Introduction
Alder-associerede sygdomme bliver mere og mere udbredt i det moderne samfund. Som lægevidenskaben forbedrer og levetiden stiger, fortsætter befolkningen alder og byrden af disse sygdomme vokser. Effektive behandlinger er nødvendige for at mindske virkningerne af invaliderende betingelser, men forblive undvigende i mange tilfælde. Kun ved at forstå årsagerne til og patologi af sygdomme forbundet med aldring kan forskerne begynde at identificere potentielle terapeutiske mål og udvikle strategier for intervention. Fælles aldersrelaterede tilstande indbefatter neurodegenerative lidelser, såsom Parkinsons sygdom (PD) og aldersrelateret maculadegeneration (AMD). PD er den mest almindelige bevægelse lidelse forårsaget af neurodegeneration i mennesker. De fleste PD patienter viser symptomer såsom hvile rysten, bradykinesi og stivhed efter 50 års alderen. Tidlig debut er også blevet observeret hos ca. 10% af tilfældene.
AMD er den hyppigste årsag til blindhed hosældre, gradvis skader fotoreceptorer og retinale pigment epitel (RPE) i øjet. Centrale syn forringes men perifere syn er generelt upåvirket. Der er to former af AMD. I "tørre" form ekstracellulære protein indskud kendt som drusen formular mellem RPE og Bruchs membran (BM), hvilket fører til geografisk atrofi og sløring af det centrale syn. De mere alvorlige "våde" formularresultater fra neovaskularisering fra årehinden tværs BM ind RPE og fotoreceptor lag og kan føre til hamorrhaging under nethinden, der forårsager permanent skade på retinalt væv. Genome sammenslutning undersøgelser har tidligere identificeret loci, der er forbundet med forøget modtagelighed for denne sygdom og identificeret to regioner af interesse: komplement faktor H (CFH) på kromosom 1 og 10q26-locuset, hvor aldersrelateret makulopati modtagelighed 2 (ARMS2) og høj temperatur krav faktor A1 (HtrA1) gener er placeret 1-5 3-6.
CFH fungerer som en negativ regulator af det alternative forløb (AP) af komplementsystemet ved at inhibere aktiveringen af C3. En enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) er blevet forbundet med øget risiko for AMD, forårsager udveksling af tyrosin 402 i exon 9 med histidin på grund af en T til C substitution 1. I AMD menes det, at AP er misregulated grund af et tab af funktion af CFH men om SNP spiller en kausal rolle er uklar. En hypotese er, at den positivt ladede histidin menes at negere evne CFH til at binde til interagerende proteiner C-reaktivt protein og heparin sulfat 1,7. In vitro undersøgelser af CFH Y402H give modstridende resultater i løbet funktionelle forskelle mellem varianter, og i vivo arbejde i <em> CFH - / - mus, der udtrykker humaniseret CFH er i gang 8. ARMS2 ligger opstrøms for HtrA1 i primat genom, skønt genet er fraværende hos mus. HtrA1 er en serinprotease men ARMS2 er dårligt karakteriseret. Den bindingsuligevægt mellem SNP'er i AMD-associeret locus har gjort det vanskeligt at bestemme bidragene til risiko for individuelle mutationer af generne i denne region, men nyligt arbejde har antydet, at det er overekspression af HtrA1 stedet ARMS2 som fører til neovaskularisering og subretinal protein indskud 9-11. den tætte nærhed af generne i dette locus, kan dog tillade for interaktioner, der ikke kan studeres under anvendelse tilfældigt indsatte transgener.
