Introduction
Alders assosierte sykdommer blir stadig mer utbredt i moderne samfunn. Som medisinsk vitenskap forbedrer og levealderen øker, fortsetter befolkningen til alder og byrden av disse sykdommene vokser. Effektive behandlinger er nødvendige for å redusere virkningen av ødeleggende forhold, men forblir unnvikende i mange tilfeller. Bare ved å forstå årsaker og patologi av sykdommer forbundet med aldring kan forskerne begynne å identifisere potensielle terapeutiske mål og utvikle strategier for intervensjon. Vanlige aldersrelaterte forholdene omfatter nevrodegenerative lidelser som Parkinsons sykdom (PD) og aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD). PD er den mest vanlige bevegelsesforstyrrelse forårsaket av neurodegenerering hos mennesker. De fleste PD pasienter viser symptomer som hviler tremor, bradykinesi og stivhet etter 50 års alder. Tidlig debut har også blitt observert hos omtrent 10% av tilfellene.
AMD er den ledende årsak til blindhet ieldre, gradvis skadelige fotoreseptorer og retinal pigment epitel (RPE) i øyet. Central visjon er svekket, men sidesynet er generelt upåvirket. Det er to former for AMD. I "tørr" form, ekstracellulære protein innskudd kjent som drusen form mellom RPE og Bruch membran (BM), som fører til geografisk atrofi og uskarphet av sentral visjon. De mer alvorlige "våte" skjema resultater fra neovascularization fra årehinnen over BM inn RPE og fotoreseptorlidelser lag og kan føre til hamorrhaging under netthinnen som forårsaker permanent skade retinal vev. Genom brede assosiasjonsstudier har tidligere identifisert loci som er assosiert med økt mottakelighet for denne sykdommen, og identifisert to områder av interesse: komplement faktor H (CFH) på kromosom 1 og 10q26 locus, hvor aldersrelatert maculopathy mottakelighet 2 (ARMS2) og høy temperatur kravet faktor A1 (HtrA1) gener er plassert 1-5 3-6.
CFH virker som en negativ regulator av den alternative reaksjonsvei (AP) av komplementsystemet ved å hemme aktivering av C3. En enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) har vært knyttet til økt risiko for AMD, forårsaker utveksling av tyrosin 402 i exon 9 med histidin grunn av en T til C substitusjon 1. I AMD er det antatt at AP er misregulated på grunn av et tap av funksjon av CFH men om SNP spiller en kausal rolle er uklar. En hypotese er at den positivt ladede histidin er tenkt å oppheve muligheten for CFH til å bindes til proteiner i samspill C-reaktivt protein og heparinsulfat 1,7. In vitro-studier av CFH Y402H gir motstridende resultater i løpet av funksjonelle forskjeller mellom variantene, og i vivo arbeid i <em> CFH - / - mus som uttrykker humanisert CFH pågår åtte. ARMS2 befinner seg oppstrøms for HtrA1 i primat genomet, selv om genet er fraværende hos mus. HtrA1 er en serin protease men ARMS2 er dårlig karakterisert. Den koblingsulikevekt mellom SNPs i AMD-assosiert locus har gjort det vanskelig å bestemme bidrag til risiko for enkelte mutasjoner av genene i denne regionen, men nyere arbeid har foreslått at det er overekspresjon av HtrA1 snarere enn ARMS2 som fører til neovascularization og subretinal protein innskudd 9-11. Imidlertid kan nærhet av genene i denne locus tillate for interaksjoner som ikke kan studeres ved hjelp av tilfeldig satt transgener.
