Introduction
Leeftijdsgebonden ziekten worden steeds overwegend in de moderne samenleving. Als de medische wetenschap verbetert en de levensverwachting toeneemt, de bevolking steeds ouder en de last van deze ziekten groeit. Effectieve behandelingen zijn noodzakelijk om de gevolgen van de slopende omstandigheden te verminderen, maar blijven ongrijpbaar in veel gevallen. Alleen door inzicht in de oorzaken en pathologie van ziekten die samenhangen met het ouder worden kunnen wetenschappers beginnen om potentiële therapeutische doelen strategieën te identificeren en ontwikkelen voor interventie. Frequente leeftijdsgebonden aandoeningen omvatten neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson (PD) en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD). PD is de meest voorkomende aandoening veroorzaakt door beweging neurodegeneratie bij mensen. De meeste PD patiënten vertonen symptomen zoals rust tremor, bradykinesie en stijfheid na 50 jaar. Early onset is ook waargenomen bij ongeveer 10% van de gevallen.
AMD is de belangrijkste oorzaak van blindheid bijouderen, geleidelijk beschadigen fotoreceptoren en het retinale pigmentepitheel (RPE) in het oog. Centrale visie is verminderd, maar de perifere zicht is over het algemeen niet beïnvloed. Er zijn twee vormen van AMD. In de "droge" vorm, extracellulaire eiwit deposito's bekend als drusen vorm tussen de RPE en Bruch's membraan (BM), wat leidt tot geografische atrofie en vervaging van de centrale visie. Hoe ernstiger "natte" vorm resultaten van neovascularisatie van het vaatvlies over BM in de RPE en fotoreceptorcellen lagen en kan leiden tot hamorrhaging onder de retina die permanente schade aan retinale weefsel veroorzaakt. Genome associatiestudies eerder geïdentificeerde loci die zijn geassocieerd met verhoogde gevoeligheid voor deze ziekte en die twee gebieden van belang: complement factor H (CFH) op chromosoom 1 en 10q26 locus, waarbij de leeftijdsgebonden macula degeneratie gevoeligheid 2 (ARMS2) en hoge temperatuur eis factor A1 (HtrA1) genen bevinden zich 1-5 3-6.
CFH fungeert als een negatieve regulator van de alternatieve route (AP) van het complementsysteem door remmen van de activering van C3. Een enkel nucleotide polymorfisme (SNP) is gekoppeld aan een verhoogd risico op AMD, waardoor uitwisseling van tyrosine 402 in exon 9 met histidine door een T naar C substitutie 1. AMD wordt aangenomen dat de AP misregulated door functieverlies van CFH maar of de SNP speelt een causale rol onduidelijk. Een hypothese is dat de positief geladen histidine Men denkt dat het vermogen van CFH te binden aan interagerende eiwitten C-reactief proteïne en heparine sulfaat 1,7 ontkrachten. In vitro studies CFH Y402H geven tegenstrijdige resultaten over functionele verschillen tussen de varianten, en vivo werk in <em> CFH - / - muizen die gehumaniseerd CFH is aan de gang 8. ARMS2 ligt stroomopwaarts van HtrA1 in het genoom primaten, hoewel het gen ontbreekt bij muizen. HtrA1 is een serine protease, maar ARMS2 is slecht gekarakteriseerd. De verbindingsevenwichtsafwijking tussen SNPs in de AMD-geassocieerde locus is het moeilijk om de bijdrage aan risico van individuele mutaties van de genen in deze regio te bepalen, maar recent werk heeft gesuggereerd dat het overexpressie van HtrA1 plaats ARMS2 die tot neovascularisatie en subretinale eiwit deposito's 9-11. Echter, de nabijheid van de genen in deze locus zorgen voor interacties die niet worden bestudeerd gebruikend willekeurig geplaatst transgenen.
