Introduction
doenças associadas à idade estão se tornando cada vez mais prevalente na sociedade moderna. Como a ciência médica melhora e expectativa de vida aumenta, a população continua a idade e o peso dessas doenças cresce. Os tratamentos eficazes são necessárias para diminuir o impacto de condições debilitantes, mas permanecem ainda desconhecidos em muitos casos. Somente através da compreensão das causas e patologia das doenças associadas com o envelhecimento pode cientistas começar a identificar potenciais alvos terapêuticos e desenvolver estratégias para a intervenção. condições relacionadas com a idade comuns incluem desordens neurodegenerativas tais como a doença de Parkinson (PD) e degeneração macular relacionada com a idade (AMD). DP é o distúrbio de movimento mais comum causada por neurodegeneração em seres humanos. A maioria dos pacientes com DP apresentam sintomas como tremor de repouso, bradicinesia e rigidez depois de 50 anos de idade. O início precoce também foi observado em aproximadamente 10% dos casos.
AMD é a principal causa de cegueira emos idosos, danificando progressivamente fotorreceptores e o epitélio pigmentar da retina (EPR) no olho. A visão central, mas é prejudicada a visão periférica é geralmente inalteradas. Existem duas formas de DMRI. Na forma "seca", depósitos de proteínas extracelulares conhecidos como forma de drusas entre o EPR e a membrana de Bruch (BM), levando à atrofia geográfica e embaçamento da visão central. Os mais graves "molhado" forma de resultados de neovascularização coróide através BM nas camadas epiteliais pigmentares e fotorreceptoras e pode levar a hamorrhaging abaixo da retina que provoca danos permanentes ao tecido da retina. Genome wide associação estudos identificaram previamente loci que estão associados com o aumento da susceptibilidade a esta doença e identificou duas regiões de interesse: Factor H do complemento (CFH) no cromossoma 1 e a 10q26 local, onde a maculopatia susceptibilidade relacionada com a idade de 2 (ARMS2) e de alta temperatura fator exigência A1 (HtrA1) genes estão localizados 1-5 3-6.
CFH actua como um regulador negativo da via alternativa (AP) do sistema do complemento através da inibição da activação de C3. Um polimorfismo de um único nucleótido (SNP) tem sido associada a um risco aumentado de DMRI, fazendo com que a troca de tirosina 402 no exão 9 com histidina devido a uma substituição T para C 1. Em AMD acredita-se que o AP é desregulada por causa de uma perda de função do CFH mas se o SNP desempenha um papel causal está claro. Uma hipótese é que a histidina carregada positivamente é pensado para anular a capacidade de CFH para se ligar a proteínas que interagem com a proteína C-reactiva e sulfato de heparina 1,7. Estudos in vitro de CFH Y402H fornecer resultados contraditórios sobre diferenças funcionais entre as variantes, e em vivo o trabalho em <em> CFH - / - ratos que expressam humanizado CFH está em curso 8. ARMS2 está localizado a montante do HtrA1 no genoma de primata, embora o gene está ausente em ratinhos. HtrA1 é uma protease da serina, mas ARMS2 é mal caracterizado. O desequilíbrio de ligação entre os SNPs no locus AMD-associada tornou difícil determinar as contribuições para o risco de mutações individuais dos genes nesta região, mas trabalho recente sugeriu que é sobre-expressão de HtrA1 em vez de ARMS2 que conduz a neovascularização e depósitos de proteínas subretinal 9-11. No entanto, a grande proximidade dos genes em esse locus pode permitir interacções que não pode ser estudado utilizando transgenes inseridos aleatoriamente.
