Introduction
גיל הקשורים במחלות הופכות נפוצות יותר ויותר בחברה מודרנית. ככל שמדע הרפואה משפר שתוחלת החיים, האוכלוסייה ממשיכה גיל והנטל של מחלות אלה גדל. טיפולים יעילים נחוצים כדי להפחית את ההשפעה של תנאים מתישים אבל להישאר חמקמקים במקרים רבים. רק על ידי הבנת הגורמים ופתולוגיה של מחלות הקשורות להזדקנות מדענים יכולים להתחיל לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאל ולפתח אסטרטגיות להתערבות. מצבים שכיחים כתוצאה מהזדקנות כוללים הפרעות ניווניות כגון מחלת פרקינסון (PD) וניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD). PD הוא הפרעת תנועה הנפוצה ביותר הנגרמת על ידי ניוון מוחיה בבני אדם. רוב חולי פרקינסון להראות תסמינים כגון נח רעד, bradykinesia ונוקשות אחרי 50 שנים של גיל. התחלה מוקדמת גם נצפתה כ -10% מהמקרים.
AMD הוא הגורם המוביל לעיוורוןקולטני האור קשישים, נזק בהדרגה אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) בעיניים. הראייה המרכזית נפגעת אבל חזון הפריפריה היא בדרך כלל לא מעושה. ישנן שתי צורות של AMD. בטופס "יבש", פיקדונות חלבון תאי המכונה טופס דרוזן בין הרשתית ואת הממברנה של ברוך (BM), מה שמוביל אטרופיה גיאוגרפית וטשטוש ראייה מרכזית. החמור יותר "רטוב" תוצאות טופס מ נאווסקולריזציה מן דמית פני BM לתוך שכבות הרשתית ואת קולטי האור ויכול להוביל hamorrhaging מתחת הרשתית הגורמת נזק בלתי הפיך רקמת הרשתית. הגנום במחקרי קשר רחב זיהו בעבר לוקוסים המשויכים רגישות מוגברת למחלות הזה, והתייחס לשני אזורים של עניין: H גורם המשלים (CFH) על כרומוזום 1 ואת מוקד 10q26, שבו הרגישות Maculopathy הקשורות לגיל 2 (ARMS2) ו A1 גורם הדרישה בטמפרטורה גבוהה (HtrA1) הגנים ממוקמים 1-5 3-6.
CFH פועלת כרגולטור שלילי של הנתיב החלופי (AP) של המערכה המשלים על ידי עיכוב ההפעלה של C3. פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNP) נקשר לסיכון מוגבר AMD, גרימת חילופי טירוזין 402 אקסון 9 עם היסטידין עקב T ל- C החלפה 1. ב AMD הוא האמין כי AP הוא misregulated בגלל אובדן התפקוד של CFH אבל אם SNP ממלא תפקיד סיבתי ברור. אחת ההשערות היא כי היסטידין בעלי מטען חשמלי חיובי הוא חשב לשלול את היכולת של CFH להיקשר אינטראקציה חלבונים C-reactive 1,7 חלבון הפרין סולפט. במחקרים במבחנה של CFH Y402H לספק תוצאות סותרות על ההבדלים הפונקציונליים בין גרסאות, וב vivo עבודה <em> CFH - / - בעכברים המבטאים CFH אנושי הוא 8 מתמשך. ARMS2 ממוקם במעלה הזרם של HtrA1 בגנום הפרימטים, למרות הגן התאור בעכברים. HtrA1 הוא פרוטאז סרין אבל ARMS2 מאופיין גרוע. לחוסר-היציבות ההצמדה בין SNPs שעבר על המקורות הקשורים AMD עשו את זה קשה לקבוע את התרומה לסיכון של מוטציות בודדות של הגנים באזור זה, אולם מחקר חדש הציע שזה ביטוי יתר של HtrA1 ולא ARMS2 שמוביל נאווסקולריזציה ו פיקדונות חלבון subretinal 9-11. עם זאת, קרבתה של גני מוקד זה עשויה לאפשר אינטראקציות כי לא ניתן ללמוד באמצעות transgenes מוכנס באופן אקראי.