Foruden AMD har HtrA familien af serinproteaser blevet forbundet med mange humane sygdomme. Alle HtrA proteiner indeholder en serinprotease domæne efterfulgt af mindst én C-terminalt PDZ-domæne. HtrA1, HtrA3 og HtrA4 deler grspiser homologi, der består af et signalpeptid, insulin-lignende vækstfaktor bindende domæne, en Kazal proteaseinhibitor domæne, serinproteasedomænet og en PDZ-domæne. HtrA2 har en forskellig N-terminal, som består af et mitokondrisk lokaliseringssekvens, transmembrandomænet og inhibitor af apoptose bindingsdomæne efterfulgt af protease- og PDZ-domæner 12-16. Mammal HtrA1 reguleres af substrat-induceret remodellering i det aktive sted i sit proteasedomæne 17-20, og HtrA2 kan også moduleres ved vekselvirkning mellem serinproteasen og PDZ-domæner, der undertrykker proteaseaktivitet 21. Interessant, har PDZ-domænet ikke ud til at give lignende regulering til HtrA3 16. HtrA proteaser kan også reguleres ved ydre faktorer: det for nylig blev vist, at der eksisterer en regulerende samspil mellem HtrA1 og protoporphyriner 22 og HtrA2 kan reguleres ved phosphorylering ved aktivering af p38 MAP-kinasepathway i en Pink1-afhængig måde 23. Sletningen af enkelte medlemmer af HtrA familien i mus er blevet dokumenteret, men mekanistiske effekter meste er uklare dels på grund af mangel på synlige fænotyper.
HtrA1 spiller en vigtig funktion i protein kvalitetskontrol og dens fejlagtig regulering eller mutation er blevet associeret med mange forskellige humane sygdomme, herunder arthritis, cancer og en øget risiko for AMD 3,4,24-32. Tab af HtrA2 funktion i neurale væv er blevet associeret med PD fænotyper hos mennesker og mus, mens dens tab fra ikke-neurale væv resulterer i accelereret ældning 33-37. HtrA3 dysregulering er blevet forbundet med sygdomme, herunder præeklampsi og visse former for kræft 38,39. Opregulering er blevet observeret af HtrA4 i placenta af præeklampsi patienter, men knockout-mus ikke vise en åbenlys fænotype 40,41. Manglen på fænotyper observeret hos nogle knockout-mus har væretpostuleret at være et resultat af kompensation mellem HtrA familiemedlem: det menes, at både HtrA4 og HtrA1 interagere med TGF-B familie af proteiner, der giver mulighed for erstatning HtrA1 ved sletning af HtrA4 41. Tilsvarende er det, at da HtrA1 og HtrA3 har en høj grad af domænenavne homologier de måtte have supplerende funktioner 42. Det er imidlertid blevet foreslået, at HtrA proteiner kan have delvis antagonistiske roller, konkurrerer om at regulere fælles mål 43.
For yderligere at undersøge disse risikofaktorer tre humaniseret knock-in mus linjer blev genereret. I CFH TM1 (CFH * 9) jhoh og CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 i CFH genet er erstattet med exon 9 i humane homolog. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh koder for ikke-sygdom forbundet tyrosin rest ved position 402, mens CFH TM2 (CFH * 9) jhoh bærer Y402H, risiko-associeret SNP. IARMS2 tm1jhoh den menneskelige ARMS2 sekvens blev målrettet til en region opstrøms for HtrA1. En loxP-flankeret STOP sekvens placeret opstrøms for genet sekvens, men nedstrøms for den medfølgende Brancheorganisationer promotoren blev udskåret ved at krydse til OzCre mus, som udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af den Rosa26 promotoren, som tidligere beskrevet 34. Ud over disse knock-i linjer, blev betingede knockout alleler for CFH og HtrA1 (CFH tm1jhoh og HtrA1 tm1jhoh), samt de andre kendte HtrA familiemedlemmer genereret: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) og HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). De kim-line knockouts blev skabt ved at krydse OzCre mus til dyr manipuleret til at flankere specifikke exons med loxP sites, således at sletning forårsager en ramme skift og / eller sletning af det aktive domæne (CFH, exon 3, HtrA1; exon 2-3, HtrA2: exoner 2-4, HtrA3; exon 3, HtrA4; exonerne 4-6) 34,41. En neurale sletning af HtrA2, slettes ved hjælp Cre rekombinase under kontrol af Nestin promotor (HtrA2 FLOX, Tg (Nes-CRE) 1Kln / J), er også blevet beskrevet 34. Kun mus, der manglede HtrA2, enten systemisk eller i neurale væv, viste klare fænotyper, præsenterer sig med Parkinson fænotyper.