Além da DMRI, a família de proteases de serina HtrA tem sido associada a muitas doenças humanas. Todas as proteínas HtrA contêm um domínio de serina-protease seguido por, pelo menos, um domínio C-terminal de ZDP. HtrA1, HtrA3 e HtrA4 compartilhar o grcomes homologia, que consiste de um domínio de péptido de sinal, ligação ao factor de crescimento semelhante à insulina, um inibidor de protease de domínio Kazal, o domínio de protease de serina e um domínio PDZ. HtrA2 tem um terminal N diferente, constituída por uma sequência de localização mitocondrial, domínio transmembranar e domínio de ligação de inibidor de apoptose, seguido pelos domínios de protease e PDZ 12-16. HtrA1 dos mamíferos é regulado por remodelação induzida por substrato no local activo do seu domínio de protease 17-20, e HtrA2 pode também ser modulada pela interacção entre a protease de serina e domínios PDZ que suprime a actividade de protease 21. Curiosamente, o domínio PDZ não aparecer para conferir regulação semelhante ao HtrA3 16. As proteases HtrA também pode ser regulada por factores extrínsecos: foi demonstrado recentemente que existe uma interacção entre o regulador e HtrA1 protoporfirinas 22 e HtrA2 pode ser regulado pela fosforilação após a activação da MAP-cinase p38via de um modo dependente-PINK1 23. A supressão de membros individuais da família HtrA em ratinhos tem sido documentada, no entanto efeitos mecanísticos na maior parte não são claras, em parte devido à falta de fenótipos visíveis.
HtrA1 desempenha uma função importante no controlo de qualidade de proteínas e a sua desregulação ou mutação tem sido associada a muitas doenças humanas diferentes, incluindo artrite, cancro e um aumento do risco da AMD 3,4,24-32. A perda da função HtrA2 em tecidos neurais tem sido associada com fenótipos PD em humanos e ratos, enquanto que a sua perda a partir de tecidos não neurais resultados em envelhecimento acelerado 33-37. Desregulação HtrA3 tem sido associada a doenças, incluindo a pré-eclampsia e de certos tipos de cancro 38,39. -Regulação de HtrA4 tem sido observado nas placentas de pacientes com pré-eclâmpsia, mas camundongos knockout não apresentam um fenótipo ostensiva 40,41. A falta de fenótipos observados em alguns ratinhos knockout tem sidopostulada como sendo um resultado de compensação entre o membro da família HtrA: pensa-se que ambos HtrA4 HtrA1 e interagir com a família de TGF-B de proteínas, que permite a compensação por HtrA1 mediante eliminação de HtrA4 41. Do mesmo modo, pensa-se que uma vez que HtrA1 HtrA3 e têm um elevado grau de homologia de domínios que possam ter funções complementares 42. No entanto, tem sido sugerido que as proteínas HtrA podem ter papéis parcialmente antagonistas, competindo para regular alvos comuns 43.
Para investigar mais estes fatores de risco três linhas de rato knock-in humanizados foram gerados. Em CFH TM1 (CFH * 9) jhoh e CFH tm2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 do gene CFH é substituído por exon 9 do homólogo humano. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh codifica a não-doença associada tirosina resíduo na posição 402, enquanto CFH tm2 (CFH * 9) jhoh carrega o Y402H, SNP associado ao risco. DentroARMS2 tm1jhoh a sequência ARMS2 humano foi alvejado a uma região a montante do HtrA1. Uma sequência de paragem flanqueado-loxP colocado a montante da sequência do gene, mas a jusante do promotor UbiC incluídos foi excisado por cruzamento de ratinhos OzCre, que expressam a recombinase Cre sob o controle do promotor Rosa26, como previamente descrito 34. Além desses knock-in linhas, foram gerados alelos knockout condicional para CFH e HtrA1 (CFH tm1jhoh e tm1jhoh HtrA1), bem como os outros membros conhecidos da família HtrA: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (tm1jhoh HtrA3) e HtrA4 ( tm1jhoh HtrA4). Os nocautes germinativas foram criados pelo cruzamento de ratos OzCre aos animais projetados para flanquear exons específicos com locais loxP, de tal forma que a exclusão provoca uma mudança de quadro e / ou deleção do domínio activo (CFH; exão 3, HtrA1; exons 2-3, HtrA2: exões 2-4, HtrA3; exão 3, HtrA4; exons 4-6) 34,41. Uma deleção neural de HtrA2, eliminados utilizando recombinase Cre sob o controle do promotor de nestina (HtrA2 Flox; Tg (Nes-CRE) 1Kln / J), também foi descrito 34. Apenas os ratos que faltam HtrA2, sistemicamente ou em tecidos neurais, exibido fenótipos claros, apresentando fenótipos parkinsonianos.
