Introduction
Åldersassocierade sjukdomar blir allt vanligare i det moderna samhället. Som medicinsk vetenskap förbättras och livslängden ökar, fortsätter befolkningen åldras och bördan av dessa sjukdomar ökar. Effektiva behandlingar är nödvändiga för att minska effekterna av försvagande villkor men förblir svårfångade i många fall. Endast genom att förstå orsakerna och patologin av sjukdomar förknippade med åldrandet kan forskarna börja att identifiera potentiella terapeutiska mål och utveckla strategier för intervention. Gemensamma åldersrelaterade tillstånd inkluderar neurodegenerativa sjukdomar såsom Parkinsons sjukdom (PD) och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). PD är den vanligaste rörelsestörning orsakad av neurodegeneration hos människa. De flesta PD-patienter visar symtom som vila tremor, bradykinesi och stelhet efter 50 års ålder. Tidig debut har också observerats hos ungefär 10% av fallen.
AMD är den vanligaste orsaken till blindhet iäldre, gradvis skada fotoreceptorer och det retinala pigmentepitelet (RPE) i ögat. Centrala seendet försämras men perifera seendet är i allmänhet opåverkad. Det finns två former av AMD. I den "torra" formen, extracellulära proteinavlagringar som kallas drusen form mellan RPE och Bruch membran (BM), vilket leder till geografisk atrofi och oskärpa av det centrala seendet. De mer allvarliga "våta" formen resulterar från neovaskularisation från åderhinnan över BM i RPE och fotoreceptorskikt och kan leda till hamorrhaging under näthinnan som orsakar permanent skada på näthinnan vävnad. Genome breda associationsstudier har tidigare identifierat lokus som är associerade med ökad mottaglighet för sjukdomen och identifierade två regioner av intresse: komplementfaktor H (CFH) på kromosom 1 och 10q26 locus, där åldersrelaterade makulopati känslighet 2 (ARMS2) och hög temperatur krav faktorn A1 (HtrA1) gener ligger 1-5 3-6.
CFH verkar som en negativ regulator för den alternativa vägen (AP) av komplementsystemet genom att hämma aktiveringen av C3. En single nucleotide polymorphism (SNP) har kopplats till ökad risk för AMD, vilket utbyte av tyrosin 402 i exon 9 med histidin på grund av en T till C substitution en. I AMD man tror att AP är misregulated på grund av en förlust av funktion av CFH men om SNP spelar en avgörande roll är oklar. En hypotes är att den positivt laddade histidin tros förneka förmågan hos CFH att binda till samverkande proteiner C-reaktivt protein och heparinsulfat 1,7. In vitro-studier av CFH Y402H ger motstridiga resultat över funktionella skillnader mellan varianterna, och i vivo arbete <em> Cfh - / - möss som uttrycker humaniserad CFH pågår åtta. ARMS2 är belägen uppströms om HtrA1 i primat genomet, även om genen är frånvarande i möss. HtrA1 är ett serinproteas men ARMS2 dåligt karakteriseras. Kopplingen obalans mellan SNP i AMD-associerad locus har gjort det svårt att fastställa bidragen till risken att enskilda mutationer av generna i denna region, men den senaste tidens arbete har föreslagit att det är överuttryck av HtrA1 snarare än ARMS2 som leder till kärlnybildning och subretinal proteinavlagringar 9-11. Emellertid kan närhet av generna i detta lokus möjliggör interaktioner som inte kan studeras med hjälp av slumpmässigt införda transgener.