Da nogle af disse gener af interesse postuleret at være lokaliseret til mitokondrier 11,44-47, og sletning af HtrA2 genereret Parkinson fænotyper, en fænotype regime med en mitokondrie og neurologisk fokus beskrives her og repræsentative resultater fra test af interesse leveres . For at undersøge gensplejsede mus produceret til at undersøge menneskelige, aldersrelaterede sygdomme grundigt og systematisk en indledende fænotypebestemmelse tidsplan blev etableret, bestående af en række forsøg vedrørende de to vigtigstesygdomme af interesse: AMD og Parkinsons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Undersøgelser, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health ™ anbefalinger i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Yale University.
1. Behavioral Test af genetisk modificerede mus
Bemærk: Alle mus bør underkastes den samme test regimen at begrænse forskelle i tilvænning til håndtering. Tests skal udføres på samme tidspunkt af dagen hver gang.
- Neonatal Hind Limb Test
Bemærk: Den bagben Testen udføres dagligt fra postnatal dag (P) 4 til P10 for at evaluere proksimale bagben muskelstyrke, svaghed og træthed.- Transport mus til testområde og lad det hvile i 30 minutter før testning.
- Forbered testapparat ved at rense en 50 ml konisk rør med 70% ethanol, skubber to (P4-P8) eller en (P9-P10) vatkugler til bunden af tUbe og sikring i en lodret position.
- Fjern en hvalp fra buret og optage vægt. Hold hvalp i at holde bakke på varmepude, når ikke at afprøve.
- Forsigtigt suspendere bagbenene af den nyfødte over randen af den koniske rør, således at den vender nedad mod vatkugler. Tæl antallet af pull forsøg og foranstaltning latenstid til at falde ved hjælp af et stopur.
- Gentag en gang mere derefter mærke hvalpen med markør. Bagefter identificere P6 hvalpe ved tå klipning. Gnid hvalpe forsigtigt med strøelse fra hjemmet bur før udskiftning.
- Tør konisk rør med 70% ethanol.
- Gentag test på næste hvalp indtil hele kuldet er blevet testet.
- Bortskaf vat og konisk rør. Afrense alt udstyr med 70% ethanol.
- Weanling Observation Test
Bemærk: Weanling observation test administreres dagligt fra P19 til P21 for at score bevægelse og generelle aktivitetsniveau.- Transport mus til testområde ennd lad det hvile i 30 min før testning.
- Forbered plexiglas test boksen med en 6x6 gitter af 2 tomme firkanter på basen ved rensning med 70% ethanol. Opsæt videoudstyr til den side, således at hele kassen er i synsfeltet. Hold oprettet og omgivelser det samme hver dag, for at undgå at indføre nyhed.
- Fjern en Weanling fra buret og sted i en ren bedrift cup. Optag vægt.
- Begynd videooptagelse ved at filme testen identifikationskort, med identifikation mus nummer, alder og dato for test. Overfør musen fra at holde kop til centrum pladsen. Tid i tre minutter, tælle antallet af strækninger, der gennemkøres af begge forpoter af muse under testen.
- Retur musen til et rent bur og ende videooptagelse.
- Rengør testapparatet med 70% ethanol.
- Gentag indtil alle kuld testes, derefter returnere alle hvalpe til hjemmet bur.
- Rengør alle test udstyr med 70% ethanol.
- Trådnet Gribestyrke Test
Bemærk: gribestyrke test udføres hver anden dag mellem P22 og P26, at vurdere neuromuskulære styrke.- Transport mus til testområde og lad dem hvile i hjemmet bur i 30 min før testning.
- Forbered apparat ved at rense en plexiglas kasse og mesh gitter med 70% ethanol. Placer bobleplast i bunden af kassen og dække med papir.
- Separate mus i grupper på tre, placere i individuelle holding kopper.
- Placer første mus på midten af trådnettet og langsomt invertere 10-20 cm over den bløde overflade i bunden af plexiglas kasse. Mål latenstiden til at falde ved hjælp af et stopur. Afslut test efter 60 sek er gået, hvis musen ikkefalde.
- Retur musen til at holde kop, Udvisk mesh med 70% ethanol og erstatte papiret over bobleplast. Gennemføre testen på de resterende to mus i gruppen før han vendte tilbage til den første. Gentag, indtil hver mus er testet i alt tre gange.