Uma vez que alguns destes genes de interesse são postulou a ser localizada para a mitocôndria 11,44-47, e supressão de HtrA2 gerado fenótipos parkinsonianos, um regime de fenotipagem com foco mitocondrial e neurológico é descrito aqui e resultados representativos dos testes de interesse são fornecidos . A fim de examinar ratos geneticamente modificados produzidos para investigar humano, doença relacionada com a idade completa e sistematicamente a uma programação de fenotipagem inicial foi estabelecido, que consiste de uma série de testes relacionados com os dois principaisdoenças de interesse: AMD e Parkinson.
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Protocol
Ética declaração: Estudos envolvendo animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade de Yale.
1. Teste comportamental de camundongos geneticamente modificados
Nota: Todos os ratinhos deve ser submetido ao mesmo regime de testes para limitar as diferenças de habituação ao manuseamento. Os ensaios devem ser realizados à mesma hora do dia de cada vez.
- Neonatal Hind Teste Limb
Nota: O teste da pata traseira é realizado diariamente desde o dia pós-natal (P) 4 a P10 para avaliar a força muscular dos membros posteriores proximal, fraqueza e fadiga.- ratinhos de transporte para a área de teste e deixa-se repousar durante 30 minutos antes do teste.
- Prepare aparelho de teste por a limpeza de um tubo de 50 ml com 70% de etanol, empurrando dois (P4-P8) ou um (P9-P10) bolas de algodão para o fundo do TUbe e fixação na posição vertical.
- Remova um filhote de cachorro da gaiola e registro do peso. Mantenha filhote na realização de bandeja na almofada de calor, sempre que não testar.
- Suavemente suspender os membros posteriores do recém-nascido por cima da borda do tubo cónica, de tal modo que ele esteja voltado para baixo para as bolas de algodão. Contar o número de tentativas de puxar feitas e latência medida caia usando um cronômetro.
- Repita mais uma vez, em seguida, rotular o filhote com marcador. Em seguida, identificar filhotes P6 pelo recorte dedo do pé. Esfregue suavemente filhotes com roupa de cama da gaiola antes de substituir.
- Wipe tubo cónico com 70% de etanol.
- Repita o teste na próxima filhote até que todo o lixo foi testado.
- Dispor de bola de algodão e tubo cônico. Limpar todo o equipamento com etanol 70%.
- Teste Observação Weanling
Nota: O teste de observação recém-desmamados é administrado diariamente a partir de P19 a P21 para marcar os níveis de movimento e atividade geral.- camundongos de transporte para a área de teste de umND deixa-se repousar durante 30 minutos antes do teste.
- Prepare caixa de teste de Plexiglas com uma grelha 6x6 de 2 polegada quadrada na base com a limpeza com etanol 70%. Defina-se equipamento de vídeo para o lado de tal modo que toda a caixa está no campo de visão. Mantenha a configurar e arredores o mesmo a cada dia para evitar a introdução de novidade.
- Remova um recém-desmamados da gaiola e coloque em um copo da terra arrendada limpo. peso Record.
- Iniciar a gravação de vídeo filmando o cartão de identificação de teste, com o número de identificação do mouse, a idade ea data do teste. Transferir mouse de prender o copo até a praça central. Tempo de três minutos, a contagem do número de linhas atravessadas por ambas as patas dianteiras do rato durante o ensaio.
- Retorno do mouse para uma gravação de vídeo gaiola e final limpo.
- Limpar o aparelho de ensaio com 70% de etanol.
- Repita até que todo o lixo é testado, em seguida, retornar todos os filhotes para a gaiola casa.
- Limpar todo o equipamento de testes com etanol 70%.
- Arame Teste de força de preensão
Nota: O teste de força de preensão é realizado em dias alternados entre P22 e P26, para avaliar a força neuromuscular.- camundongos de transporte para a área de teste e deixe descansar na gaiola durante 30 min antes do teste.
- Prepare aparelho pela limpeza de uma grade caixa e malha de Plexiglass com etanol 70%. Coloque envoltório de espuma na parte inferior da caixa e cobrir com papel.
- camundongos separados em grupos de três, colocando em copos de exploração individual.