Naast AMD is de HtrA van serine proteasen geassocieerd met vele menselijke ziekten. Alle eiwitten HtrA een serineprotease-domein gevolgd door ten minste één C-terminale PDZ-domein. HtrA1, HtrA3 en HtrA4 delen grdaarvan eet homologie bestaat uit een signaalpeptide, insuline-achtige groeifactor bindend domein, een Kazal proteaseremmer domein, het serineprotease-domein en een PDZ-domein. HtrA2 een andere N-terminus, bestaande uit een mitochondriaal lokalisatiesequentie, transmembraandomein en inhibitor van apoptose bindingsdomein gevolgd door het protease en PDZ-domeinen 12-16. HtrA1 zoogdieren wordt geregeld door substraat-geïnduceerde remodellering in de actieve plaats van het protease domein 17-20 en HtrA2 kan ook worden gemoduleerd door wisselwerking tussen het serine protease en PDZ-domeinen die proteaseactiviteit 21 onderdrukt. Interessant, heeft het PDZ-domein niet om soortgelijke regelgeving verlenen tegen HtrA3 16. De HtrA proteasen kan ook worden geregeld door extrinsieke factoren: het werd onlangs aangetoond dat er sprake is van een wettelijke interactie tussen HtrA1 en protoporfyrine 22 en HtrA2 kan worden gereguleerd door fosforylering bij activering van de p38 MAP kinaseroute in een PINK1 23 afhankelijke wijze. Het schrappen van individuele leden van de familie HtrA bij muizen is gedocumenteerd echter mechanistische effecten grotendeels onduidelijk mede door gebrek aan zichtbare fenotypen.
HtrA1 speelt een belangrijke rol in proteïne kwaliteitscontrole en misregulation of mutatie is geassocieerd met verschillende menselijke ziekten, waaronder artritis, kanker en een verhoogd risico op AMD 3,4,24-32. Verlies van HtrA2 functie in neurale weefsels is geassocieerd met PD fenotypes bij mensen en muizen, terwijl het verlies van niet-neurale weefsels leidt tot versnelde veroudering 33-37. HtrA3 ontregeling is geassocieerd met ziekten zoals pre-eclampsie en bepaalde vormen van kanker 38,39. Up-regulatie van HtrA4 waargenomen in de placenta van preëclampsie patiënten maar knockout muizen openlijk fenotype 40,41 niet weergegeven. Het gebrek aan fenotypen waargenomen bij sommige knockout muizen isverondersteld om een resultaat van de compensatie tussen de HtrA familielid: men denkt dat zowel HtrA4 en HtrA1 interactie met de TGF-B-familie van eiwitten, waardoor compensatie door HtrA1 na verwijdering van HtrA4 41. Ook wordt gedacht dat aangezien HtrA1 HtrA3 en hebben een hoge mate van homologie domein zij zullen complementaire functies 42 hebben. Er is echter gesuggereerd dat HtrA eiwitten gedeeltelijk antagonistische functies kan hebben, concurrerende gemeenschappelijke doelen 43 te regelen.