Förutom AMD har HtrA familjen av serinproteaser associerats med många mänskliga sjukdomar. Alla htrA proteiner innehåller en serinproteasdomän följd av minst en C-terminal PDZ-domänen. HtrA1, HtrA3 och HtrA4 delar gräter av homologi, som består av en signalpeptid, insulinliknande tillväxtfaktorbindande domän, en Kazal-proteas hämmardomänen, serinproteasdomänen och en PDZ-domän. HtrA2 har en annan N-terminal, som består av en mitokondriell lokaliseringssekvens, transmembrandomän och inhibitor av apoptos bindande domän följt av proteas- och PDZ-domäner 12-16. Däggdjurs HtrA1 regleras av substrat-inducerad remodellering i det aktiva stället av dess proteasdomän 17-20, och HtrA2 kan också moduleras genom växelverkan mellan serinproteaset och PDZ-domäner som undertrycker proteasaktivitet 21. Intressant, inte PDZ-domänen inte tycks ge liknande reglering till HtrA3 16. HtrA proteaser kan också regleras med yttre faktorer: det var nyligen visat att det föreligger en reglerande interaktion mellan HtrA1 och protoporfyriner 22 och HtrA2 kan regleras genom fosforylering vid aktivering av p38 MAP-kinasreaktionsvägen i en Nature1 beroende sätt 23. Strykningen av enskilda medlemmar av HtrA familjen i möss har dokumenterats, men mekanistiska effekter är oftast oklara delvis på grund av brist på synliga fenotyper.
HtrA1 spelar en viktig funktion i protein kvalitetskontroll och dess felaktig reglering eller mutation har förknippats med många olika mänskliga sjukdomar, inklusive artrit, cancer och en ökad risk för AMD 3,4,24-32. Förlust av HtrA2 funktion i neurala vävnader har förknippats med PD fenotyper i människor och möss, medan förlust av icke-neurala vävnader resulterar i accelererad åldring 33-37. HtrA3 dysreglering har förknippats med sjukdomar som inbegriper preeklampsi och vissa typer av cancer 38,39. Uppreglering av HtrA4 har observerats i moderkakor av graviditetstoxikos patienter men knockoutmöss inte visa en öppen fenotyp 40,41. Avsaknaden av fenotyper observerats hos vissa knockoutmöss har varitantas vara ett resultat av kompensation mellan htrA familjemedlem: det är tänkt att både HtrA4 och HtrA1 interagera med TGF-B-familjen av proteiner, vilket möjliggör kompensation av HtrA1 vid radering av HtrA4 41. På samma sätt är det tänkt att eftersom HtrA1 och HtrA3 har en hög grad av domän homologier de kan ha kompletterande funktioner 42. Emellertid har det föreslagits att htrA proteiner kan ha delvis antagonistiska roller, tävlar om att reglera gemensamma mål 43.
För att ytterligare undersöka dessa riskfaktorer tre humaniserade knock-in mus linjer genererades. I Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh och Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh, exon 9 i Cfh genen ersätts med exon 9 av den humana homologen. Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh kodar den icke-sjukdom förknippad tyrosin resten i position 402, medan Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh bär Y402H, risk-associerad SNP. IARMS2 tm1jhoh människo ARMS2 sekvensen riktade till en region uppströms HtrA1. En loxP-flankerad STOPP sekvens placeras uppströms om gensekvensen men nedströms om den inkluderade UbiC promotorn skars ut genom att korsa till OzCre möss, vilka uttrycker Cre-rekombinas under kontroll av den ROSA26-promotorn, såsom tidigare beskrivits 34. Utöver dessa knock-in linjer, var villkor knockout alleler för Cfh och HtrA1 (Cfh tm1jhoh och HtrA1 tm1jhoh), såväl som de andra kända htrA familjemedlemmar genereras: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) och HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). De bakterielinjeknockouts skapades genom att korsa OzCre möss till djur engineered att flankera specifika exoner med loxP-ställen, så att raderingen orsakar en ram skift och / eller radering av den aktiva domänen (Cfh, exon 3, HtrA1; exon 2-3, HtrA2: exoner 2-4, HtrA3; exon 3, HtrA4; exonerna 4-6) 34,41. Ett neuralt radering av HtrA2, raderas med Cre rekombinas under kontroll av nestin promotorn (HtrA2 flox, Tg (Nes-CRE) 1Kln / J), har också beskrivits 34. Endast möss som saknar HtrA2, antingen systemiskt eller i neurala vävnader, visade tydliga fenotyper, uppvisar Parkinsons fenotyper.