- Coloque primeiro rato para o centro da malha de arame e lentamente inverter 10-20 cm acima da superfície macia na parte inferior da caixa de plexiglass. Medir a latência a cair utilizando um cronómetro. Encerrar o teste após 60 segundos se passaram se o rato não fazcair.
- Retorno do mouse para o copo segurando, limpe malha com 70% de etanol e substituir o papel sobre o plástico bolha. Realizar o teste sobre as restantes dois ratinhos do grupo antes de voltar para o primeiro. Repetir até que cada ratinho foi testado um total de três vezes.
- Retorne o grupo a uma gaiola limpa e continuar com os grupos restantes. Se houver menos de três ratos em qualquer grupo, verifique se a 5 min de intervalo de recuperação inter-julgamento é permitido.
- Retornar todos os ratos para a gaiola, descarte de papel e equipamentos de teste limpo com etanol 70%.
2. O exame da estrutura retiniana
- Anestesiar os animais em P30-35 por injecção intraperitoneal de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Avaliar profundidade da anestesia por beliscar a pata e prosseguir apenas na ausência de uma resposta, de acordo com as diretrizes IACUC. Perfundir com PFA a 4% / PBS 48.
- Para remover os olhos, limpar a pele no Si incisãote com 70% de etanol, antes de cortar através da pele na base do crânio. Retire a pele para expor o crânio e limpo, com 70% de etanol. Usando instrumentos limpos, cuidadosamente cortadas através do crânio para alcançar as órbitas oculares e expor os olhos. Sever do nervo óptico, remova cuidadosamente o olho da tomada e enxaguar em PBS.
- Fix olhos em PFA a 4% / PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
- Coloque os olhos em uma pequena placa de Petri contendo PBS. Fazer uma pequena incisão no centro da córnea usando remoção de tesouras de costura. Remover a córnea cortando a borda entre a córnea e esclera. Use fórceps para remover a íris. Finalmente, retire as camadas RPE, deixando intacta a retina e a lente no lugar.
Nota: O 4% PFA / PBS fixação irá causar descolamento de EPR permitindo a EPR a ser facilmente descascada do lado de fora da retina. - Re-correcção em PFA a 4% / sacarose a 30% / PBS durante 15 min à temperatura ambiente antes de voltar a olho para uma placa de Petri contendo PBS. Retire o lens usando uma pinça, levando o corpo vítreo, juntamente com ele.
- Cryoprotect em 30% sacarose durante a noite a 4 ° C.
- olhos revestimento em composto Optimum Corte Temperatura (OCT) e transferir para um molde de incorporação contendo fresco outubro. Orientar o olho de tal forma que o plano sagital é paralelo com a face de corte, utilizando o menor número de movimentos possível e evitar a introdução de bolhas de ar. congelamento flash imergindo o molde num banho de gelo seco / etanol. blocos de armazenar a -80 ° C.
- Usando um criostato, cortar 20 um secções sagitais e recolher em lâminas previamente limpas.
- Seções mancha com hematoxilina e eosina de acordo com protocolos padrão 49. Imagem usando um microscópio de luz equipado para microscopia de campo claro.
3. histoquímico de coloração
- Preparação de amostra
- Eutanásia animais em P30-35 sobredosagem usando isoflurano (30% em propilenoglicol), através de inalação gota aberta. Avaliar a eutanásia pela cessaçãoda respiração, batimentos cardíacos e a falta de resposta a beliscar a pata. Confirmar a morte por deslocamento cervical e remoção de órgãos, em linha com as diretrizes IACUC.
- Para remover o cérebro, limpar a pele no local da incisão com 70% de etanol, antes de cortar através da pele na base do crânio. Retire a pele para expor o crânio e limpo, com 70% de etanol. Usando instrumentos limpos, cuidadosamente cortadas através do crânio e remover para expor o cérebro. Retirar as membranas, e retire cuidadosamente o cérebro a partir da cavidade do crânio. Enxágüe em PBS.
- Brasão do cérebro em outubro e transferir para um molde de incorporação contendo fresco outubro Orientar o cérebro de tal modo que o plano sagital é paralelo com a face de corte, utilizando o menor número de movimentos possível e evitar a introdução de bolhas de ar. congelamento flash imergindo o molde num banho de gelo seco / etanol e armazenar a -80 ° C.