Om verder te onderzoeken deze risicofactoren drie gehumaniseerd knock-in muizen lijnen werden gegenereerd. In CFH TM1 (CFH * 9) jhoh en CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 van het CFH-gen wordt vervangen door exon 9 van de humane homoloog. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh codeert voor de niet-ziekte geassocieerd tyrosine residu op positie 402, terwijl CFH TM2 (CFH * 9) jhoh de Y402H, risico's geassocieerd SNP draagt. InARMS2 tm1jhoh het menselijk ARMS2 sequentie werd gericht op een gebied stroomopwaarts van HtrA1. Een loxP-geflankeerd STOP sequentie stroomopwaarts van de gensequentie maar stroomafwaarts van de opgenomen UbiC promoter werd uitgesneden door kruising met OzCre muizen, die Cre recombinase onder de controle van de promoter Rosa26 expressie, zoals eerder beschreven 34. Naast deze knock-in lijnen voorwaardelijke knockout allelen CFH en HtrA1 (CFH tm1jhoh en HtrA1 tm1jhoh), evenals de andere bekende HtrA familieleden werden gegenereerd: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) en HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). De kiem-lijn knockouts zijn gemaakt door kruising OzCre muizen dieren ontworpen om specifieke exons met loxP plaatsen, zodanig dat verwijdering veroorzaakt een frame shift en / of verwijdering van de actieve domein (CFH flank, exon 3, HtrA1; exons 2-3, HtrA2: exons 2-4, HtrA3; exon 3, HtrA4; Exons 4-6) 34,41. Een neuraal deletie van HtrA2, verwijderd met recombinase Cre onder controle van de promoter Nestin (HtrA2 flox, Tg (Nes-cre) 1Kln / J), is ook beschreven 34. Alleen muizen ontbreekt HtrA2, hetzij systemisch of in zenuwweefsel, weergegeven duidelijke fenotypes, presenteren met Parkinson fenotypes.
Aangezien sommige van deze genen van belang worden geponeerd worden gelokaliseerd mitochondria 11,44-47 en verwijdering van HtrA2 gegenereerd Parkinson fenotypen fenotypering een regime met een mitochondriale en neurologische focus is beschreven en representatieve resultaten van de tests van belang verricht . Om genetisch gemanipuleerde muizen geproduceerd mens, leeftijdsgebonden aandoening grondig onderzoek en systematisch werd een eerste fenotypering tijdschema die onderzoeken, die bestaat uit een reeks tests betreffende de tweeziekten van belang: AMD en Parkinson.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek statement: Studies waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Yale University.
1. Behavioral Testen van genetisch gemodificeerde muizen
Opmerking: Alle muizen worden onderworpen aan dezelfde testregeling verschillen in gewenning beperken hanteren. Dienen te worden uitgevoerd op hetzelfde tijdstip elke keer.
- Neonatale Hind Limb Test
Opmerking: De achterste ledematen test wordt dagelijks uitgevoerd van postnatale dag (P) 4 tot en met P10 tot proximale achterste ledematen spierkracht, zwakte en vermoeidheid te evalueren.- Transport muizen testgebied en laten rusten gedurende 30 minuten voor het testen.
- Bereid testinrichting door het reinigen van een 50 ml conische buis met 70% ethanol, duw twee (P4-P8) of één (P9-P10) wattenbolletjes onderaan de tUbe en vastzetten in een verticale positie.
- Verwijder een pup uit de kooi en opnemen gewicht. Blijf jong in die lade op warmte pad wanneer niet testen.
- Voorzichtig schorten de achterste ledematen van de pasgeborene over de rand van de conische buis, zodanig dat deze naar beneden in de richting van de katoenen ballen. Tel het aantal pull pogingen en meet latentie te vallen met een stopwatch.
- Herhaal dit nog een keer dan het etiket van de pup met teller. Daarna identificeren P6 pups door teen knippen. Wrijf zachtjes pups met beddengoed van huis kooi voordat u deze vervangt.
- Veeg conische buis met 70% ethanol.
- Herhaal het testen op de volgende pup totdat het hele nest is getest.
- Gooi katoenen bal en conische buis. Reinig alle apparatuur met 70% ethanol.
- Weanling Observation Test
Opmerking: De gespeende observatie test wordt dagelijks toegediend vanaf P19 naar P21 om beweging en de algemene activiteit scoren.- Transport muizen om testgebied eennd laten rusten gedurende 30 minuten voor het testen.
- Bereid Plexiglas box testen met een 6x6 rooster van vierkanten 2 inch op de basis gekenmerkt door reiniging met 70% ethanol. Opgericht videoapparatuur opzij zodanig is dat de doos in het beeldveld. Houd de set-up en omgeving hetzelfde elke dag om te voorkomen dat er nieuwigheid.