בנוסף AMD, משפחת HtrA של סרין פרוטאז נקשרה עם מחלות אנושיות רבות. כל חלבוני HtrA להכיל דומיין פרוטאז סרין ואחריו לפחות תחום אחד PDZ C- מסוף. HtrA1, HtrA3 ו HtrA4 חולקים את גרהומולוגיה eatest, המורכב פפטיד האות, גורם גדילה דמוי אינסולין תחום מחייב, תחום מעכב פרוטאז Kazal, התחום פרוטאז סרין ואת תחום PDZ. יש HtrA2 חנקן הסופית- שונה, מורכב תחום רצף לוקליזציה המיטוכונדריה, הטרנסממברני מעכב של תחום מחייב אפופטוזיס ואחריו תחומי פרוטאז ו PDZ 12-16. HtrA1 היונק מוסדר על ידי שיפוץ הנגרמת מצע האתר הפעיל של תחום פרוטאז שלה 17-20, ו HtrA2 יכול גם להיות מווסת על ידי אינטראקציה בין פרוטאז סרין ותחומי PDZ מדכא פעילות הפרוטאז 21. מעניין לציין, כי תחום PDZ אינו מופיע להעניק רגולציה דומה HtrA3 16. פרוטאזות HtrA ניתן לווסת גם על ידי גורמים חיצוניים: זה הודגם לאחרונה כי קיימת אינטראקציה בין הרגולציה HtrA1 ו protoporphyrins 22 ו HtrA2 יכול להיות מוסדר על ידי זרחון באקטיבציה של קינאז MAP p38מסלול באופן PINK1 תלוי 23. המחיקות של חברים בודדים של משפחת HtrA בעכברים תועד, אולם תופעות מכניסטית בעיקר אינם ברורים בין היתר בשל חוסר פנוטיפים גלוי.
HtrA1 ממלא תפקיד חשוב בבקרת איכות חלבון ויסות לא תקין או מוטציה שלו נמצא קשור למחלות רבות אנושיים שונים כולל דלקת פרקים, סרטן וסיכון מוגבר של AMD 3,4,24-32. אובדן תפקוד HtrA2 ברקמות עצביות נקשר עם פנוטיפים PD בבני אדם ועכברים, בעוד ההפסד שלה מתוצאות רקמות שאינן עצביות ההזדקנות מואצת 33-37. Dysregulation HtrA3 נקשרה עם מחלות כולל רעלת הריון וסוגים מסוימים של סרטן 38,39. Up-רגולציה של HtrA4 נצפתה השליות של חולי רעלת הריון אבל עכברי בנוקאאוט אינו מציגה פנוטיפ גלוי 40,41. חוסר פנוטיפים שנצפה כמה עכברים בנוקאאוט כברהניחו להיות תוצאה של פיצוי בין בן משפחה HtrA: הוא חשב כי הן HtrA4 ו HtrA1 אינטראקציה עם משפחת TGF-B של חלבונים, המאפשר פיצוי ידי HtrA1 על מחיקת HtrA4 41. בדומה לכך, הוא חשב כי מאז HtrA1 ו HtrA3 יש רמה גבוהה של homologies תחום שיצטרכו פונקציות משלימות 42. עם זאת, הוצע כי חלבוני HtrA ייתכן תפקידים אנטגוניסטית חלקית, מתחרים להסדיר מטרות משותפות 43.
כדי להמשיך לחקור סיכון אלו שלושה גורמי קווי עכבר נוק-ב מואנשים נוצרו. בשנת CFH TM1 (CFH * 9) jhoh ו CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, אקסון 9 של הגן CFH מוחלף אקסון 9 של homologue האדם. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh המקודד את טירוזין הקשורים שאינם המחלה שאריות במיקום 402, ואילו CFH TM2 (CFH * 9) jhoh נושא את Y402H, SNP הקשורים בסיכון. בARMS2 tm1jhoh רצף ARMS2 אדם היה ממוקד לאזור במעלה הזרם של HtrA1. רצף STOP-ולצדו loxP להציב במעלה זרם של רצף הגן אבל במורד הזרם של אמרגן UbiC הכלול היה נכרת על ידי חצייה לעכברי OzCre, מבטאי Cre recombinase תחת השליטה של אמרגן Rosa26, כפי שתוארו לעיל 34. נוסף על אלה עקום בתורים, אללים בנוקאאוט מותנה עבור CFH ו HtrA1 (CFH tm1jhoh ו tm1jhoh HtrA1), כמו גם את בני המשפחה HtrA ידועים אחרים נוצרו: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (tm1jhoh HtrA3) ו HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Knockouts ניבט אונליין נוצר על ידי חציית עכברי OzCre לבעלי החיים המהונדסים כדי לאגף אקסונים ספציפית עם אתרי loxP, כך מחיקה גורמת לשינוי מסגרת ו / או מחיקה של התחום הפעיל (CFH; אקסון 3, HtrA1; אקסונים 2-3, HtrA2: אקסונים 2-4, HtrA3; אקסון 3, HtrA4; אקסונים 4-6) 34,41. מחיקה עצבית של HtrA2, שנמחקה באמצעות Cre recombinase תחת השליטה של אמרגן Nestin (HtrA2 flox; Tg (נוס-cre) 1Kln / J), אף תואר 34. עכברים רק חסרי HtrA2, או מערכתי או ברקמות עצביות, מוצגים פנוטיפים ברורים, עם הצגת פנוטיפים פרקינסון.