Eftersom en del av dessa gener av intresse är belägen vara lokaliserad till mitokondrierna 11,44-47, och radering av HtrA2 genererade Parkinson fenotyper, en fenotypning regim med en mitokondriell och neurologisk fokus beskrivs här och representativa resultat från testerna av intresse tillhandahålls . För att undersöka genetiskt modifierade möss som produceras för att undersöka människa, åldersrelaterade sjukdomar noggrant och systematiskt en initial fenotypning schema bildades, bestående av en serie tester i samband med de två huvudsjukdomar av intresse: AMD och Parkinsons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Studier på djur genomfördes i enlighet med National Institutes of Health rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur och Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Yale University.
1. Behavioral Test av genetiskt modifierade möss
Obs: Alla möss bör underkastas samma testa regimen för att begränsa skillnader i tillvänjning till hantering. Tester bör utföras vid samma tid på dagen varje gång.
- Neonatal bakbenen Test
Obs! Bakben testet utförs dagligen från postnatal dag (P) 4 till P10 för att utvärdera proximal bakbensmuskelstyrka, svaghet och trötthet.- Transport möss till testområdet och låt vila 30 minuter före testning.
- Förbered testapparat genom att rengöra en 50 ml koniska rör med 70% etanol, driver två (P4-P8) eller en (P9-P10) bomullstussar till botten av tUbe och säkra i ett vertikalt läge.
- Ta en valp från buren och spela vikt. Håll valpen att hålla magasinet på värmedyna när inte testa.
- suspendera försiktigt bakbenen i det nyfödda barnet över kanten på den koniska röret, så att den är vänd nedåt mot bomullstussar. Räkna antalet dragförsök gjorts och mått latens att falla med hjälp av ett stoppur.
- Upprepa en gång sedan märka valpen med markören. Efteråt identifiera P6 valpar från tå klippning. Gnid valpar försiktigt med sängkläder från buren innan du byter.
- Torka koniskt rör med 70% etanol.
- Upprepa test på nästa valp tills hela kullen har testats.
- Avyttra bomullstuss och koniska rör. Rengör all utrustning med 70% etanol.
- Weanling Observation Test
Obs! Weanling observation testet administreras dagligen från P19 till P21 att göra mål rörelse och allmän aktivitetsnivå.- Transport möss till testområde ennd låt vila 30 minuter före testning.
- Förbered Plexiglas testa rutan med en 6x6 rutnät av 2 tums rutor på basen genom att rengöra med 70% etanol. Inrättat videoutrustning till sidan sådan att hela lådan är i siktfaltet. Håll inrättas och omgivning samma varje dag för att undvika att införa nyhet.
- Ta en Weanling från buren och lägg i en ren anläggning kopp. Rekord vikt.
- Börja videoinspelning genom att filma test identitetskort med identifikations mus antal, ålder och datum för testning. Överför musen från hållarkopp till centrum torget. Dags för tre minuter, räkna antalet linjer som trafikeras av båda framtassarna på musen under testet.
- Återgå musen till en ren bur och slut videoinspelning.
- Rengöra testapparaten med 70% etanol.
- Upprepa tills allt strö testas, sedan tillbaka alla valparna till hemmaburen.
- Rengör all testutrustning med 70% etanol.
- Ståltrådsnät greppstyrka Test
Obs! Greppstyrka testet utförs varannan dag mellan P22 och P26, för att bedöma den neuromuskulära styrka.- Transport möss till testområdet och låt vila i buren i 30 minuter före testning.
- Förbered apparaten genom att rengöra en plexiglaslåda och mesh grid med 70% etanol. Placera bubbelplast i botten av lådan och täck med papper.
- Separata möss i grupper om tre, placera i enskilda innehav koppar.
- Placera första musen på mitten av trådnätet och långsamt invertera 10-20 cm ovanför den mjuka ytan i botten av Plexiglas rutan. Mäta latensen att falla med hjälp av ett stoppur. Avsluta test efter 60 sekunder har förflutit om musen intefalla.
- Återgå musen för att hålla kopp, torka mesh med 70% etanol och ersätta papper över bubbelplast. Genomför testet på de två återstående mössen i gruppen innan han återvände till den första. Upprepa tills varje mus har testats totalt tre gånger.