- Verwijder een gespeende uit de kooi en plaats in een schone kop houden. Record gewicht.
- Begin met video-opname door het filmen van de test identificatiekaart, met de muis identificatienummer, de leeftijd en de datum van de test. Transfer muis van met cup naar het centrum plein. Tijd voor drie minuten, het tellen van het aantal lijnen doorkruist door beide voorpoten van de muis tijdens de test.
- Terug muis om een schone kooi en end video-opname.
- Reinig het testapparaat met 70% ethanol.
- Herhaal dit totdat alle nest is getest, dan terug alle pups naar de kooi.
- Reinig alle testen van apparatuur met 70% ethanol.
- Wire Mesh Grip Strength Test
Opmerking: de grijpkracht test wordt uitgevoerd op afwisselende dagen tussen P22 en P26, neuromusculaire sterkte te beoordelen.- Transport muizen testgebied en laten rusten in kooi gedurende 30 minuten voor het testen.
- Bereid apparaat met het schoonmaken van een plexiglas doos en rooster met 70% ethanol. Plaats noppenfolie in de bodem van de doos en bedek met papier.
- Afzonderlijke muizen in groepen van drie, het plaatsen van in individueel bedrijf cups.
- Plaats eerste muis op het midden van het gaas en langzaam omkeren 10-20 cm boven het zachte oppervlak van de bodem van de doos plexiglas. Meet de latentie te vallen met een stopwatch. Beëindigen testen na 60 sec zijn verstreken als de muis niet doetvallen.
- Terug muis te houden kopje, doekje gaas met 70% ethanol en papier vervangt over de noppenfolie. Voeren de proef op de resterende twee muizen in de groep alvorens terug te keren naar de eerste. Herhaald tot elke muis werd een totaal drie keer getest.
- Zet de groep een schone kooi en verder met de resterende groepen. Als er minder dan drie muizen in elke groep, ervoor te zorgen dat een 5 min inter-proces herstel interval is toegestaan.
- Terug alle muizen naar de kooi, vervreemden papier en schone testen van apparatuur met 70% ethanol.
2. Onderzoek van netvliesstructuur
- Verdoven dieren bij P30-35 door intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). Beoordelen van de diepte van de anesthesie door knijpen de voetzool en ga alleen in het uitblijven van een antwoord, in lijn met IACUC richtlijnen. Perfuseren met 4% PFA / PBS 48.
- Om de ogen te verwijderen, de huid schoon te maken bij de incisie siTE met 70% ethanol, voor het snijden door de huid bij de basis van de schedel. Trek de huid aan de schedel en schoon met 70% ethanol bloot te leggen. Met behulp van schone instrumenten, knip voorzichtig door de schedel naar de oogkassen te bereiken en bloot de ogen. Sever de oogzenuw, voorzichtig de ogen te verwijderen uit het stopcontact en spoel in PBS.
- Fix ogen in 4% PFA / PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats ogen in een petrischaaltje met PBS. Voeg een kleine incisie in het midden van de cornea met steek verwijdering schaar. Verwijder het hoornvlies door het snijden van de rand tussen het hoornvlies en sclera. Gebruik een tang om de iris te verwijderen. Tot slot, trek het RPE lagen, waardoor het netvlies intact en de lens op zijn plaats.
Opmerking: De 4% PFA / PBS fixatie loslating van RPE waardoor de RPE gemakkelijk worden afgepeld van de buitenkant van het netvlies. - Re-fix in 4% PFA / 30% sucrose / PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, voordat de ogen van een petrischaaltje met PBS. Trek de lens behulp van een tang, waardoor het glasachtige lichaam met zich mee.
- Cryoprotect in 30% sucrose overnacht bij 4 ° C.