I tillegg til AMD, har HtrA familien av serinproteaser vært forbundet med mange menneskelige sykdommer. Alle HtrA proteiner inneholder en serin protease domene, etterfulgt av minst en C-terminal PDZ domene. HtrA1, HtrA3 og HtrA4 dele greter av homologi, som består av et signalpeptid, insulinlignende vekstfaktorbindende domene, et Kazal proteaseinhibitor domene, serin protease domene og et PDZ domene. HtrA2 har en annen N-terminal, bestående av en mitokondriell lokaliseringssekvens, transmembrandomene og inhibitor av apoptose bindende domene, etterfulgt av protease og PDZ domener 12-16. Pattedyr HtrA1 reguleres av substrat-indusert ombygging i det aktive sete av den protease domene 17-20, og HtrA2 kan også moduleres ved interaksjon mellom serin protease og PDZ domener som undertrykker proteaseaktivitet 21. Interessant, ikke PDZ domene ikke ut til å gi tilsvarende regulering til HtrA3 16. De HtrA proteaser kan også være regulert av ytre faktorer: det ble nylig demonstrert at det eksisterer en regulerende samspill mellom HtrA1 og protoporfyriner 22 og HtrA2 kan reguleres ved fosforylering ved aktivering av p38 MAP kinasebanen i en Nature1 avhengig måte 23. Slettingen av individuelle medlemmer av familien HtrA i mus er blitt dokumentert, men mekanistiske effekter for det meste er uklare delvis på grunn av mangel på synlig fenotyper.
HtrA1 spiller en viktig funksjon i protein kvalitetskontroll og dens misregulation eller mutasjon har vært forbundet med mange forskjellige humane sykdommer, inkludert artritt, cancer og en økt risiko for AMD 3,4,24-32. Tap av HtrA2 funksjon i nervevev har vært forbundet med PD-fenotyper i mennesker og mus, mens dens tap fra ikke-neurale vev resulterer i akselerert aldring 33-37. HtrA3 dysregulering har blitt assosiert med sykdommer, inkludert preeklampsi og visse typer kreft 38,39. Oppregulering av HtrA4 har blitt observert i placentas av preeklampsi pasienter, men knockout mus viser ikke en åpenlys fenotype 40,41. Mangelen på fenotyper observert hos noen knockout-mus har værtantatt å være et resultat av kompensasjon mellom HtrA familiemedlem: det er antatt at både HtrA4 og HtrA1 samhandle med TGF-B familien av proteiner, noe som åpner for erstatning etter HtrA1 ved sletting av HtrA4 41. Tilsvarende er det tenkt at siden HtrA1 og HtrA3 har en høy grad av domene homologies de kan ha ekstra funksjoner 42. Det har imidlertid vært antydet at HtrA proteiner kan ha delvis antagonistiske roller, konkurrerer om å regulere felles mål 43.
For ytterligere å undersøke disse risikofaktorene tre humanisert knock-in mus linjer ble generert. I CFH TM1 (CFH * 9) jhoh og CFH tm2 (CFH * 9) jhoh, ekson 9 av CFH genet er erstattet med ekson 9 av menneske homolog. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh koder ikke-sykdom assosiert tyrosin rest i posisjon 402, mens CFH tm2 (CFH * 9) jhoh bærer Y402H, risiko-assosiert SNP. IARMS2 tm1jhoh menneske ARMS2 sekvensen ble rettet mot en region oppstrøms HtrA1. En loxP-flankert STOP sekvens plassert oppstrøms av gensekvensen, men nedstrøms for det inkluderte UbiC promoteren ble kuttet ut av krysset til OzCre mus som uttrykker Cre rekombinase under kontroll av den Rosa26 promoteren, som tidligere beskrevet 34. I tillegg til disse knock-in linjer, ble betinget knockout alleler for CFH og HtrA1 (CFH tm1jhoh og HtrA1 tm1jhoh), samt andre kjente HtrA familiemedlemmer generert: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) og HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). De bakterie linjer knockouts ble skapt ved å krysse OzCre mus til dyr konstruert for å flankere spesifikke eksoner med loxP nettsteder, slik at sletting forårsaker en ramme skift og / eller sletting av det aktive domenet (CFH, ekson 3, HtrA1; eksoner 2-3, HtrA2: eksoner 2-4, HtrA3; ekson 3, HtrA4; eksoner 4-6) 34,41. En nevrale sletting av HtrA2, slettes med Cre rekombinase under kontroll av nestin promoter (HtrA2 FLOX, Tg (Nes-CRE) 1Kln / J), har også blitt beskrevet 34. Bare mus mangler HtrA2, enten systemisk eller i nervevev, vises klare fenotyper, presenterer med Parkinson fenotyper.
