kanadına mühendislik hayvanlara OzCre fareler geçerek oluşturulan ekson 2Ekzon 2-4, HtrA3;: HtrA2, -3 ekson 3, HtrA4; 4-6) 34,41 eksondan. HtrA2 bir nöral silinmesi, Nestin promoterinin kontrolü altında Cre rekombinaz kullanılarak silindi (HtrA2 flox Tg (Nes-CRE) 1Kln / J) de 34 tanımlanmıştır. HtrA2 eksik olan tek farenin, sistemik ya da nöronal dokuda, Parkinson fenotip sergileyen açık fenotipleri göstermiştir.
Çevrede bu genlerin bir kısmı mitokondri 11,44-47 lokalize edilmesi oturtulması ve HtrA2 silinmesi Parkinson fenotipleri, mitokondriyal ve nörolojik odaklı bir fenotipleme rejimi Burada anlatılan ve ilgi testlerinden Örnek sonuçlar verilmiştir oluşturulacak yana . iki ile ilgili deneylerin bir dizi oluşan sistematik bir başlangıç fenotipleme zamanlama kurulmuş iyice insan, yaşla ilgili hastalığın tespitinde ve üretilen genetik olarak fareler incelemek amacıylailgi hastalıkları: AMD ve Parkinson.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik bildirimi: hayvanlarla ilgili çalışmalar Yale Üniversitesi'nde Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) için Kılavuzu Sağlık önerileri National Institutes uygun olarak yapılmıştır.
Genetiği Değiştirilmiş 1. Farelerin Davranış Testi
Not: Tüm fareler işleme için alışkanlık farklılıkları sınırlamak için aynı test rejimine tabi tutulmalıdır. Testler günün aynı saatinde her zaman yapılmalıdır.
- Yenidoğan Hind Ekstremite Testi
Not: arka bacak testi proksimal arka bacak kas kuvveti, halsizlik ve yorgunluk değerlendirmek için P10 için doğum sonrası gün (P) 4 günlük yapılır.- test alanına ulaşım fareler testten önce 30 dakika dinlendirilir ve.
- t altına iki (P4-P8) ya da bir (P9-P10) pamuk topları iterek,% 70 etanol ile 50 ml konik bir tüp temizleyerek test cihazı hazırlanmasıUbe ve dik bir pozisyonda sabitlenir.
- Kafes ve kayıt ağırlığı bir yavru çıkarın. test değil her ısı pad üzerinde tepsiyi tutarak yavru tutun.
- Hafifçe pamuk topları doğru aşağı bakacak öyle ki, konik tüp jant üzerinde yenidoğanın arka bacaklarda askıya. Bir kronometre kullanarak düşmek yapılan çekme girişimleri ve ölçü gecikme sayısını.
- işaretleyici ile yavru etiket bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, ayak kırpma ile P6 yavrular tespit. değiştirmeden önce ev kafesinden yatak ile hafifçe yavrular ovun.
- % 70 etanol ile konik tüp silin.
- Bütün çöp test edilmiştir kadar bir sonraki yavru üzerinde test tekrarlayın.
- pamuk ve konik tüp atınız. % 70 etanol ile temizleyin tüm ekipman.
- Sütten kesilmiş Gözlem Testi
Not: sütten kesilmiş gözlem testi hareketi ve genel aktivite seviyelerini puanı P21 için P19 günlük olarak uygulanır.- test alanı a ulaşım farelernd testten önce 30 dakika boyunca dinlenmeye bırakın.
- % 70 etanol ile temizleyerek baz 2 inçlik kareler 6x6 ızgara ile işaretlenmiş pleksiglas test kutu hazırlayın. Bütün kutu görüş alanında olacak şekilde yan video ekipmanı ayarlayın. kurmak ve yenilik tanıtma önlemek için her gün aynı surroundings tutun.
- Temiz bir tutma fincan kafes ve yerden bir sütten kesilmiş çıkarın. Tutanak ağırlık.
- Fare kimlik numarası, yaş ve test tarihi ile test kimlik kartı filme video kaydı başlar. merkez meydanına kupayı tutarak fareyi aktarın. üç dakika zamanı, test sırasında fare iki ön pençeleri ile geçilen çizgilerin sayısını sayarak.