- Coat ogen in Optimale Cutting Temperatuur verbinding (OCT) en transfer naar een inbedding mal met vers oktober Waar zich het oog zodat het sagittale vlak evenwijdig aan het snijvlak, waarbij als weinig bewegingen mogelijk en het vermijden van de introductie van luchtbellen. Flash bevriezen door onderdompeling van de schimmel in een droog ijs / ethanol bad. Opslag blokken bij -80 ° C.
- Met behulp van een cryostaat gesneden 20 urn sagittale secties en verzamelen op vooraf gereinigd dia.
- Vlek secties met hematoxyline en eosine volgens standaardprotocollen 49. Beeld met behulp van een lichtmicroscoop uitgerust voor helder veld microscopie.
3. Histochemische kleuring
- monstervoorbereiding
- Euthanaseren dieren bij P30-35 met behulp van isofluraan overdosis (30% in propyleenglycol) via openbare druppel inademing. Beoordelen van euthanasie door de stopzettingvan de ademhaling, hartslag en het gebrek aan reactie op knijpen de voetzool. Bevestig de dood door cervicale dislocatie en het verwijderen van organen, in lijn met de IACUC richtlijnen.
- Aan de hersenen verwijderd, de huid op de incisieplaats met 70% ethanol reinigen, voor het snijden door de huid bij de basis van de schedel. Trek de huid aan de schedel en schoon met 70% ethanol bloot te leggen. Met behulp van schone instrumenten, knip voorzichtig door de schedel en naar de hersenen bloot te leggen. Verwijder de membranen en voorzichtig de hersenen uit de schedel holte. Spoel in PBS.
- Smeer de hersenen in oktober en transfer naar een inbedding mal met vers oktober Oriënteren de hersenen zodat het sagittale vlak evenwijdig aan het snijvlak, waarbij als weinig bewegingen mogelijk en het vermijden van de introductie van luchtbellen. Flash bevriezing door onderdompeling van de vorm in een droogijs / ethanol bad en bewaar bij -80 ° C.
- Met behulp van een cryostaat gesneden 10 urn sagittale secties en verzamelen op vooraf gereinigd dia.
<li> NADH diaforase kleuring - Bereid 0,05 M Tris, pH 7,6 door het oplossen van 5,72 g Tris-HCl en 1,66 g Tris base in 1L-gedemineraliseerd water. Bewaren bij 4 ° C gedurende tot zes weken.
- Bereid NADH-oplossing (2,25 mM NADH in 0,05 M Tris buffer). Aliquot en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid NBT oplossing (2,5 mM Nitro-tetrazolium in 0,05 M Tris buffer). Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal zes weken in een glazen fles.
- Combineer gelijke volumes van NADH-oplossing en NBT oplossing voor kleuroplossing te maken en voeg 1 ml aan elke dia. Incubeer bij 37 ° C in een vochtige kamer gedurende 30 minuten.
- Zuig kleuroplossing en was drie keer met dH 2 O.
- Was driemaal elk in stijgende en dalende concentraties van aceton / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel drie keer in dH 2 O en secties te monteren met waterig medium. Beeld met behulp van een lichtmicroscoop uitgerust voor helder field microscopie. Blauwkleuring overeen met enzymatische activiteit.
- Succinaatdehydrogenase Histochemische kleuring
- Bereid 0,2 M natriumfosfaat monobasisch fosfaat / dH 2 O en 0,2 M natriumfosfaat dibasisch fosfaat / dH 2 O.
- Voeg 0,2 M fosfaatbuffer, pH 7,6 door het combineren van 3 delen monobasisch fosfaat met 20 delen natrium- dibasisch fosfaat.
- Bereid kleuroplossing (0,1 M natriumsuccinaat, 1,25 M NBT in 0,2 M fosfaatbuffer) en voeg 1 ml aan elke dia. Incubeer bij 37 ° C in een vochtige kamer gedurende 60 minuten.
- Zuig kleuroplossing en was drie keer in dH 2 O.