- Återgå gruppen till en ren bur och fortsätta med återstående grupperna. Om det finns färre än tre möss i varje grupp, se till att en 5 min mellan prov återhämtning intervall tillåts.
- Återgå alla möss till hemmaburen, avyttra papper och ren testutrustning med 70% etanol.
2. Undersökning av näthinnan Struktur
- Söva djuren vid P30-35 genom intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (10 mg / kg). Utvärdera anestesidjupet genom klämma trampdynan och fortsätt bara i avsaknad av ett svar, i linje med IACUC riktlinjer. BEGJUTA med 4% PFA / PBS 48.
- För att ta bort ögonen, rengör huden på snittet site med 70% etanol, före skärning genom huden vid basen av skallen. Skala tillbaka huden för att exponera skallen och ren med 70% etanol. Med hjälp av rena instrument, skär försiktigt genom skallen för att nå ögonhålorna och exponera ögonen. Sever synnerven, försiktigt bort ögat från uttaget och skölj i PBS.
- Fixera ögonen i 4% PFA / PBS under 10 min vid rumstemperatur.
- Placera ögon i en liten petriskål med PBS. Göra ett litet snitt i mitten av hornhinnan med användning av stygnborttagning sax. Ta bort hornhinnan genom att skära kanten mellan hornhinnan och sklera. Använd pincett för att ta bort iris. Slutligen, dra av de RPE skikt, lämnar näthinnan intakt och linsen på plats.
Obs: 4% PFA / PBS fixering kommer att orsaka RPE avlossning möjliggör RPE att lätt skalas från utsidan av näthinnan. - Re-fix i 4% PFA / 30% sackaros / PBS under 15 min vid rumstemperatur innan de återvänder ögat till en petriskål innehållande PBS. Dra ut lenär med hjälp av pincett, vilket innebär att glaskroppen tillsammans med den.
- Cryoprotect i 30% sackaros över natten vid 4 ° C.
- Coat ögon i Optimal Cutting Temperature förening (oktober) och överföring till en inbäddning mögel som innehåller färsk oktober. Orientera ögat sådan att sagittalplanet är parallell med skärytan, med användning av så få förflyttningar som möjligt och att undvika införandet av luftbubblor. Flash frysa genom nedsänkning av formen i ett torris / etanol-bad. Förvara block vid -80 ° C.
- Med hjälp av en kryostat, skär 20 um sagittala sektioner och samla på förrenade diabilder.
- Stain sektioner med hematoxylin och eosin enligt standardprotokoll 49. Bild med ett ljusmikroskop utrustat för ljusfältsmikroskopi.
3. Histokemisk färgning
- prov~~POS=TRUNC
- Avliva djuren på P30-35 använder isofluran överdos (30% i propylenglykol) via öppna drop inandning. Bedöm dödshjälp av upphörandeandning, hjärtslag och bristande respons på nypa fotsulan. Bekräfta döden genom halshuggning och avlägsnande av organ, i linje med IACUC riktlinjer.
- För att ta bort hjärnan, tvätta huden vid incisionsstället med 70% etanol, före skärning genom huden vid basen av skallen. Skala tillbaka huden för att exponera skallen och ren med 70% etanol. Använda rena instrument, försiktigt skär genom skallen och ta bort för att exponera hjärnan. Ta bort membran och försiktigt bort hjärnan från skallen hålighet. Skölj i PBS.
- Coat hjärnan i oktober och överföring till en inbäddning mögel som innehåller färsk oktober Orientera hjärnan så att sagittalplanet är parallell med skärytan, med användning av så få förflyttningar som möjligt och att undvika införandet av luftbubblor. Flash frysa genom nedsänkning av formen i ett torris / etanol-bad och förvara vid -80 ° C.
- Med hjälp av en kryostat, skär 10 um sagittala sektioner och samla på förrenade diabilder.
<li> NADH Diaforas Färgning - Förbereda 0,05 M Tris-buffert, pH 7,6 genom upplösning av 5,72 g Tris-HCl och 1,66 g Tris-bas i 1L-avjoniserat vatten. Förvara vid 4 ° C i upp till sex veckor.