- Usando um criostato, corte 10 mm sagitais e recolher em lâminas previamente limpas.
<li> NADH Diaforase Coloração - Preparar tampão Tris 0,05 M, pH 7,6 por dissolução de 5,72 g de Tris-HCl e 1,66 g de base Tris em 1 litro de água desionizada. Armazenar a 4 ° C por até seis semanas.
- Preparar a solução de NADH (NADH 2,25 mM em tampão Tris 0,05 M). Alíquotas e armazenar a -20 ° C.
- Preparar uma solução de NBT (2,5 mM de nitro-azul de tetrazólio em tampão Tris 0,05 M). Armazenar a 4 ° C por até seis semanas em uma garrafa de vidro.
- Combine volumes iguais de solução de NADH e solução de NBT para fazer solução de coloração e adicionar 1 ml a cada slide. Incubar a 37 ° C numa câmara de humidif içado, durante 30 min.
- Solução de coloração Aspirar e lavar três vezes com dH2O
- Lavar três vezes cada um em concentrações ascendentes e descendentes de acetona / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) durante 2 min à temperatura ambiente.
- Lavar três vezes em dH 2 O e montar secções com meio aquoso. Imagem usando um microscópio de luz equipado para f brilhantemicroscopia ield. coloração azul corresponde à actividade enzimática.
- Succinato desidrogenase histoquímico de coloração
- Prepare a 0,2 M de fosfato de sódio monobásico / dH 2 O e fosfato dibásico de sódio 0,2 M / dH 2 O.
- Adicione tampão de fosfato 0,2 M, pH 7,6 através da combinação de 3 partes de fosfato monobásico de fosfato dibásico de sódio 20 partes.
- Preparar a solução de coloração (succinato de sódio 0,1 M, 1,25 M de NBT em tampão fosfato 0,2 M) e adicionar 1 ml para cada lâmina. Incubar a 37 ° C numa câmara de humidif içado, durante 60 min.
- Solução de coloração Aspirar e lavar três vezes em dH2O
- Lavar três vezes cada um em concentrações ascendentes e descendentes de acetona / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) durante 2 min à temperatura ambiente.
- Lavar três vezes em dH 2 O e montar secções com meio aquoso. Imagem usando um microscópio de luz equipado para microscopia de campo claro. coloração azul corresponde a PTatividade zymatic.
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Representative Results
Esta seção descreve os exemplos de resultados obtidos usando estes métodos. No teste posterior de membros, o número de tentativas feitas puxar e a latência para cair são somados ao longo de dois testes consecutivos de cada dia. Este teste pode ser usado para comparar os grupos geneticamente diferentes para distinguir ratinhos com reduzida força neuromuscular HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) na Figura 1A -. B demonstrar qualquer alteração no número de latência e puxa a cair de P4-6 seguido por uma redução na força neuromuscular em P7-10, em comparação com crias da mesma ninhada (HTRA2 WT). O aumento esperado na força com a idade também é observável nos animais de tipo selvagem. Para o teste de observação recém-desmamados, a actividade total pode ser avaliada pela soma de todos os eventos (linhas atravessadas, criação e preparação eventos), a média dos três dias consecutivos de teste. Alternativamente, cada tipo específico de evento pode ser individuallY analisados. resultados aqui representativos são apresentados, demonstrando atividade reduzida de HTRA2 KO em comparação com ninhadas WT. Estes dados demonstram que a actividade total pode ser quantitativamente medida e comparada entre os grupos (Figura 1C). É também possível para quantificar as diferenças na força de preensão ao calcular a média diária das três repetições realizadas em cada dia de teste. Quando os ratinhos KO HTRA2 são comparados com controlos da mesma ninhada, redução na força manifestar-se de latência mais curta a cair (Figura 1D).