- Retur gruppen til et rent bur og fortsætte med de resterende grupper. Hvis der er færre end tre mus i enhver gruppe, sikre, at en 5 min inter-trial opsving interval er tilladt.
- Retur alle mus til hjemmet bur, bortskaffe papir og ren testudstyr med 70% ethanol.
2. Undersøgelse af nethindestruktur
- Bedøve dyr ved P30-35 ved intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Vurdere anæstesidybden ved at knibe trædepuden og fortsæt kun i mangel af et svar, på linje med IACUC retningslinjer. Perfundere med 4% PFA / PBS 48.
- For at fjerne øjnene, rense huden på snittet site med 70% ethanol, inden der skæres gennem huden ved basis af kraniet. Skrælle huden for at blotlægge kraniet og ren med 70% ethanol. Brug rene instrumenter, forsigtigt skære gennem kraniet for at nå de øjenhuler og eksponere øjnene. Sever synsnerven, forsigtigt fjerne øjet fra stikkontakten og skyl i PBS.
- Fix øjne i 4% PFA / PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Placer øjne i en lille petriskål indeholdende PBS. Lave et lille snit i midten af hornhinden ved anvendelse af søm fjernelse saks. Fjern hornhinden ved at skære kanten mellem hornhinden og sclera. Brug pincet til at fjerne iris. Endelig skrælle RPE lag, der forlader nethinden intakt og linsen på plads.
Bemærk: 4% PFA / PBS fiksering vil forårsage RPE frigørelse tillader RPE at den let kan skrælles fra kanten af nethinden. - Re-fix i 4% PFA / 30% saccharose / PBS i 15 minutter ved stuetemperatur før returnering øjet til en petriskål indeholdende PBS. Træk LENs med pincet, hvilket bringer det glaslegeme sammen med den.
- Cryoprotect i 30% saccharose natten over ved 4 ° C.
- Coat øjne i Optimal Cutting Temperatur forbindelse (OLT), og overførsel til en indlejring støbeform indeholder frisk OLT. Orientere øjet, således at det sagittale plan er parallelt med skærefladen, bruge så få bevægelser som muligt og undgå indføring af luftbobler. Flash fryse ved neddypning af formen i et tøris / ethanol-bad. Opbevar blokke ved -80 ° C.
- Ved hjælp af en kryostat, skæres 20 um sagittale sektioner og indsamler på afrenset objektglas.
- Farv sektioner med hematoxylin og eosin ifølge standardprotokoller 49. Billede ved hjælp af et lysmikroskop udstyret til lysfeltmikroskopi.
3. histokemisk farvning
- Prøvefremstilling
- Afliv dyr på P30-35 hjælp isofluran overdosis (30% i propylenglycol) via åbne drop indånding. Vurdere eutanasi ved ophørvejrtrækning, hjertebanken og manglende reaktion på klemme trædepuden. Bekræft døden ved cervikal dislokation og fjernelse orgel, i overensstemmelse med IACUC retningslinjer.
- For at fjerne hjernen, rense huden på incisionssted med 70% ethanol, før skære gennem huden i bunden af kraniet. Skrælle huden for at blotlægge kraniet og ren med 70% ethanol. Brug rene instrumenter, omhyggeligt skåret gennem kraniet og fjern for at eksponere hjernen. Fjern membranerne, og fjern forsigtigt hjernen fra kraniet hulrum. Skyl i PBS.
- Coat hjernen i OCT og overførsel til en indlejring støbeform indeholder frisk oktober Orientere hjernen, således at det sagittale plan er parallelt med skærefladen, bruge så få bevægelser som muligt og undgå indføring af luftbobler. Flash fryse ved neddypning af formen i et tøris / ethanol-bad og opbevares ved -80 ° C.
- Ved hjælp af en kryostat, skæres 10 um sagittale sektioner og indsamler på afrenset objektglas.
<li> NADH diaphorase Farvning - Forbered 0,05 M Tris-buffer, pH 7,6 ved at opløse 5,72 g Tris-HCI og 1,66 g Tris-base i 1L-deioniseret vand. Opbevar ved 4 ° C i op til seks uger.