- Was driemaal elk in stijgende en dalende concentraties van aceton / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel drie keer in dH 2 O en secties te monteren met waterig medium. Beeld met behulp van een lichtmicroscoop uitgerust voor helder veld microscopie. Blauwkleuring overeen met enzymatic activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit deel beschrijft voorbeelden van de resultaten verkregen met behulp van deze methoden. In de achterste ledematen test, het aantal pull pogingen en de latentie te vallen zijn gesommeerd over twee opeenvolgende metingen per dag. Deze test kan worden gebruikt om genetisch verschillende groepen muizen te vergelijken met verminderde neuromusculaire sterkte HtrA2 tm1jhoh onderscheiden (HtrA2 KO) muizen in Figuur 1A -. B vertoonden geen verandering in het aantal en trekt latentie vallen van P4-6 vervolgens te verlagen in neuromusculaire sterkte bij P7-10, vergeleken met nestgenoten (HtrA2 WT). De verwachte toename in kracht met de leeftijd ook waargenomen in de wildtype dieren. Voor de gespeende observatie test, kan de totale activiteit worden geëvalueerd door het optellen van alle gebeurtenissen (lijnen doorkruist, het fokken en verzorgen van evenementen), gemiddeld over de drie opeenvolgende dagen van het testen. Als alternatief kan elk specifiek type gebeurtenis individuall zijny geanalyseerd. Hier representatieve resultaten worden gepresenteerd, waaruit blijkt verminderde activiteit van HtrA2 KO muizen in vergelijking met WT nestgenoten. Deze gegevens tonen aan dat de totale activiteit kan kwantitatief worden gemeten en vergeleken in groepen (figuur 1C). Het is ook mogelijk om verschillen in knijpkracht kwantificeren door eerst een dagelijks gemiddelde van drie herhalingen uitgevoerd op elke testdag. Wanneer HtrA2 KO muizen vergeleken met littermate controles vermindering in kracht manifesteren in een kortere wachttijd dalen (figuur 1D).
H & E kleuring van de retina maakt beelden waarin netvliesstructuur kunnen worden onderzocht en vergeleken (figuur 2). De lagen van de cel types die het netvlies samen zijn duidelijk afgebakend waardoor vergelijking tussen genetische groepen. Hier, HtrA2 tm1jhoh '; HtrA3 tm1jhoh muizen tonen geen veranderingen in de structuur van het netvlies, in vergelijking met HtrA2
Figuur 1:. Behavioral fenotypering van genetisch gemanipuleerde muizen HtrA2 tm1jhoh (HtrA2 KO) muizen werden onderworpen aan de beschreven gedragstesten en vergeleken met wildtype (WT HtrA2) nestgenoot controles. (A - B) de achterpoot suspensie werd uitgevoerd op WT en KO pasgeborenen van P4-P10 en toont een verlaging van neuromusculairekracht in KO dieren (WT: n = 28, KO: n = 19). (A) KO pups aanvankelijk een vergelijkbaar aantal pull pogingen als WT broers en zussen te maken, maar laten een daling van de pogingen op latere tijdstippen. (B) KO pasgeborenen 'latency te vallen is ook in eerste instantie normaal, maar afneemt vanaf P7 verder. (C) De gespeende observatie totale activiteit score werd gereduceerd in KO dieren in vergelijking met WT nestgenoten, in overeenstemming met een verminderde activiteit van deze muizen (WT: n = 19, KO: n = 12). (D) KO dieren hadden ook een verminderde latentie in het gaas Omkering test te vallen, tonen verminderde grijpkracht van HtrA2 KO muizen (WT: n = 17, KO: n = 9). Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM (# 0,1 <p <0,05, * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,001 van onafhankelijke t-testen). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Patterson et al. 34 Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.