H & E coloração da retina gera imagens em que a estrutura da retina pode ser examinados e comparados (figura 2). As camadas de tipos de células que compõem a retina são claramente delineados permitindo a comparação entre os grupos genéticos. Aqui, HtrA2 tm1jhoh '; ratos HtrA3 tm1jhoh não mostram mudanças na estrutura da retina, em comparação com HtrA2
Figura 1:. Fenotipagem comportamental de ratos geneticamente modificados tm1jhoh HtrA2 (HTRA2 KO) foram submetidas ao teste de comportamento descrito e em comparação com o tipo selvagem (WT) HTRA2 controlos da mesma ninhada. (A - B) O teste da suspensão do membro traseiro foi realizada em WT e KO de neonatos P4-P10 e demonstra uma redução no neuromuscularforça em animais KO WT (n = 28, KO: n = 19). Filhotes (A) KO, inicialmente, fazer um número semelhante de tentativas de puxar como irmãos WT, mas mostram uma diminuição em tentativas feitas em pontos de tempo posteriores. Latência '(B) KO neonatos a cair, também é inicialmente normal, mas diminui de P7 em diante. (C) O índice de actividade total de observação weanling foi reduzida em animais KO em comparação com WT da mesma ninhada, consistentes com actividade reduzida destes ratos (peso: n = 19, KO: n = 12). Animais (D) KO também teve uma latência reduzida para cair durante o ensaio de inversão de malha, o que demonstra a força de preensão reduzida de ratinhos KO HTRA2 (WT: n = 17, KO: n = 9). Os dados representam média ± EPM (# 0,1 <p <0,05, * p <0,05, ** P <0,001; *** p <0,001 pelo teste-t independentes). Este valor foi modificado a partir de Patterson et al. 34 Por favor, clique aqui para veruma versão maior desta figura.
Figura 2:. H & E coloração de secções da retina retina coloração com hematoxilina e eosina, permite o exame da estrutura, delineando as camadas da retina. Aqui seções de WT P35 HtrA2; HtrA3 tm1jhoh (A) e tm1jhoh HtrA2; HtrA3 tm1jhoh (B) de exibição estrutura normal da retina. RPE: retina epitélio pigmentar, OS: segmentos externos, IS: segmentos internos, ONL: camada externa nuclear, OPL: camada plexiforme externa, INL: camada nuclear interna, IPL: camada plexiforme interna, GCL; camada de células ganglionares. Barra de escala = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3: atividade complexa respiratória coloração histoquímica para NADH diaforase (complexo I) e succinato desidrogenase (complexo II) atividade foi realizada em secções do cérebro transversais de HtrA2 P25 Flox / Flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (Nesko) e HtrA2 + / flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (NesWT) ninhada. Actividade da enzima diaforase NADH é diminuída em cerebelo (Crbl, B) e corpo estriado (D) de Nesko cérebro comparado com os controlos NesWT (A, C), mas não no córtex cerebral (E - F). Actividade SDH é igualmente reduzidas no corpo estriado e cerebelo de ratinhos Nesko (H, J) em comparação com controlos NesWT (G, I), mas não há nenhuma alteração no córtex cerebral (K - L). Barra de escala = 200 pm. estefigura foi modificado a partir Patterson et al. 34 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
tratamentos robustos são necessários para limitar o impacto das condições debilitantes relacionadas com o envelhecimento humano, mas eles são ainda imperceptíveis para muitas condições. Para identificar potenciais alvos terapêuticos e desenvolver estratégias de intervenção, as causas e patologia das doenças associadas com o envelhecimento deve primeiro ser compreendido. Nem todos os camundongos geneticamente modificados imediatamente apresentam fenótipos claros que estão relacionados com a doença de interesse, mesmo que esses genes previamente têm sido associados à condição em estudos humanos. Assim, mais investigações sistemáticas são necessárias e camundongos geneticamente modificados deve ser submetido a experimentos adequados para identificar fenótipos que podem estar relacionados com as doenças associadas em seres humanos.
Existe uma miríade de testes comportamentais para ensaiar a função neurológica em ratos 50,51. Os testes comportamentais descritas neste documento são adequados para os fenótipos hipótese com base nos resultados humanos e os fenótipos reais OBSErved em ratinhos. Além disso, estes testes são simples de executar em laboratórios com pouca ou mesmo nenhuma experiência na condução de experimentos comportamentais. Não há necessidade de equipamento sofisticado, mas os resultados são significativos e informativa quando devidamente recolhidos, tornando-os úteis como um primeiro passo na análise do fenótipo de ratinhos geneticamente modificados que são esperados ter defeitos neuromusculares. Os dados resultantes podem então ser usadas para dirigir o foco de mais testes, potencialmente com um aparelho de testes mais sofisticado.