- Forbered NADH-opløsning (2,25 mM NADH i 0,05 M Tris-buffer). Alikvot og opbevares ved -20 ° C.
- Forbered NBT-opløsning (2,5 mM Nitro-tetrazolium i 0,05 M Tris-buffer). Opbevar ved 4 ° C i op til seks uger i en glasflaske.
- Kombiner lige store volumener af NADH-opløsning og NBT løsning til at gøre farveopløsning og tilsæt 1 ml til hvert dias. Der inkuberes ved 37 ° C i et fugtigt kammer i 30 minutter.
- Aspirer farvning løsning og vask tre gange med dH 2 O.
- Vask tre gange hver i stigende og faldende koncentrationer af acetone / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl tre gange i dH2O og montere sektioner med vandigt medium. Billede ved hjælp af et lysmikroskop udstyret til lyse field mikroskopi. Blåfarvning svarer til enzymatisk aktivitet.
- Succinatdehydrogenase histokemisk farvning
- Forbered 0,2 M natrium monobasisk phosphat / dH 2 O og 0,2 M natrium dibasisk phosphat / dH 2 O.
- Gør 0,2 M phosphatpuffer, pH 7,6 ved at kombinere 3 dele monobasisk phosphat med 20 dele natrium dibasisk phosphat.
- Forbered farvningsopløsning (0,1 M natriumsuccinat, 1,25 M NBT i 0,2 M phosphatbuffer) og tilsættes 1 ml til hvert objektglas. Der inkuberes ved 37 ° C i et fugtigt kammer i 60 minutter.
- Aspirer farvning løsning og vask tre gange i dH 2 O.
- Vask tre gange hver i stigende og faldende koncentrationer af acetone / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl tre gange i dH2O og montere sektioner med vandigt medium. Billede ved hjælp af et lysmikroskop udstyret til lysfeltmikroskopi. Blåfarvning svarer til enzymatic aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit beskriver eksempler på resultaterne opnås ved anvendelse af disse metoder. I hind-lemmer test, antallet af pull gjort forsøg og latenstiden til at falde, er summeret over to på hinanden følgende tests for hver dag. Denne test kan anvendes til at sammenligne genetisk forskellige grupper til at skelne mus med reduceret neuromuskulær styrke HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) mus i figur 1A -. B påvise nogen ændring i antallet af træk og latenstid til at falde fra P4-6 efterfulgt af en reduktion i neuromuskulær styrke ved P7-10, sammenlignet med kuld (HTRA2 WT). Den forventede stigning i styrke med alderen er også observeres i vildtype dyr. For Weanling observation test, kan den samlede aktivitet vurderes som summen alle hændelser (linjer gennemkøres, opdræt og grooming hændelser), gennemsnit på tværs af de tre på hinanden følgende dage med test. Alternativt kan hver enkelt type hændelse være individually analyseret. Her repræsentative resultater præsenteres, viser reduceret aktivitet af HTRA2 KO mus sammenlignet med WT søskende. Disse data viser, at den samlede aktivitet kan måles kvantitativt og sammenlignes på tværs grupper (figur 1C). Det er også muligt at kvantificere forskelle i gribestyrke ved at beregne et dagligt gennemsnit af de tre gentagelser udført på hver test dag. Når HTRA2 KO mus er i forhold til kuld kontroller, at reduktioner i styrke åbenbart i en kortere ventetid falde (Figur 1D).