- Förbered NADH-lösning (2,25 mM NADH i 0,05 M Tris-buffert). Alikvot och förvara vid -20 ° C.
- Förbereda NBT-lösning (2,5 mM Nitro-tetrazolium i 0,05 M Tris-buffert). Förvara vid 4 ° C i upp till sex veckor i en glasflaska.
- Kombinera lika volymer av NADH-lösning och NBT-lösning för att göra färglösningen och tillsätt 1 ml till varje objektglas. Inkubera vid 37 ° C i en fuktig kammare under 30 min.
- Aspirera färgningslösningen och tvätta tre gånger med dH 2 O.
- Tvätta tre gånger vardera i stigande och fallande koncentrationer av aceton / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) under 2 min vid rumstemperatur.
- Skölj tre gånger i dH 2 O och montera delar med vattenbaserat medium. Bild med ett ljusmikroskop utrustat för ljusa field mikroskopi. Blå färgning motsvarar enzymatisk aktivitet.
- Succinatdehydrogenas histokemisk fargning
- Förbered 0,2 M natrium monobasiskt fosfat / dH 2 O och 0,2 M natriumfosfat dibasiskt / dH 2 O.
- Göra 0,2 M fosfatbuffert, pH 7,6 genom att kombinera 3 delar monobasiskt fosfat med 20 delar natrium dibasiskt fosfat.
- Förbered färglösningen (0,1 M natriumsuccinat, 1,25 M NBT i 0,2 M fosfatbuffert) och tillsätt 1 ml till varje bild. Inkubera vid 37 ° C i en fuktig kammare under 60 min.
- Aspirera färgningslösningen och tvätta tre gånger i dH 2 O.
- Tvätta tre gånger vardera i stigande och fallande koncentrationer av aceton / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) under 2 min vid rumstemperatur.
- Skölj tre gånger i dH 2 O och montera delar med vattenbaserat medium. Bild med ett ljusmikroskop utrustat för ljusfältsmikroskopi. Blå färgning motsvarar svzymatic aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta avsnitt beskrivs exempel på de resultat som kan erhållas med hjälp av dessa metoder. I hind-lem test, antalet dragförsök gjorts och latensen att falla summeras över två på varandra följande tester för varje dag. Detta test kan användas för att jämföra genetiskt olika grupper för att skilja möss med nedsatt neuromuskulär styrka HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) möss i figur 1A -. B visar ingen förändring av antalet dragningar och latens att falla från P4-6 följt av en minskning i neuromuskulär styrka vid P7-10, jämfört med kullsyskon (HTRA2 WT). Den förväntade ökningen i styrka med åldern är också observeras i vildtyp djur. För weanling observation testet kan total aktivitet utvärderas genom att summera alla händelser (linjerna passeras, uppfödning och grooming händelser), i genomsnitt över tre dagar i rad av tester. Alternativt kan varje specifik typ av händelse vara individually analyseras. Här representativa resultat presenteras, visar minskad aktivitet av HTRA2 KO-möss jämfört med WT kullsyskon. Dessa data visar att den totala aktiviteten kan mätas kvantitativt och jämföras mellan grupper (Figur 1C). Det är också möjligt att kvantifiera skillnader i greppstyrka genom att beräkna en genomsnittlig daglig från de tre upprepningarna som utförs på varje testning dag. När HTRA2 KO möss jämförs med kull kontroller, till en minskning i styrka manifesteras i en kortare latens falla (figur 1D).