Siden noen av disse genene av interesse er hevdet å være lokalisert til mitokondriene 11,44-47, og sletting av HtrA2 generert Parkinson fenotyper, en fenotyping diett med en mitokondrie og nevrologisk fokus er beskrevet her og representative resultater fra testene av interesse er gitt . For å undersøke genetisk modifiserte mus produsert for å undersøke humant, aldersrelatert sykdom grundig og systematisk en innledende fenotyping plan etablert, som består av en serie av tester med hensyn til de to hovedsykdommer av interesse: AMD og Parkinsons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Studier med dyr ble utført i samsvar med National Institutes of Health anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Yale University.
1. Behavioral Testing av genmodifiserte mus
Merk: Alle mus skulle bli utsatt for den samme måleprogram for å begrense forskjeller i tilvenning til håndtering. Tester skal utføres på samme tid på dagen hver gang.
- Neonatal Hind Limb Test
Merk: bakben testen er gjennomført daglig fra postnatal dag (P) 4 til P10 for å evaluere proksimale hind lem muskelstyrke, svakhet og tretthet.- Transport mus til testområdet og la det hvile i 30 minutter før testing.
- Fremstille testapparaturen ved å rense et 50 ml konisk rør med 70% etanol, presser to (P4-P8), eller en (P9-P10) bomullsdotter til bunnen av tube og sikring i en vertikal stilling.
- Fjern en valp fra buret og ta opp i vekt. Hold valpen i å holde skuffen på varmeputen når ikke testing.
- Forsiktig suspen baklemmene av den nyfødte over kanten av den koniske rør, slik at den vender ned mot bomull baller. Tell antall pull forsøk gjort og tiltak ventetid for å falle ved hjelp av en stoppeklokke.
- Gjenta en gang til da merke valpen med markør. Etterpå identifisere P6 unger av tå klipping. Gni valper forsiktig med sengetøy fra hjemmet buret før du bytter.
- Tørk konisk tube med 70% etanol.
- Gjenta testing på neste valp før hele kullet er blitt testet.
- Kast bomullsdott og konisk tube. Alt utstyr med 70% etanol.
- Weanling Observasjon Test
Merk: weanling observasjon test administreres daglig fra P19 til P21 å score bevegelse og generell aktivitetsnivå.- Transport mus til testing området ennd tillates å hvile i 30 minutter før testing.
- Forbered Pleksiglass testing boksen som er merket med en 6x6 rutenett av 2 tommers firkanter på basen ved å rense med 70% etanol. Sett opp videoutstyr til siden slik at hele boksen er i synsfeltet. Hold satt opp og omgivelser samme hver dag for å unngå å introdusere nyhet.
- Fjern en weanling fra buret og legg i en ren koppen. Vanlig vekt.
- Begynn videoopptak ved å filme testen legitimasjon med musen identifikasjonsnummer, alder og dato for testing. Overfør musen fra å holde koppen til sentrum torget. Tid i tre minutter, å telle antallet av linjer som gjennomtrenges av begge forlabbene i mus i løpet av testen.
- Returner mus til et rent bur og slutten videoopptak.
- Rens testapparatet med 70% etanol.
- Gjenta til alt kullet blir testet, og deretter returnere alle valpene til hjemmeburet.
- Clean all testing utstyr med 70% etanol.
- Wire Mesh Grip Styrke Test
Merk: grep styrke testen er gjennomført på alternative dager mellom P22 og P26, å vurdere nevromuskulær styrke.- Transport mus til testing området og la det hvile i hjemmet buret i 30 minutter før testing.
- Forbered apparatet ved å rense en pleksiglass boks og mesh grid med 70% etanol. Plasser bobleplast i bunnen av boksen og dekk til med papir.
- Separate mus i grupper på tre, plassere i enkelte holde kopper.
- Plasser første mus på midten av netting og langsomt invertere 10-20 cm over myk overflate i bunnen av pleksiglass boksen. Mål ventetid for å falle ved hjelp av en stoppeklokke. Avslutt testing etter 60 sekunder er gått hvis musa ikkefalle.
- Returner musen til å holde koppen, tørk mesh med 70% etanol og erstatte papir over bobleplast. Gjennomføre testen på de resterende to mus i gruppen før du går tilbake til det første. Gjenta til hver mus har blitt testet i et totalt tre ganger.