H & E-farvning af nethinden frembringer billeder, hvor nethindestruktur kan undersøges og sammenlignes (figur 2). Lagene af celletyper, der udgør nethinden er klart afgrænset tillader sammenligning mellem genetiske grupper. Her HtrA2 tm1jhoh «HtrA3 tm1jhoh mus viser ingen ændringer i retinal struktur, sammenlignet med HtrA2
Figur 1:. Behavioral fænotypebestemmelse af genetisk modificerede mus HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) mus blev underkastet den beskrevne adfærdstestning og sammenlignet med vildtype (WT) HTRA2 kuld kontroller. (A - B) Den hind suspension lemmer test blev udført på WT og KO nyfødte fra P4-P10 og demonstrerer en reduktion i neuromuskulærstyrke i KO dyr (WT: n = 28, KO: n = 19). (A) KO hvalpe indledningsvis lave en lignende antal pull forsøg som WT søskende, men viser et fald i forsøg på senere tidspunkter. (B) KO nyfødte 'latenstid til at falde er også oprindeligt normalt, men falder fra P7 fremefter. (C) Den afvænnede observation samlede aktivitet blev mindsket i KO dyr sammenlignet med WT søskende, i overensstemmelse med reduceret aktivitet af disse mus (WT: n = 19, KO: n = 12). (D) KO dyr havde også en reduceret latenstid til at falde under mesh inversion test, hvilket viser reduceret gribestyrke af HTRA2 KO-mus (WT: n = 17, KO: n = 9). Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (# 0,1 <p <0,05, * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,001 af uafhængige t-tests). Dette tal er blevet ændret fra Patterson et al. 34 Klik her for at seen større version af denne figur.
Figur 2:. H & E-farvning af nethinden Farvning retinale sektioner med hematoxylin og eosin tillader undersøgelse af struktur, der afgrænser retinale lag. Her sektioner fra P35 HtrA2 WT; HtrA3 tm1jhoh (A) og HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (B) display normal retinal struktur. RPE: retinal pigment epitel, OS: ydre segmenter, IS: indre segmenter, ONL: ydre nukleare lag, OPL: ydre netformige lag, INL: inderste nukleare lag, IPL: indre plexiform lag, GCL; ganglion cellelag. Skala bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 3: Respiratory kompleks aktivitet histokemisk farvning for NADH diaphorase (kompleks I) og succinat dehydrogenase (kompleks II) aktivitet blev udført på tværgående hjerne sektioner af P25 HtrA2 flox / flox; Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (NesKO) og HtrA2 + / flox; Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (NesWT) søskende. NADH diaphorase enzymaktivitet er faldet i cerebellum (Crbl, B) og striatum (D) af NesKO hjerne sammenlignet med kontroller NesWT (A, C), men ikke i hjernebarken (E - F). SDH-aktivitet er ligeledes reduceret i cerebellum og striatum af NesKO mus (H, J) sammenlignet med NesWT kontroller (G, I), men der er ingen ændring i hjernebarken (K - L). Scale bar = 200 um. DenneTallet har været ændret siden Patterson et al. 34 Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er behov for Robuste behandlinger til at begrænse virkningen af invaliderende tilstande relateret til menneskets aldring, men de forbliver undvigende for mange betingelser. For at identificere potentielle terapeutiske mål og udvikle strategier for intervention, skal årsagerne til og patologi af sygdomme forbundet med aldring først blive forstået. Ikke alle genetisk modificerede mus umiddelbart til stede med klare fænotyper, der er relateret til sygdommen af interesse, selv om disse gener tidligere har været knyttet til betingelsen i humane undersøgelser. Derfor er behov for flere systematiske undersøgelser og genetisk modificerede mus bør underkastes passende eksperimenter for at identificere fænotyper, som kan være relateret til de associerede sygdomme hos mennesker.
Myriad adfærdsmæssige forsøg findes at analysere neurologiske funktion hos mus 50,51. De adfærdsmæssige tests skitseret heri er velegnede til hypoteserne fænotyper baseret på menneskelige resultater og de faktiske fænotyper observed i mus. Desuden er disse tests er enkle at udføre i laboratorier med ringe eller slet ingen erfaring i at gennemføre adfærdsmæssige eksperimenter. Der er ingen krav om avanceret udstyr, men resultaterne er meningsfuld og informative ved korrekt indsamlet, hvilket gør dem nyttige som et første skridt i at undersøge fænotypen af genetisk modificerede mus, der forventes at have neuromuskulære defekter. De resulterende data kan derefter anvendes til at styre fokuseringen af yderligere testning, potentielt med mere sofistikerede testapparat.