H & E-färgning av näthinnan genererar bilder där retinal struktur kan undersökas och jämföras (Figur 2). Lagren av celltyper som utgör näthinnan är tydligt avgränsad tillåter jämförelser mellan genetiska grupper. Här, HtrA2 tm1jhoh ", HtrA3 tm1jhoh möss visar inga förändringar i näthinnans struktur, jämfört med HtrA2
Figur 1:. Behavioral fenotypning av genetiskt manipulerade möss HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) möss utsattes för den beskrivna beteendetestning och jämfördes med vildtyp (HTRA2 WT) kull kontroller. (A - B) bakbenet suspensionsprov utfördes på WT och KO nyfödda från P4-P10 och visar en minskning av neuromuskulärstyrka i KO djur (WT: n = 28, KO: n = 19). (A) KO valpar från början göra ett liknande antal dragförsök som WT syskon, men visar en minskning av försök som gjorts vid senare tidpunkter. (B) KO nyfödda "latens att falla är också initialt normalt men minskar från P7 framåt. (C) Den Weanling observation totala aktiviteten poäng reducerades i KO djur jämfört med WT kullsyskon, som är förenliga med minskad aktivitet av dessa möss (WT: n = 19, KO: n = 12). (D) KO djur hade också en minskad latens att falla under mask inversion testet, visar minskad greppstyrka av HTRA2 KO möss (WT: n = 17, KO: n = 9). Data representerar medelvärden ± SEM (# 0,1 <p <0,05, * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,001 av oberoende t-tester). Denna siffra har ändrats från Patterson et al. 34 Klicka här för att seen större version av denna siffra.
Figur 2:. H & E-färgning av retina Färgnings retinala sektioner med hematoxylin och eosin tillåter undersökning av strukturen, avgränsar de retinala skikten. Här delar från P35 HtrA2 WT, HtrA3 tm1jhoh (A) och HtrA2 tm1jhoh, HtrA3 tm1jhoh (B) för att visa normal retinal struktur. RPE: retinal pigmentepitel, OS: yttersegmenten, IS: innersegment, ENDA: yttre kärnlagret, OPL: yttre plexiformskiktet, INL: inre nukleära lagret, IPL: inre plexiform lager, GCL; ganglion cellager. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Fig. 3: Andnings komplex aktivitet Histokemisk färgning för NADH diaforas (komplex I) och succinatdehydrogenas (komplex II) aktivitet utfördes på tvärgående hjärn delar av P25 HtrA2 flox / flox, Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (NesKO) och HtrA2 + / flox, Tg (Nes-CRE) 1Kln / J (NesWT) samma kull. NADH diaforas enzymaktiviteten minskas i lillhjärnan (Crbl, B) och striatum (D) NesKO hjärnan jämfört med NesWT kontroller (A, C), men inte i hjärnbarken (E - F). SDH-aktivitet är på liknande sätt reduceras i cerebellum och striatum hos NesKO möss (H, J) jämfört med NesWT kontroller (G, I) men det finns ingen förändring i hjärnbarken (K - L). Skalstreck = 200 | j, m. Dettafigur har modifierats Patterson et al. 34 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Robust behandlingar behövs för att begränsa effekterna av försvagande tillstånd relaterade till människans åldrande, men de förblir svårfångade för många villkor. Att identifiera potentiella terapeutiska mål och utveckla strategier för intervention måste orsakerna och patologin av sjukdomar förknippade med åldrandet först förstås. Inte alla genetiskt modifierade möss omedelbart närvarande med tydliga fenotyper som är relaterade till sjukdomen av intresse, även om dessa gener har tidigare varit knuten till villkoret i humanstudier. Därför mer systematiska undersökningar krävs och genetiskt modifierade möss bör underkastas lämpliga experiment för att identifiera fenotyper som kan ha samband med de associerade sjukdomar hos människor.
Otaliga beteendetester finns för att analysera neurologisk funktion i möss 50,51. De beteendetester som beskrivs häri är anpassade till de hypoteser fenotyper baserade på mänskliga resultaten och de faktiska fenotyper observed i möss. Dessutom är dessa tester är enkla att utföra i laboratorier med liten eller ingen erfarenhet av att genomföra beteendeexperiment. Det finns inget krav på avancerad utrustning men resultaten är meningsfulla och informativa när korrekt samlas in, vilket gör dem användbara som ett första steg i att undersöka fenotypen av genetiskt modifierade möss som förväntas ha neuromuskulära defekter. De resulterande data kan sedan användas för att styra inriktningen på ytterligare tester, potentiellt med mer sofistikerade testapparat.