מכיוון שחלק מהגנים הללו אינטרסים הניחו להיות מקומי כדי המיטוכונדריה 11,44-47, ומחיקה של HtrA2 שנוצר פנוטיפים פרקינסון, משטר phenotyping עם דגש המיטוכונדריה ונוירולוגיות מתואר כאן לתוצאות נציג בדיקות עניין מסופקים . על מנת לבחון עכברים מהונדסים גנטי מיוצרים לחקור אדם, מחלות הקשורות לגיל ביסודיות ואת לוח זמני phenotyping ראשוני שיטתי הוקם, מורכב מסדרה של בדיקות קשורות השני הראשימחלות של עניין: AMD ופרקינסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אתיקה הצהרה: מחקרים שכללו חיות נערכו בהתאם המכונים הלאומיים המלצות הבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת ייל.
בדיקות התנהגותיות 1. של עכברים מהונדסים גנטית
הערה: כל העכברים צריכים להיות כפופים לאותה משטר הבדיקות להגביל הבדלי התרגלות טיפול. בדיקות יש לבצע בו זמנית של יום בכל פעם.
- Neonatal הינד לימב מבחן
הערה: מבחן הגפיים האחורי מתנהל יומי מיום הלידה (P) 4 עד P10 להעריך את כוח שרירי גפיים האחוריים הפרוקסימלי, חולשה ועייפות.- עכברי תחבורה לאזור בדיקות ולאפשר לנוח למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
- הכן מנגנון בדיקה על ידי ניקוי צינור חרוטי 50 מ"ל עם 70% אתנול, דוחפת שני (P4-P8) או אחד (P10-P9) כדורי צמר גפן לתחתית של tUbe ואבטחת במצב אנכי.
- הסר גור אחד מן המשקל כלוב ולהקליט. שמור גור להחזיק מגש על משטח חום בכל פעם לא בודק.
- בעדינות להשעות את הגפיים האחוריים של הילוד מעל השולי של צינור החרוטים, כך הוא פונה כלפי מטה לעבר כדורי צמר גפן. ספירת ניסיונות למשוך עשה חביון מידה ליפול באמצעות סטופר.
- חזור פעם נוספת עליו מדבקה את הגור בטוש. לאחר מכן, לזהות גורים P6 ידי גזיר הבוהן. לשפשף בעדינות את גורים עם מצעים מכלוב הביתה לפני ההחלפה.
- נגב צינור חרוטים עם 70% אתנול.
- חזור על בדיקות על הגור הבא עד ההמלטה כולו נבדקה.
- השלך כדור צמר גפן צינור חרוטים. ציוד כל נקי עם אתנול 70%.
- יַנוּקָא תצפית מבחן
הערה: מבחן תצפית יַנוּקָא מנוהל מדי יום בין P19 ל P21 להבקיע רמות תנועה ופעילות כללית.- עכברי תחבורה לאזור בדיקותnd מניח לנוח למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
- כן תיבת בדיקות פרספקס המסומנות רשת 6x6 של 2 ריבועי אינץ על הבסיס ידי ניקוי עם אתנול 70%. הגדרת ציוד וידאו לצד כאלה שהתיבה כולו בתחום הצפייה. שמור את להגדיר הסביבה אותו כל יום כדי למנוע החדרת חידוש.
- הסר יַנוּקָא אחד מהכלוב ומכניס כוס החזקה נקיה. משקל שיא.
- בגין הקלטת וידאו על ידי לצלם את תעודת זהות הבדיקה, עם מספר זיהוי עכבר, גיל ותאריך הבדיקה. עבר עכבר מהחזקת כוס לכיכר במרכז. זמן במשך שלוש דקות, סופר את מספר השורות נחצות על ידי שני כפותיה הקדמיות של העכבר במהלך הבדיקה.