- Temiz bir kafes ve bitiş video kayıt fare dönün.
- % 70 etanol ile test aparatı temizleyin.
- Tüm çöp test edilene kadar, sonra ev kafesine tüm yavrular iade tekrarlayın.
- % 70 etanol ile temizleyin tüm test ekipmanları.
- Hasır Kavrama Dayanım Testi
Not: kavrama kuvveti testi P22 ve P26 arasında günaşırı yapılır, nöromüsküler gücünü değerlendirmek için.- Test alanına taşınması fare ve test etmeden önce 30 dakika süre ile kafes evlerinde dinlenmeye bırakın.
- % 70 etanol ile bir pleksiglas kutu ve örgü ızgara temizleme aparatı hazırlayın. Kutunun alt bubble wrap yerleştirin ve kağıt ile kaplayın.
- Bireysel tutma bardak yerleştirerek üç gruba ayrı fareler.
- tel örgü merkezi üzerine ilk fare koyun ve yavaş yavaş Pleksiglas kutusunun alt yumuşak yüzeyi üzerinde 10-20 cm ters çevirin. Bir kronometre kullanarak düşmeye gecikme ölçün. Fare yapmazsa 60 sn geçtikten sonra test sonlandırdüşmek.
- % 70 etanol ile örgü ve bubble wrap üzerinde kağıt yerine mendil, tutma fincan fare dönün. İlk dönmeden önce grupta kalan iki fareler üzerinde test yapmak. Her bir fare, üç kez toplam test edilmiştir kadar tekrarlayın.
- Temiz bir kafes grubu dönün ve kalan gruplar ile devam ediyor. Herhangi bir grupta üç fareden daha az varsa, bir 5 dakika arası deneme Kurtarma aralığı izin emin olun.
- Ev kafesine tüm fareleri dönmek% 70 etanol ile kağıt ve temiz test ekipmanları atmayın.
Retina Yapının 2. Sınav
- intraperitonal ketamin enjekte (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile P30-35 hayvanları anestezi uygulayın. Kapkaççı sıkıştırarak anestezi derinliğini değerlendirmek ve IACUC kurallarına uygun olarak, sadece bir tepki yokluğunda devam edin. % 4 PFA / PBS 48 ile serpmek.
- kesi si cildi temizlemek, gözleri kaldırmak içinKafatası tabanındaki deri yoluyla kesmeden önce,% 70 etanol ile te. % 70 etanol ile kafatası ve temiz açığa cilt geri soyma. temiz araçları kullanarak, dikkatle göz çukurları ulaşmak ve gözleri ortaya çıkarmak için kafatası kesti. yavaşça prizden gözü kaldırmak ve PBS içinde durulayın, optik sinir Sever.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 PFA / PBS gözleri düzeltildi.
- PBS içeren küçük bir petri gözleri yerleştirin. Dikiş kaldırma makas kullanılarak kornea merkezinde küçük bir kesi yapmak. kornea ve sklera arasındaki kesme kenarı ile kornea çıkarın. iris çıkarmak için forseps kullanın. Son olarak, retina sağlam ve yerinde lensi bırakarak, RPE katmanları soyulabilir.
Not:% 4 PFA / PBS tespit RPE kolayca retinanın dışından soyulmuş olması için izin RPE dekolmanı neden olur. - Yeniden düzeltme PBS içeren bir petri tabağına göz dönmeden önce% 4 PFA /% 30 sukroz, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle / PBS. len çekinonunla birlikte vitreus vücuda getiren, forseps kullanarak s.
- gece boyunca 4 ° C'de% 30 sukroz içinde cryoprotect.
- Taze OCT içeren bir gömme kalıp Optimum Kesme Sıcaklığı bileşik (OKT) ve transfer Coat gözler. sagital düzlem mümkün olduğunca az hareketleri kullanarak ve hava kabarcıklarının giriş kaçınarak, kesme yüzü ile paralel olacak şekilde göz yönlendirmek. Bir kuru buz / etanol banyosu içinde kalıp daldırarak flaş dondurma. -80 ° C'de saklayın blokları.