Figuur 2:. H & E kleuring van retina Kleuring retinale secties met hematoxyline en eosine maakt het bestuderen van de structuur, afbakening van de retinale lagen. Hier delen van P35 HtrA2 WT; HtrA3 tm1jhoh (A) en HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (B) beeldscherm normaal netvlies structuur. RPE: netvliespigmentepitheel, OS: buitenste segmenten, IS: innerlijke segmenten, ONL: buitenste nucleaire laag, OPL: buiten plexiforme laag, INL: binnenste nucleaire laag, IPL: innerlijke plexiforme laag, GCL; ganglioncellaag. Schaal bar = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 3: Respiratory complexe activiteit Histochemische kleuring voor NADH diaforase (complex I) en succinaat dehydrogenase (complex II) activiteit werd uitgevoerd op dwarse hersenen delen van P25 HtrA2 Flox / Flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (Nesko) en HtrA2 + / flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (NesWT) nestgenoten. NADH diaforase enzymactiviteit afgenomen cerebellum (Crbl, B) en striatum (D) van NESKO hersenen vergeleken met controles NesWT (A, C), maar niet in de cerebrale cortex (E - F). SDH-activiteit wordt eveneens verlaagd in cerebellum en striatum van NESKO muizen (H, J) in vergelijking met controles NesWT (G, I), maar er is geen verandering in de cerebrale cortex (K - L). Schaal bar = 200 micrometer. Dezecijfer is gewijzigd ten opzichte van Patterson et al. 34 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Robuuste behandelingen nodig om de gevolgen van de slopende aandoeningen die verband houden met menselijke veroudering te beperken, maar zij blijven ongrijpbaar voor veel aandoeningen. Om potentiële therapeutische targets te identificeren en strategieën voor interventie ontwikkelen, moet de oorzaken en pathologie van ziekten die samenhangen met veroudering eerst begrepen. Niet alle genetisch gemodificeerde muizen onmiddellijk duidelijk aanwezig met fenotypes die verband houden met de ziekte van belang, zelfs als die genen eerder zijn gekoppeld aan de toestand in humane studies. meer systematische onderzoeken Derhalve dienen en genetisch gemodificeerde muizen te onderwerpen aan geschikte experimenten fenotypes die verband kunnen houden met de geassocieerde ziekten bij de mens te identificeren.
Myriad gedragstesten bestaan neurologische functie in muizen 50,51 testen. De gedragstesten hierin uiteengezet zijn geschikt voor de hypothese fenotypes basis van menselijk bevindingen en de werkelijke fenotypen observed in muizen. Bovendien zijn deze tests zijn eenvoudig uit te voeren in laboratoria met weinig of geen ervaring in het uitvoeren gedragsexperimenten. Er is geen behoefte aan geavanceerde apparatuur, maar de resultaten zinvol en informatief juiste wijze verzameld, waardoor ze bruikbaar zijn als een eerste stap bij het onderzoek van het fenotype van genetisch gemodificeerde muizen die naar verwachting neuromusculaire afwijkingen vertonen. De resulterende gegevens kunnen vervolgens worden gebruikt om de focus van verdere tests direct, eventueel met meer geavanceerde testapparatuur.
Ook in vele technieken bestaan voor het beoordelen ademhalingsfunctie in weefsels 52. Meten van de snelheid van ATP-synthese, zuurstofverbruik of veranderingen in mitochondriale membraanpotentiaal belangrijke uitlezingen van mitochondriale functie maar kan ingewikkeld en tijdrovend om uit te voeren, waarvoor een specifieke reagentia en apparatuur 52-55. Bovendien worden ze vaak beperkt tot het niveau van de mitochondrion of cel, met een beroep op gekweekte cellen, lysaten of geïsoleerde mitochondria. Histochemische kleuring is een nuttige eerste stap in het identificeren van mitochondriale dysfunctie zonder een grote investering van tijd of middelen. Bovendien is het vermogen om weefselsecties vlek leent zich snel identificeren regionale verschillen die minder duidelijk bij andere technieken kunnen bijvoorbeeld de zone-specifieke verlies van enzymatische kleuring waargenomen in HtrA2-deficiënte hersenen. Terwijl de techniek is beperkt in zijn vermogen om veelvoudveranderingen in ademhalingscapaciteit meten, in kaart gedefinieerde hersengebieden die vervolgens kan worden uitgeoefend middels complexere.