- חזור עכבר כדי הקלטת וידאו כלוב קצה נקיה.
- נקה את מנגנון הבדיקה עם אתנול 70%.
- חזור על הפעולה עד כל המלטה נבחנת, ואז להחזיר את כל הגורים לכלוב בבית.
- הציוד יש לנקות את כל הבדיקות עם אתנול 70%.
- בדיקה של עוצמת גריפ קווים
הערה: מבחן כוח האחיזה מתנהל לסירוגין בין P22 ו- P26, להעריך כוח התוקפת.- עכברי תחבורה לאזור בדיקות ולאפשר לנוח בכלוב בבית למשך 30 דקות לפני הבדיקה.
- כן מנגנון על ידי ניקוי רשת קופסא רשת פרספקס עם 70% אתנול. מניח באריזת בועות בתחתית התיבה ומכסים בנייר.
- עכברים נפרדים לקבוצות של שלוש, צבת בכוסות החזקת פרט.
- יש לשים את הסמן ראשון במרכז של רשת התיל ולאט לאט להפוך 10-20 סנטימטר מעל המשטח הרך בחלקו התחתון של תיבת פרספקס. מדוד את חביון ליפול באמצעות סטופר. סיימתי בדיקה לאחר 60 שניות חלפו אם העכבר לאנפילה, ליפול.
- חזור עכבר כדי כוס מחזיקה, לנגב רשת עם אתנול 70% ולהחליף נייר על נייר הבועות. לבצע את הבדיקה על שני עכברים הנותרים בקבוצה לפני החזרה הראשונה. חזור על הפעולה עד כל עכבר נבדק בסך הכל שלוש פעמים.
- מחזיר את הקבוצה לכלוב נקי ולהמשיך עם שאר קבוצות. אם יש פחות משלושה עכברים בכל קבוצה, להבטיח כי מרווח התאוששות 5 דקות בין משפט מותר.
- להחזיר את כל העכברים לכלוב בבית, להשליך נייר וציוד בדיקה נקי עם אתנול 70%.
בחינת 2. מבנה רשתית
- לטשטש בעלי חיים שנמצאים P30-35 בזריקה intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג). הערכת עומק ההרדמה על ידי צובט את שודד הדרכים והמשך רק בהעדר תגובה, עולים בקנה אחד עם הנחיות IACUC. Perfuse עם 4% PFA / PBS 48.
- כדי להסיר את העיניים, לנקות את העור סי החתךte עם 70% אתנול, לפני שהם חותכים דרך העור בבסיס הגולגולת. לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת ונקיה עם 70% אתנול. שימוש בכלים לנקות, לחתוך בזהירות דרך הגולגולת להגיע ארובות עיניים ולחשוף את העיניים. לנתק את עצב הראייה, מסיר את העין בעדינות מהשקע ולשטוף ב PBS.
- תקן שעיניו 4% PFA / PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הניח עיניים בצלחת פטרי קטנה המכילה PBS. לעשות חתך קטן במרכז הקרני באמצעות מספרי הסרת תפר. הסר את הקרנית על ידי חיתוך הקצה בין הקרנית בלובן העין. שימוש במלקחיים כדי להסיר את איריס. לבסוף, לקלף את שכבות הרשתית, עוזב את שלמי רשתית העדשה במקום.
הערה: קיבוע 4% PFA / PBS יגרום ניתוק רשתית המאפשר הרשתית עליו לקלף בקלות מהחלק החיצוני של הרשתית. - Re-fix ב 4% PFA / 30% סוכרוז / PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני החזרת עין אל צלחת פטרי המכילה PBS. משוך את lens באמצעות מלקחיים, להביא את הגוף הזגוגי יחד עם זה.
- Cryoprotect ב סוכרוז 30% בין לילה ב 4 ° C..
- עיניים מעיילות במתחם טמפרטורת חיתוך אופטימום (OCT) והעברת עובש הטבעה המכיל אוקטובר הטרי. אוריינט העין כך במישור sagittal מקביל עם הפנים חיתוך, באמצעות תנועות מעטות ככל האפשר והימנעות כניסתה של בועות אוויר. פלאש להקפיא ידי טבילת העובש באמבט קרח / אתנול יבש. בלוקי חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
- באמצעות cryostat, לחתוך 20 מיקרומטר חלקים sagittal ולאסוף בשקופיות precleaned.
- הכתם בסעיפים עם hematoxylin ו eosin פי פרוטוקולים סטנדרטיים 49. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד מיקרוסקופ שדה בהיר.