- Bir Kriyostat kullanarak, 20 mikron sagital bölümleri kesmek ve önceden temizlenir slaytlar üzerinde toplamak.
- Standart protokollere 49 göre hematoksilen ve eozin ile Leke bölümleri. Aydınlık alan mikroskobu için donatılmış bir ışık mikroskobu kullanılarak Görüntü.
3. Histokimyasal Boyama
- Örnek hazırlama
- Açık damla inhalasyon yoluyla izofluran aşırı dozda (propilen glikol içinde% 30) ile P30-35 hayvanları öldürülür. kesilmesiyle ötenazi değerlendirmeknefes alma, kalp atışı ve Kapkaççı kısma yanıt eksikliği. IACUC kurallarına uygun olarak servikal dislokasyon ve organ, ölümü onaylayın.
- Kafatasının tabanındaki deri yoluyla kesmeden önce,% 70 etanol ile kesi yerinde cilt temizlemek, beyin kaldırmak için. % 70 etanol ile kafatası ve temiz açığa cilt geri soyma. dikkatle kafatası kesti temiz aletleri, kullanma ve beyin maruz kaldırın. membranlar çıkarın ve yavaşça kafatası boşluğuna beyin kaldırmak. PBS içinde durulayın.
- Taze OCT içeren bir gömme kalıp OCT beyin ve transfer ceket. sagital düzlem mümkün olduğunca az hareketleri kullanarak ve hava kabarcıklarının giriş kaçınarak, kesme yüzü ile paralel olacak şekilde beyin yönlendirmek. -80 ° C'de bir kuru buz / etanol banyosu ve mağaza kalıp daldırarak flaş dondurma.
- Bir Kriyostat kullanarak, 10 mikron sagital bölümleri kesmek ve önceden temizlenir slaytlar üzerinde toplamak.
<li> NADH Diaphorase Boyama - 1L-deiyonize su içinde 5.72 g Tris-HCl ve 1.66 g Tris baz çözülmesiyle, 0.05 M Tris tamponu, pH 7.6 hazırlanır. kadar altı hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.
- NADH çözeltisi (0.05 M Tris tamponu içinde 2.25 mM NADH) hazırlayın. -20 ° C'de kısım ve mağaza.
- NBT solüsyonu (0.05 M Tris tamponu içinde 2.5 mM Nitro Mavi Tetrazolyum) hazırlayın. Bir cam şişe içinde altı hafta süreyle 4 ° C'de saklayın.
- boyama çözeltisi yapma ve her bir slayt için 1 ml eklemek NADH çözeltisi ve NBT solüsyonu eşit hacimlerde bir araya getirin. 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, 37 ° C'de inkübe edin.
- Aspire boyama çözüm ve dH 2 O. ile üç defa yıkamak
- Artan ve aseton azalan konsantrasyonlarda üç kez her yıkama / dH 2 0 (% 30,% 60,% 90,% 60,% 30), oda sıcaklığında 2 dakika karıştırıldı.
- DH 2 O üç kez durulayın ve sulu ortam ile bölümleri monte edin. ışık mikroskobu kullanarak görüntü parlak f donanımlıield mikroskopi. Mavi boyama enzimatik aktiviteye karşılık gelir.
- Dehidrogenaz Histokimyasal boyanması süksinat
- 0.2 M sodyum monobazik fosfat / DH 2 O ve 0.2 M sodyum dibazik fosfat / DH 2 O hazırlanması
- 20 kısım sodyum dibazik fosfat, 3 parça monobazik fosfat birleştirilmesiyle 0.2 M fosfat tamponu, pH 7.6 sağlayın.
- boyama çözeltisi (0.1 M sodyum süksinat, 0.2 M fosfat tamponu içinde 1.25 M NBT) hazırlanması ve her bir slayt 1 ml. 60 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada, 37 ° C'de inkübe edin.
- Aspire boyama çözüm ve DH 2 O. üç defa yıkamak
- Artan üç kez her yıkama ve aseton konsantrasyonları azalan / DH 2 O (% 30,% 60,% 90,% 60,% 30), oda sıcaklığında 2 dakika karıştırıldı.