- Returner gruppen til et rent bur og fortsette med gjenværende gruppene. Hvis det er færre enn tre mus i en gruppe, at en 5 min inter-rettssaken utvinning intervallet er tillatt.
- Returner alle mus til hjemmet buret, kast papir og ren testing av utstyr med 70% etanol.
2. Undersøkelse av retinal struktur
- Bedøver dyrene på P30-35 ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Vurdere anestesidybden ved å knipe fotbladet og fortsetter bare i fravær av en respons, i tråd med IACUC retningslinjer. Perfuse med 4% PFA / PBS 48.
- For å fjerne øynene, rengjør huden på snittet site med 70% etanol, før skjæring gjennom huden på undersiden av hodeskallen. Skrelle tilbake huden å eksponere skallen og ren med 70% etanol. Ved hjelp av rene instrumenter, må du kutte gjennom skallen for å nå øyehulene og utsette øynene. Sever synsnerven, forsiktig fjerne øyet fra stikkontakten og skyll i PBS.
- Feste øyne i 4% PFA / PBS i 10 min ved romtemperatur.
- Plasser øyne i en liten petriskål inneholdende PBS. Lag et lite snitt i midten av hornhinnen ved hjelp av sting fjerning saks. Fjern hornhinnen ved å kutte kanten mellom hornhinnen og sclera. Bruk pinsett til å fjerne iris. Endelig løsner RPE lag, forlater netthinnen intakt og linsen på plass.
Merk: 4% PFA / PBS fiksering vil føre RPE løsgjøring åpner for RPE å være lett skrelles fra utsiden av netthinnen. - Re-fix i 4% PFA / 30% sukrose / PBS i 15 min ved romtemperatur før retur øyet til en petriskål inneholdende PBS. Trekk ut lens ved hjelp av tang, og bringer den glasslegeme sammen med den.
- Cryoprotect i 30% sukrose over natten ved 4 ° C.
- Coat øyne i Optimum Cutting Temperatur forbindelse (OCT) og overføring til en embedding mugg inneholder frisk oktober. Orientere øyet slik at det sagittale plan er parallelt med skjæreflaten ved hjelp av så få bevegelser som mulig og å unngå innføring av luftbobler. Flash fryse ved å dyppe formen i en tørris / etanol-bad. Oppbevar blokker ved -80 ° C.
- Ved hjelp av en cryostat, kuttet 20 mikrometer sagittal seksjoner og samle på forvasket lysbilder.
- Flekke seksjoner med hematoxylin og eosin henhold til standard protokoller 49. Bilde ved hjelp av et lysmikroskop utstyrt for lyse felt mikroskopi.
3. histochemical Farging
- Prøvepreparering
- Avlive dyr på P30-35 bruker isofluran overdose (30% i propylenglykol) via åpen dråpe innånding. Vurdere dødshjelp ved opphørav pust, hjerterytme og mangel på respons på klyping fotbladet. Bekreft døden ved halshugging og organfjerning, i tråd med IACUC retningslinjer.
- For å fjerne hjernen, rengjør huden på innsnitt området med 70% etanol, før du skjærer gjennom huden i bunnen av hodeskallen. Skrelle tilbake huden å eksponere skallen og ren med 70% etanol. Bruk rene instrumenter, nøye skjære gjennom skallen og fjern for å avsløre hjernen. Fjern membraner, og fjern forsiktig hjernen fra skallen hulrom. Skyll i PBS.
- Coat hjernen i oktober og overføring til en embedding mugg inneholder frisk oktober Orientere hjernen slik at det sagittale plan er parallelt med skjæreflaten ved hjelp av så få bevegelser som mulig og å unngå innføring av luftbobler. Flash fryse ved å dyppe formen i et tørris / etanol bad og oppbevares ved -80 ° C.
- Ved hjelp av en cryostat, kuttet 10 mikrometer sagittal seksjoner og samle på forvasket lysbilder.
<li> NADH Diaforase Farging - Forbered 0,05 M Tris-buffer, pH 7,6 ved å oppløse 5,72 g Tris-HCl og 1,66 g Tris-base i 1L-deionisert vann. Oppbevar ved 4 ° C i opptil seks uker.