Ligeledes eksisterer der mange teknikker til at evaluere den respiratoriske funktion i væv 52. Måling af hastigheden af ATP-syntese, iltforbrug eller ændringer i mitochondriemembranpotential er vigtige udlæsninger af mitokondrisk funktion, men de kan være kompliceret og tidskrævende at udføre, der kræver specifikke reagenser og udstyr 52-55. Desuden er de ofte begrænset til niveauet for mitochondRion eller celle, bygger på dyrkede celler, lysater eller isolerede mitokondrier. Histokemisk farvning er et nyttigt første skridt i at identificere mitokondriedysfunktion uden en stor investering af tid eller ressourcer. Desuden evnen til at farve vævssnit egner sig til hurtigt at identificere regionale forskelle, som måske ikke er så synlige med andre teknikker, for eksempel området-specifikke tab af enzymatisk farvning observeret i HtrA2-mangel hjerne. Mens teknikken er begrænset i sin evne til at måle fold ændringer i respiratorisk kapacitet, den rummer definerede områder af hjernen, som derefter kan forfølges anvendelse af mere komplekse metoder.
Mens de teknikker der præsenteres i denne fænotype tidsplan er enkle at udføre, udfører visse trin ordentligt er afgørende for succes af forsøgene. For adfærdsmæssige fænotypebestemmelse, skal man være meget omhyggelig med at sikre tests udføres på samme tid og på samme sted hver dag for at begrænse variation introindført ved det nye ved placering eller ved forskellen i døgnrytmen. Udstyret bør organiseres på samme måde hver dag af lignende grunde. Rummet organisation er især kritisk for aktiviteten test, hvor små ændringer i nyhed i høj grad kan påvirke aktiviteten af musen. Ved måling gribestyrke, skal efterforskerne konstatere, at mus har en ordentlig fat i masken før inversion. Ligeledes skal man være opmærksom på korrekt suspendere hvalpen, før du slipper i bagbenet test eller testresultaterne vil være skæv i retning af en kortere latenstid til at falde.
For væv fænotypebestemmelse, opnå gode sektioner er afgørende. Informativ farvning af nethinden afhænger effektiv fiksering før vil opstå dissektion eller artefakter under sektionering og dissektion og fordreje morfologi. Histokemisk farvning kræver hjerner, der skal fryses hurtigt efter dissektion for at bevare enzymfunktionen, men inkubationstiden er ligeledes critical; små udsving i temperatur eller i hvor lang tid kan medføre forskelle i farvningsintensitet. Hvor det er muligt, bør prøverne behandles på samme tid, at sammenligning mellem grupper.
Her en test regime anvendes til at undersøge genetisk modificerede mus forventes at vise subtile fænotyper associeret med aldersrelaterede sygdomme, nemlig AMD og PD, beskrives. Denne fænotypebestemmelse tidsplan kan bruges til at identificere underskud i neuromuskulær styrke og aktivitet, samt identificere strukturelle og funktionelle defekter inden væv af interesse. Denne tidsplan giver en systematisk analyse af tidlige fænotyper hos unge, genetisk ændrede mus. I fremtiden kan denne metode anvendes på alle genmodificerede mus forventes at præsentere med en AMD eller PD relateret fænotype, såvel som dem af ukendt ætiologi, der vises åbenlyst normalt. Enkeltheden af testene giver test uden væsentlige investeringer, men kan bruges til at informere yderligere studies. Ved at kombinere adfærdsmæssig testning med cellulær fænotypebestemmelse, er det muligt at begrænse antallet af anvendte mus og gælder sammenligne dyreydeevne med den fysiologiske tilstand. Denne fænotypebestemmelse skema indeholder en første analyse, der kan anvendes til at styre fokuseringen af efterfølgende undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansieringen af denne forskning kom fra Rosebay Medical Foundation og en Yale Medical School Dean Research Fund (JH). Vi takker Dr. Claire Koenig om hjælp med adfærdsmæssige eksperimenter. Gensplejsede muselinjer blev genereret ved Ozgene (Perth, Australien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
- Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
- Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
- Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
- Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
- Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
- Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
- Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
- Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
- Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
- Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
- Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
- Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
- Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
- Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
- Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
- Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
- Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
- Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
- Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
- Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
- Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
- Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
- Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
- Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
- Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
- Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
- Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
- Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
- Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
- Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
- Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
- Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
- Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
- Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
- Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
- Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
- Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
- Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
- Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
- Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
- Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
- El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
- Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
- Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).