- DH 2 O üç kez durulayın ve sulu ortam ile bölümleri monte edin. Aydınlık alan mikroskobu için donatılmış bir ışık mikroskobu kullanılarak Görüntü. Mavi boyama en tekabülEnzimatik faaliyet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölüm, bu yöntemler kullanılarak elde edilebilen sonuçları örnekleri verilmektedir. arka ekstremite testinde, çekme deneme sayısı yapılmış ve gecikme her gün için iki ardışık testleri üzerinde toplanır düşmeye. . Bu test azaltılmış nöromusküler gücü HtrA2 tm1jhoh ile fareler ayırt etmek genetik olarak farklı grupları karşılaştırmak için kullanılabilir (HTRA2 KO) Şekil 1A fareler - B P4-6 bir azalma ardından düşmeye çeker ve gecikme sayısında hiçbir değişiklik göstermektedir litermatında (HTRA2 WT) ile karşılaştırıldığında, P7-10 nöromüsküler gücü bölgesi. yaş mukavemet beklenen artış, yabani tip hayvanlardaki gözlemlenebilir. sütten kesilmiş gözlem test için toplam etkinlik, test üç gün üst üste genelinde ortalama (satır yetiştirme ve olayları damat, geçilen) tüm etkinlikleri toplanmasıyla değerlendirilebilir. Alternatif olarak, olayın her özel tip individuall olabiliry analiz. Burada Örnek sonuçlar WT littermates göre HTRA2 KO farelerde düşük aktivitesi gösteren sunulmaktadır. Bu veriler, toplam aktivitesi nicel ölçüldü ve grup (Şekil 1C) arasında karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Her test gününde gerçekleştirilen üç tekrarlar günlük ortalama hesaplanarak kavrama kuvveti farklılıkları ölçmek için de mümkündür. HTRA2 KO fareler yavru kontroller ile karşılaştırıldığında, daha kısa gecikme tezahür gücü azalma (Şekil 1D) düşmeye.
Retina, H & E boyama retinal yapıyı incelenmiş ve (Şekil 2) göre edilebildiği görüntüler üretir. retina oluşturan hücre tipleri katmanları açıkça genetik gruplar arasında karşılaştırma sağlayan belirginlik. Burada, HtrA2 tm1jhoh '; HtrA3 tm1jhoh farenin HtrA2 kıyasla retina yapısında herhangi bir değişiklik gösteren
Şekil 1:. Genetik olarak farelerin davranış fenotipleme HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) farelerde (HTRA2 WT) yavru kontroller yabanitip ile kıyasla tarif davranış testi tabi tutuldu. (A - B) arka bacak süspansiyon test P4-P10 gelen WT ve KO, yenidoğanlarda gerçekleştirilen ve nöromusküler bir azalma gösterir olduKO hayvanlarda gücü (WT: n = 28, KO: n = 19). (A) KO yavrular başlangıçta WT kardeşler olarak çekme girişimleri benzer sayıda yapmak, ancak daha sonra zaman noktalarında yapılan girişimler bir düşüş göstermektedir. Düşmeye (B) KO yenidoğanlarda 'gecikme de başlangıçta normaldir ama itibaren P7 azalır. (N = 12 WT: n = 19, KO) (C) sütten kesilmiş gözlem toplam aktivite skoru, bu farelerin aktivitesi azaltılmış uyumlu WT litermatlarından karşılaştırıldığında KO hayvanlarda indirgendi. (D) KO hayvanlar da HTRA2 KO fareleri azaltılmış kavrama gücü gösteren, kafes ters test sırasında düşmeye azaltılmış gecikme vardı (WT: n = 17, KO: n = 9). Veri ortalama ± SEM temsil (# 0.1 <p <0.05, * p <0.05, ** p <bağımsız t-testi ile 0.001, *** p <0.001). Bu rakam Patterson ve ark gelen modifiye edilmiştir. 34 görüntülemek için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Şekil 2:. Retinanın H & E boyama hematoksilen ve eozin ile boyama retina bölümleri retina katmanları ortaya koymaya, yapının incelenmesini sağlar. P35 HtrA2 WT burada bölümler, HtrA3 tm1jhoh (A) ve HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (B) ekran normal retinal yapısı. RPE: retina pigment epiteli, OS: dış kesimleri, IS: iç kesimleri, onl: dış nükleer tabaka, OPL: dış pleksiform katman, INL: iç nükleer tabaka, IPL: iç pleksiform tabakası, GCL; Ganglion hücre tabakası. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil 3: Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (Nesko) ve Solunum karmaşık aktivite NADH Diaphorase (kompleks I) ve süksinat dehidrogenaz (karmaşık II) faaliyet için histokimyasal boyama P25 HtrA2 enine beyin kesitlerinde flox / flox yapıldı HtrA2 + / flox Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (NesWT) yavrular. NADH diaforaz enzim aktivitesi beyincik (Crbl, B) ve NesWT kontrol (A, C) ile karşılaştırıldığında Nesko beynin striatum (D) 'de azalmıştır, ancak değil serebral korteks (E - E). SDH aktivitesi benzer NesWT kontrollerle karşılaştırıldığında Nesko farelerin beyincik ve striatum (H, J) (G, I) azalır, ancak serebral korteks değişiklik yoktur (K - L). Ölçek çubuğu = 200 mikron. BuŞekil Patterson ve ark., 34 modifiye edilmiş bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sağlam tedaviler insan yaşlanma ile ilgili koşulları zayıflatıcı etkilerini sınırlamak için gerekli, ama onlar birçok koşulları için zor kalır. potansiyel tedavi hedefleri belirlemek ve müdahale stratejileri geliştirmek için, nedenleri ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların patolojisi ilk anlaşılmalıdır. Değil bu genler daha önce insan çalışmalarında durumuna bağlı olsa bile, söz konusu hastalığın ilgili net fenotipleri ile hemen mevcut tüm genetiği değiştirilmiş fareler. Bu nedenle daha sistematik araştırmalar gereklidir ve genetik olarak tadil edilmiş farenin insanlarda bağlantılı hastalıkların ilişkili olabilir fenotipleri tespit uygun deneylere tabi tutulmalıdır.
Sayısız davranış testleri farelerde 50,51 nörolojik fonksiyon tahlil için var. Burada özetlenen davranış testleri insan bulgular ve gerçek fenotipleri dayalı hipotez fenotipleri uygundur obseFarelerde SVEd. Buna ek olarak, bu testler davranışsal deneyler veya çok az hatta hiç deneyimi olan laboratuvarlarda gerçekleştirmek için basittir. Orada gelişmiş donanımları için bir gereklilik olduğunu ancak sonuçlar nöromüsküler kusurlar olması bekleniyor genetiği değiştirilmiş farelerin fenotipi incelerken bir ilk adım olarak faydalı hale düzgün tahsil edildikleri anlamlı ve bilgilendirici. Elde edilen veriler, daha sonra daha gelişmiş test cihazları ile potansiyel olarak daha fazla test odak yönlendirmek için kullanılabilir.
Benzer şekilde, birçok teknik dokularda 52 solunum fonksiyonunu değerlendirmek için var. ATP sentezi, oksijen tüketimi veya mitokondrial membran potansiyeli değişikliklerin hızını ölçme mitokondriyal fonksiyonun önemli okumalar vardır ama onlar karmaşık olabilir ve zaman belirli reaktifler ve ekipman 52-55 gerektiren gerçekleştirmek için alıcı. Buna ek olarak, genellikle mitochond düzeyi ile sınırlıdırRion veya hücre, kültürlü hücrelerde, lizatları veya izole mitokondri dayanarak. Histokimyasal boyama zaman veya kaynakların büyük yatırım yapmadan mitokondriyal disfonksiyon tanımlamada faydalı bir ilk adımdır. Ayrıca, doku kesitlerinde leke yeteneği kendisi ödünç hızla örneğin diğer teknikler gibi belirgin olmayabilir bölgesel farklılıkları, HtrA2 eksikliği beyinde gözlenen enzimatik boyama alanı özgü kaybı belirlenmesi için. teknik solunum kapasitesinde kat değişiklikleri ölçmek kabiliyeti sınırlı olsa da, daha sonra daha karmaşık yöntemler kullanılarak takip edilebilir tanımlanan beyin bölgeleri dışında eşler.