- Forbered NADH løsning (2,25 mM NADH i 0,05 M Tris buffer). Delmengde og oppbevares ved -20 ° C.
- Fremstille NBT-løsning (2,5 mM Nitro-blå Tetrazolium i 0,05 M Tris-buffer). Oppbevar ved 4 ° C i opp til seks uker i en glassflaske.
- Bland like mengder NADH løsning og NBT løsning for å gjøre fargeløsning og tilsett 1 ml til hvert lysbilde. Inkuber ved 37 ° C i et fuktet kammer i 30 min.
- Aspirer fargeløsning og vask tre ganger med dH 2 O.
- Vask tre ganger hver i stigende og synkende konsentrasjoner av aceton / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) i 2 minutter ved romtemperatur.
- Skyll tre ganger i dH 2 O og montere delene sammen med vandig medium. Bilde ved hjelp av et lysmikroskop utstyrt for lyse field mikroskopi. Blåfarging svarer til enzymatisk aktivitet.
- Succinatdehydrogenase histochemical Farging
- Forbered 0,2 M natrium enverdig fosfat / dH 2 O og 0,2 M natrium dibasisk fosfat / dH 2 O.
- Gjør 0,2 M fosfatbuffer, pH 7,6 ved å blande 3 deler monobasisk fosfat med 20 deler natrium dibasisk fosfat.
- Forbered fargeløsning (0,1 M natrium succinate, 1,25 M NBT i 0,2 M fosfatbuffer) og tilsett 1 ml til hvert lysbilde. Inkuber ved 37 ° C i et fuktet kammer i 60 min.
- Aspirer fargeløsning og vask tre ganger i dH 2 O.
- Vask tre ganger hver i stigende og synkende konsentrasjoner av aceton / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) i 2 minutter ved romtemperatur.
- Skyll tre ganger i dH 2 O og montere delene sammen med vandig medium. Bilde ved hjelp av et lysmikroskop utstyrt for lyse felt mikroskopi. Blåfarging tilsvarer enzymatic aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen beskriver eksempler på resultater som kan oppnås ved hjelp av disse metoder. I bakbenet test, antall trekk forsøk gjort og ventetid for å falle blir summert over to påfølgende tester for hver dag. Denne testen kan anvendes for å sammenligne genetisk forskjellige grupper for å skille mus med redusert nevromuskulær styrke HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) mus i Figur 1A -. B viser ingen endring i antall trekker og ventetid for å falle fra P4-6 etterfulgt av en reduksjon i neuromuskulær fasthet ved P7-10, sammenlignet med kullsøsken (HTRA2 WT). Den forventede økningen i styrke med alderen er også observerbar i villtype dyr. For weanling observasjon test, kan total aktivitet evalueres ved å summere alle hendelser (linjer krysset, stell og pleie hendelser), i gjennomsnitt over tre dager med testing. Alternativt kan hver bestemt type hendelse være individually analysert. Her representative resultater presenteres, viser redusert aktivitet av HTRA2 KO mus sammenlignet med WT kullsøsken. Disse data viser at total aktivitet kan kvantitativt måles og sammenlignes på tvers av gruppene (figur 1C). Det er også mulig å kvantifisere forskjeller i gripestyrke ved å beregne en daglig gjennomsnitt fra de tre gjentakelser utført på hver testdag. Når HTRA2 KO mus sammenlignet med kull kontroller, til reduksjoner i styrke manifest i en kortere ventetid falle (figur 1D).