Terwijl de gepresenteerde technieken op deze fenotypering schema is eenvoudig uit te voeren, het uitvoeren van bepaalde stappen goed is cruciaal voor het succes van de experimenten. Voor de gedrags fenotypering, moet grote zorg worden genomen om testen te waarborgen worden uitgevoerd op hetzelfde moment en op dezelfde locatie elke dag variatie intro beperkengeproduceerd door de nieuwheid van locatie of door het verschil in het circadiane ritme. De apparatuur moet op dezelfde wijze georganiseerd elke dag om soortgelijke redenen. De kamer organisatie is bijzonder kritisch voor de activiteit test, waarbij kleine veranderingen nieuwheid sterk de activiteit van de muis kan beïnvloeden. Bij het meten van de grijpkracht, moeten de onderzoekers constateren dat muizen hebben een goede greep van het gaas voor inversie. Tevens moet erop worden gelet dat de pup goed te schorsen voor het vrijgeven van de achterste ledematen testen of de testresultaten zullen worden scheefgetrokken naar een kortere wachttijd te vallen.
Voor weefsel fenotypering, het verkrijgen van goede secties is van vitaal belang. Informatieve kleuring van het netvlies is afhankelijk van effectieve fixatie vóór versnijding of artefacten tijdens het snijden en dissectie zal opstaan en verstoring van de morfologie. Histochemische kleuring vereist hersenen snel worden bevroren na de sectie op enzym functie te behouden, maar de incubatietijd is eveneens critical; kleine temperatuurschommelingen of de tijdsduur kan verschillen in kleurintensiteit veroorzaken. Waar mogelijk moeten monsters tegelijkertijd worden bewerkt om vergelijking tussen groepen mogelijk.
Hier een testregeling gebruikt om genetisch gemodificeerde muizen verwacht subtiele fenotypen geassocieerd met leeftijd gerelateerde ziekten, namelijk AMD en PD weergeven studie wordt beschreven. Dit fenotypering schema kan worden gebruikt om tekorten identificeren neuromusculaire kracht en activiteit als om structurele en functionele gebreken binnen de weefsels van belang. Dit schema biedt een systematische analyse van de vroege fenotypes bij jonge, genetisch gemanipuleerde muizen. In de toekomst kan deze methode worden gebruikt om genetisch gemodificeerde muizen wordt naar een AMD of PD-gerelateerde fenotype opleveren en die van onbekende etiologie die openlijk normaal lijken. De eenvoud van de Test kunt testen zonder grote investeringen maar kan worden gebruikt om verdere s informerentudies. Door het combineren gedragstesten met cellulaire fenotypering, is het mogelijk om het aantal muizen gebruikt beperken en is rechtstreeks vergelijken dierprestaties de fysiologische toestand. Deze fenotypering schema wordt een eerste analyse die kan worden gebruikt om de focus van latere studies leiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De financiering voor dit onderzoek kwam van Rosebay Medical Foundation en een Yale Medical School Dean's Research Fund (JH). Wij danken Dr. Claire Koenig voor hulp bij gedrags-experimenten. Genetisch gemanipuleerde muis lijnen gegenereerd op Ozgene (Perth, Australië).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
- Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
- Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
- Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
- Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
- Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
- Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
- Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
- Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
- Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
- Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
- Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
- Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
- Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
- Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
- Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
- Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
- Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
- Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
- Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
- Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
- Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
- Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
- Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
- Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
- Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
- Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
- Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
- Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
- Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
- Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
- Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
- Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
- Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
- Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
- Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
- Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
- Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
- Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
- Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
- Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
- Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
- El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
- Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
- Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).