Da mesma forma, existem muitas técnicas para avaliar a função respiratória em tecidos 52. A medição da taxa de síntese de ATP, o consumo de oxigénio ou de alterações no potencial da membrana mitocondrial são leituras importantes da função mitocondrial, mas que pode ser complicado e demorado de realizar, necessitando de reagentes e equipamentos específicos 52-55. Além disso, eles são muitas vezes limitados ao nível do mitochondrion ou celular, contando com células cultivadas, lisados ou mitocôndrias isoladas. coloração histoquímica é um primeiro passo útil na identificação de disfunção mitocondrial sem um grande investimento de tempo ou recursos. Além disso, a capacidade para corar as secções de tecido presta-se para identificar rapidamente as diferenças regionais que podem não ser tão evidentes com outras técnicas, por exemplo a perda de coloração enzimática observada em cérebro HtrA2-deficiente de área específica. Embora a técnica é limitada na sua capacidade para medir alterações na capacidade respiratória de dobragem, que mapeia as regiões do cérebro definidos, que podem então ser prosseguidos usando métodos mais complexos.
Embora as técnicas apresentadas dentro deste calendário fenotipagem são simples de realizar, que executa determinadas etapas adequadamente é crítica para o sucesso das experiências. Para a fenotipagem comportamental, deve ser tomado muito cuidado para assegurar testes são realizados ao mesmo tempo e no mesmo local a cada dia para limitar a variação de introduçãoproduzida pela novidade da localização ou pela diferença no ritmo circadiano. O equipamento deve ser organizado da mesma forma a cada dia por razões semelhantes. A organização quarto é especialmente crítico para o teste de actividade, onde pequenas alterações no novidade pode influenciar grandemente a actividade do rato. Ao medir a força de preensão, os investigadores devem determinar que os ratos têm uma retenção adequada da malha antes da inversão. Da mesma forma, é preciso ter cuidado para suspender corretamente o filhote antes de liberar no teste da pata traseira ou os resultados do teste será desviada para uma latência mais curto a cair.
Para fenotipagem tecido, obtendo bons seções é vital. coloração Informativo da retina depende de fixação eficaz antes da dissecação ou artefatos irão surgir durante o corte e dissecção e distorcer a morfologia. coloração histoquímica requer cérebros para ser congelado rapidamente após a dissecação, para preservar a função da enzima, mas o tempo de incubação é igualmente criticaeu; pequenas variações de temperatura ou no período de tempo pode causar diferenças na intensidade de coloração. Sempre que possível, as amostras devem ser processadas ao mesmo tempo para permitir a comparação entre grupos.
Aqui, um regime de testes usados para estudar camundongos geneticamente modificados esperados para exibir fenótipos sutis associados a doenças relacionadas com a idade, ou seja, AMD e PD, é descrito. Este calendário de fenotipagem pode ser usado para identificar os défices na força e na actividade neuromuscular, bem como identificar os defeitos estruturais e funcionais nos tecidos de interesse. Este calendário fornece uma análise sistemática de fenótipos precoces em ratos jovens, geneticamente alterados. No futuro, este método pode ser aplicado a quaisquer ratinhos geneticamente modificados que se espera que apresente um fenótipo com AMD ou Pd relacionadas, bem como os de etiologia desconhecida que aparecem abertamente normal. A simplicidade dos testes permite testar sem um investimento significativo, mas pode ser utilizado para informar s maistudies. Ao combinar o teste comportamental com fenotipagem celular, é possível limitar o número de ratos utilizados e comparar directamente o desempenho do animal com a condição fisiológica. Este calendário de fenotipagem fornece uma análise inicial que pode ser utilizado para direccionar o foco de estudos posteriores.
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Acknowledgments
Financiamento para esta investigação veio Fundação Médica Rosebay e Fundo de Investigação do Dean Yale Medical School (JH). Agradecemos ao Dr. Claire Koenig para obter ajuda com experimentos comportamentais. Genetically Engineered mouse linhas foram geradas pelo Ozgene (Perth, Austrália).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
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