H & E farging av retina genererer bilder hvor retinal strukturen kan bli undersøkt og sammenlignet (figur 2). Lagene av celletyper som komponerer netthinnen er klart avgrenset slik sammenligning mellom genetiske grupper. Her HtrA2 tm1jhoh '; HtrA3 tm1jhoh mus viser ingen endringer i netthinnens struktur, sammenlignet med HtrA2
Fig. 1: Behavioral fenotyping av genetisk modifiserte mus HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) mus ble utsatt for den beskrevne adferdstesting og sammenlignet med villtype (WT) HTRA2 littermate kontroller. (A - B) bakben suspensjonstest ble utført på WT og KO nyfødte fra P4-P10 og viser en reduksjon i nevromuskulærstyrke i KO dyr (WT: n = 28, KO: n = 19). (A) KO valper i utgangspunktet lage et tilsvarende antall pull forsøk som WT søsken, men viser en nedgang i forsøk gjort på senere tidspunkter. (B) KO nyfødte 'ventetid for å falle er også utgangspunktet normalt, men reduseres fra P7 og utover. (C) Den weanling observasjonen total poengsum aktivitet ble redusert i KO dyr sammenlignet med WT littermates, i samsvar med redusert aktivitet av disse mus (WT: n = 19, KO: n = 12). (D) KO dyrene hadde også en redusert ventetid for å falle i løpet av maske inversjon testen, viser redusert gripestyrke av HTRA2 KO-mus (WT: n = 17, KO: n = 9). Data representerer gjennomsnitt ± SEM (# 0.1 <p <0,05, * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,001 av uavhengige t-tester). Dette tallet har blitt forandret fra Patterson et al. 34 Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.
Figur 2:. H & E farging av netthinnen Farging netthinnens seksjoner med hematoxylin og eosin tillater undersøkelse av strukturen, opptegning av netthinnens lag. Her seksjoner fra P35 HtrA2 WT, HtrA3 tm1jhoh (A) og HtrA2 tm1jhoh, HtrA3 tm1jhoh (B) vise normal retinal struktur. RPE: retinal pigment epitel, OS: ytre segmenter, IS: indre segmenter, onl: ytre kjernelaget, OPL: ytre plexiform lag, INL: indre kjernefysiske lag, IPL: indre plexiform lag, GCL; ganglion celle laget. Scale bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
. Figur 3: Åndedretts kompleks aktivitet histochemical farging for NADH diaforase (kompleks I) og succinatdehydrogenase (kompleks II) aktivitet ble utført på tverrgående hjerne deler av P25 HtrA2 FLOX / FLOX, Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (NesKO) og HtrA2 + / FLOX, Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (NesWT) kullsøsken. NADH diaforase enzymaktiviteten er redusert i cerebellum (Crbl, B) og striatum (D) av NesKO hjernen sammenlignet med kontroller NesWT (A, C), men ikke i cerebral cortex (E - F). SDH-aktiviteten er tilsvarende redusert i lillehjernen og striatum fra NesKO mus (H, J) i forhold til NesWT kontroller (G, I), men det er ingen endring i cerebral cortex (K - L). Scale bar = 200 mikrometer. DetteFiguren har blitt forandret fra Patterson et al. 34 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Robuste behandlinger er nødvendig for å begrense virkningen av ødeleggende forhold knyttet til menneskelig aldring, men de forblir unnvikende for mange forhold. For å identifisere potensielle terapeutiske mål og utvikle strategier for intervensjon, må årsaker og patologi av sykdommer knyttet til aldring først bli forstått. Ikke alle genetisk modifiserte mus umiddelbart til stede med klare fenotyper som er relatert til sykdommen av interesse, selv om disse genene har blitt koblet til den tilstand i humane studier. Derfor mer systematiske undersøkelser er nødvendig og genetisk modifiserte mus skulle bli utsatt for hensiktsmessige eksperimenter for å identifisere fenotyper som kan være relatert til de assosierte sykdommer hos mennesker.
Myriad atferdstester finnes for å analysere nevrologisk funksjon i mus 50,51. Atferdstester skissert her er egnet til de hypoteser fenotyper basert på menneskelige funn og selve fenotyper observed i mus. I tillegg er disse testene er enkel å utføre i laboratorier med liten eller ingen erfaring i å gjennomføre atferdsmessige eksperimenter. Det er ingen krav til avansert utstyr, men resultatene er meningsfulle og informative når riktig samlet, noe som gjør dem nyttige som et første skritt i å undersøke fenotypen av genmodifiserte mus som forventes å ha nevromuskulære defekter. De resulterende data kan så benyttes til å styre fokus for ytterligere testing, eventuelt med mer avansert testapparat.