På liknande sätt existerar många tekniker för bedömning lungfunktion i vävnader 52. Att mäta graden av ATP-syntesen, syreförbrukning eller förändringar i mitokondriell membranpotential är viktiga avläsning av mitokondriefunktion, men de kan vara komplicerat och tidskrävande att utföra, kräver särskilda reagenser och utrustning 52-55. Dessutom är de ofta begränsade till nivån för den mitochondRion eller cell, att förlita sig på odlade celler, lysat eller isolerade mitokondrier. Histokemisk fargning är ett viktigt första steg i att identifiera mitokondriell dysfunktion utan en stor investering i tid eller resurser. Dessutom, förmågan att färga vävnadssnitt lämpar sig för att snabbt identifiera regionala skillnader som kanske inte är så uppenbara med andra tekniker, till exempel det områdesspecifika förlust av enzymatisk färgning observerades i HtrA2 fattiga hjärnan. Medan tekniken är begränsad i sin förmåga att mäta faldiga förändringar i kapacitetsandnings, det kartlägger definierade områden i hjärnan som sedan kan eftersträvas med hjälp av mer komplexa metoder.
Medan tekniker som presenteras i denna fenotypning schema är enkla att genomföra, utföra vissa steg på rätt sätt är avgörande för framgången för experimenten. För beteende fenotypning måste stor försiktighet iakttas för att säkerställa tester utförs vid samma tidpunkt och på samma plats varje dag för att begränsa variationen introproduceras vid det nya i plats eller av skillnaden i dygnsrytmen. Utrustningen bör organiseras på samma sätt varje dag av liknande skäl. Rummet organisation är särskilt kritisk för aktivitetstestet, där små förändringar i nyhet i hög grad kan påverka aktiviteten hos mus. Vid mätning greppstyrka bör utredarna konstatera att möss har en ordentlig tag i nätet före inversion. På samma sätt måste man för att på rätt sätt avbryta valpen innan du släpper i bakbenet testet eller testresultaten kommer att skev mot en kortare latens att falla.
För vävnads fenotypning, få bra avsnitt är avgörande. Informativ färgning av näthinnan beror på effektiv fixering före dissekering eller artefakter uppstår under sektionering och dissekering och förvränga morfologi. Histokemisk fargning kräver hjärnor att frysas snabbt efter dissekering för att bevara enzymfunktion, men inkubationstiden är liknande critical; små variationer i temperatur eller i längden på tid kan orsaka skillnader i färgningens intensitet. Om det är möjligt bör proverna behandlas samtidigt för att möjliggöra jämförelser mellan grupper.
Här en testregim som används för att studera genetiskt modifierade möss förväntas visa subtila fenotyper i samband med åldersrelaterade sjukdomar, nämligen AMD och PD, beskrivs. Denna fenotypning schema kan användas för att identifiera brister i neuromuskulär styrka och aktivitet, samt identifiera strukturella och funktionella defekter i vävnaderna av intresse. Detta schema ger en systematisk analys av tidiga fenotyper hos unga, genetiskt förändrade möss. I framtiden kan denna metod tillämpas på genetiskt modifierade möss som förväntas uppvisa en AMD eller PD relaterad fenotyp, liksom de med okänd etiologi som visas öppet normalt. Enkelheten testerna medger testning utan betydande investeringar, men kan användas för att informera ytterligare studies. Genom att kombinera beteendetestning med cell fenotypning, är det möjligt att begränsa antalet möss som användes och direkt jämföra djur prestanda med fysiologiska tillstånd. Detta fenotypning schema ger en första analys som kan användas för att styra inriktningen av efterföljande studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansieringen av denna forskning kom från Rosebay Medical Foundation och Yale Medical School Dean Research Fund (JH). Vi tackar Dr Claire Koenig för att få hjälp med beteendeexperiment. Genetiskt manipulerade muslinjer alstrades vid Ozgene (Perth, Australien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
- Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
- Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
- Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
- Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
- Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
- Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
- Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
- Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
- Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
- Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
- Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
- Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
- Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
- Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
- Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
- Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
- Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
- Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
- Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
- Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
- Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
- Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
- Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
- Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
- Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
- Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
- Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
- Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
- Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
- Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
- Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
- Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
- Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
- Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
- Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
- Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
- Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
- Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
- Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
- Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
- Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
- El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
- Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
- Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).