Bu fenotiplendirme program dahilinde sunulan teknikler yapmak için basit olmakla birlikte, düzgün bazı adımları gerçekleştirmek deneylerin başarısı için kritik öneme sahiptir. davranışsal fenotipleme için büyük özen varyasyon intro sınırlamak için her gün aynı anda ve aynı yerde yapılır testleri sağlamak için alınması gerekenkonumu yenilik veya sirkadiyen ritim farkı tarafından üretilen. Ekipman benzer nedenlerle her gün aynı şekilde organize edilmelidir. Oda kuruluş yenilik küçük değişiklikler büyük ölçüde bir fare aktivitesini etkileyebilir aktivite testi için özellikle kritiktir. kavrama gücü ölçerken, araştırmacılar fareler inversiyon önce mesh uygun yere sahip olduğunu tespit etmelidir. kısa bir gecikme düşmeye karşı Benzer şekilde, bakım çarpık olacaktır düzgün arka bacak testi veya test sonuçlarında serbest bırakmadan önce yavru askıya alınmalıdır.
Doku fenotipleme için, iyi bölümleri elde hayati önem taşımaktadır. diseksiyon veya eserler kesit ve diseksiyonu sırasında ortaya çıkan ve morfolojisi bozar önce retinanın bilgilendirici boyama etkili fiksasyon bağlıdır. Histokimyasal boyama beyinleri gerektirir enzim fonksiyonunu korumak için diseksiyon sonra hızla dondurulması, ama inkübasyon süresi benzer critica olduğunuL; sıcaklık ya da zaman uzunluğu küçük dalgalanmaları boyama yoğunluğuna farklılıklara neden olabilir. Mümkün olan yerlerde, örnekler grupları arasında karşılaştırma yapmak için, aynı zamanda işleme tabi tutulmalıdır.
Burada yaşla ilişkili hastalıklar, yani, AMD ve PD ile ilişkili ince fenotipleri göstermesi beklenmektedir genetik olarak tadil edilmiş fareler için kullanılan bir test rejimi tarif edilmiştir. Bu fenotiplendirme programı ilgi dokuların içinde yapısal ve işlevsel kusurları nöromüsküler gücü ve aktivitede açıklarını tespit yanı sıra tanımlamak için kullanılır. Bu program, genç, genetiği değiştirilmiş farelerde erken fenotipleri sistematik bir analizini sağlar. Gelecekte, bu yöntem, aynı zamanda açık bir şekilde, normal görünen etyolojisi bilinmeyen gibi, AMD veya PD ile ilgili fenotipi ile ortaya beklenen herhangi bir genetik olarak tadil edilmiş farelere de uygulanabilir. Testlerin basitlik önemli bir yatırım yapmadan test izin verir ama daha fazla s bilgilendirmek için kullanılabilirtudies. Hücresel fenotipleme ile davranışsal test birleştirerek, kullanılan farelerin sayısını sınırlamak ve doğrudan fizyolojik durumu ile hayvan performansını karşılaştırmak mümkündür. Bu fenotiplendirme programı izleyen çalışmaların odağı yönlendirmek için kullanılan bir ilk analiz sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu araştırma için finansman Rosebay Tıp Vakfı ve Yale Tıp Fakültesi Dekan Araştırma Fonu (JH) geldi. Biz davranışsal deneyler ile yardım için Dr Claire Koenig teşekkür ederim. Genetiği değiştirilmiş fare hatları Ozgene (Perth, Avustralya) oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
- Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
- Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
- Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
- Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
- Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
- Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
- Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
- Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
- Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
- Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
- Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
- Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
- Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
- Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
- Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
- Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
- Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
- Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
- Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
- Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
- Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
- Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
- Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
- Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
- Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
- Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
- Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
- Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
- Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
- Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
- Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
- Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
- Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
- Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
- Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
- Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
- Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
- Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
- Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
- Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
- Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
- El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
- Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
- Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).