Tilsvarende mange teknikker finnes for å vurdere lungefunksjon i vev 52. Å måle frekvensen av ATP-syntese, oksygenforbruk eller endringer i mitokondriemembranpotensialet er viktige avlesninger mitokondriell funksjon, men de kan være komplisert og tidkrevende å utføre, krever spesifikke reagenser og utstyr 52-55. I tillegg er de ofte begrenset til nivået for den mitochondRion eller celle, avhengig av dyrkede celler, lysatene eller isolerte mitokondrier. Histokjemisk farging er et nyttig første skritt i å identifisere mitokondriell dysfunksjon uten en stor investering av tid eller ressurser. Videre er evnen til å sette flekker på vevssnittene egner seg for raskt å identifisere regionale forskjeller som ikke nødvendigvis er like uttalt med andre teknikker, for eksempel det område-spesifikke tap av enzymatisk farging observert i HtrA2-mangelfull hjernen. Mens teknikken er begrenset i sin evne til å måle brette forandringer i luftkapasitet, maps det ut definerte områder av hjernen som deretter kan forfølges ved hjelp av mer kompliserte metoder.
Mens de teknikkene som presenteres i denne fenotyping planen er enkle å gjennomføre, utføre visse skritt på riktig måte er avgjørende for å lykkes i forsøkene. For de atferdsmessige fenotyping, må det utvises stor forsiktighet for å sikre at testene er utført på samme tid og på samme sted hver dag for å begrense variasjonen introsert ved nyheten av plassering eller ved forskjellen i døgnrytmen. Utstyret bør organiseres på samme måte hver dag av lignende årsaker. Rommet organisasjonen er spesielt kritisk for aktiviteten test, der små endringer i nyhet i stor grad kan påvirke aktivitet av musen. Ved måling grep styrke, bør etterforskerne konstatere at mus har en skikkelig tak i mesh før inversjon. Likeledes må man sørge for å riktig utsette valpen før du slipper i bakbenet test eller testresultatene vil bli skjevt mot en kortere ventetid for å falle.
For vev fenotyping, oppnå gode deler er viktig. Informativ farging av netthinnen er avhengig av effektiv fiksering før disseksjon eller gjenstander vil oppstå under seksjonering og disseksjon og forvrenge morfologi. Histokjemisk farging krever hjerner som skal fryses raskt etter disseksjon for å bevare enzym funksjon, men den inkubasjonstiden er likeledes critical; små svingninger i temperatur eller i hvor lang tid kan føre til forskjeller i fargeintensitet. Der det er mulig, bør prøvene behandles samtidig for å tillate sammenligning mellom gruppene.
Her et måleprogram som brukes til å studere genmodifiserte mus som forventes å vise subtile fenotyper assosiert med aldersrelaterte sykdommer, nemlig AMD og PD, er beskrevet. Dette fenotyping tidsplanen kan brukes til å identifisere underskudd på neuromuskulær styrke og aktivitet, så vel som å identifisere strukturelle og funksjonelle defekter i vev av interesse. Denne planen gir en systematisk analyse av tidlige fenotyper hos unge, genetisk forandret mus. I fremtiden kan denne metoden brukes på alle genmodifiserte mus som forventes å presentere med en AMD eller PD relatert fenotype, samt de av ukjent etiologi som vises åpenlyst normal. Enkelheten av testene tillater testing uten betydelig investering, men kan brukes til å informere ytterligere studies. Ved å kombinere adferdstesting med cellulær fenotyping, er det mulig å begrense antallet av mus som brukes og direkte sammenligne dyr ytelse med den fysiologiske tilstand. Denne fenotyping plan gir en innledende analyse som kan brukes til å dirigere fokus for påfølgende studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Midler til denne forskningen kom fra Rosebay Medical Foundation og en Yale Medical School Dean Research Fund (JH). Vi takker Dr. Claire Koenig for hjelp med atferdseksperimenter. Genmanipulerte mus linjer ble generert på Ozgene (Perth, Australia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
- Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
- Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
- Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
- Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
- Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
- Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
- Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
- Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
- Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
- Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
- Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
- Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
- Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
- Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
- Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
- Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
- Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
- Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
- Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
- Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
- Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
- Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
- Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
- Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
- Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
- Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
- Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
- Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
- Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
- Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
- Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
- Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
- Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
- Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
- Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
- Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
- Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
- Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
- Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
- Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
- Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
- El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
- Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
- Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).