3. histochemical מכתים
- לדוגמא הכנה
- להרדים בעלי חיים שנמצאים P30-35 באמצעות מנת יתר isoflurane (30% ב פרופילן גליקול) באמצעות שאיפת טיפה פתוחה. להעריך המתת חסד על ידי ההפסקהשל נשימה, דופק חוסר בתגובה צובט את שודד הדרכים. אשר למוות על ידי נקע בצוואר הרחם כריתת איברים, עולה בקנה אחד עם הנחיות IACUC.
- כדי להסיר את המוח, לנקות את העור במקום החתך עם 70% אתנול, לפני שהם חותכים דרך העור בבסיס הגולגולת. לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הגולגולת ונקיה עם 70% אתנול. שימוש בכלים לנקות, לחתוך בזהירות דרך הגולגולת ולהסיר כדי לחשוף את המוח. הסר את הקרומים, בעדינות להסיר את המוח מחלל הגולגולת. יש לשטוף ב- PBS.
- מעיל המוח ב אוקטובר ולהעביר עובש הטבעה המכיל אוקטובר טריים. אוריינט המוח כך במישור sagittal מקביל עם הפנים חיתוך, באמצעות תנועות מעטות ככל האפשר והימנעות כניסתה של בועות אוויר. פלאש להקפיא ידי טבילת העובש באמבט ולאחסן יבש קרח / אתנול ב -80 מעלות צלזיוס.
- באמצעות cryostat, לקצץ 10 מיקרומטר חלקים sagittal ולאסוף בשקופיות precleaned.
<li> NADH Diaphorase מכתים - הכן 0.05 חיץ M טריס, pH 7.6 ידי המסת 5.72 גרם טריס-HCl ובסיס 1.66 גרם טריס במים 1L-יונים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה שבועות.
- כן פתרון NADH (2.25 NADH מ"מ 0.05 חיץ M טריס). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
- הכן פתרון NBT (2.5 מ"מ ניטרו-כחול tetrazolium 0.05 חיץ M טריס). חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה שבועות בבקבוק זכוכית.
- מערבבים כמויות שוות של הפתרון NADH פתרון NBT לעשות פתרון מכתים ולהוסיף 1 מ"ל לכל שקופית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified למשך 30 דקות.
- פתרון מכתים לשאוב ולשטוף שלוש פעמים עם DH 2 O.
- לשטוף שלוש פעמים כל אחד עולה וריכוזי יורד של אצטון / DH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף שלוש פעמים ב DH 2 O ו הר קטעים עם בתווך מימי. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור מצוידת f הבהירמיקרוסקופיה ield. מכתים הכחולים מתאים הפעילות האנזימטית.
- Succinate dehydrogenase histochemical מכתים
- הכן 0.2 M פוספט monobasic נתרן / DH 2 O ו 0.2 M פוספט dibasic נתרן / DH 2 O.
- הפוך 0.2 M חיץ פוספט, pH 7.6 ידי שילוב 3 חלקים פוספט monobasic עם 20 פוספט dibasic חלקים נתרן.
- הכן פתרון מכתים (0.1 M succinate נתרן, 1.25 M NBT ב 0.2 M חיץ פוספט) ולהוסיף 1 מ"ל לכל שקופית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified למשך 60 דקות.
- פתרון מכתים לשאוב ולשטוף שלוש פעמים ב DH 2 O.
- לשטוף שלוש פעמים כל אחד עולים ויורדים ריכוזים של אצטון / DH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף שלוש פעמים ב DH 2 O ו הר קטעים עם בתווך מימי. תמונה באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד מיקרוסקופ שדה בהיר. מכתים הכחולים מתאים enפעילות zymatic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מתאר דוגמאות של תוצאות השגה באמצעות שיטות אלה. במבחן-הגפיים האחוריות, מספר ניסיונות למשוך עשה ואת חביון ליפול מסוכמים על שתי בדיקות רצופות עבור כל יום. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להשוות קבוצות שונות גנטית להבחין עכברים עם כוח התוקפת מופחת tm1jhoh HtrA2 (KO HTRA2) עכברים באיור 1 א -. B להפגין לא חל שינוי במספר משיכות חביון לרדת מ P4-6 ואחריו ירידה בחוזק התוקפת ב P7-10, לעומת להמלטה (WT HTRA2). העלייה הצפויה כוח עם גיל היא גם נצפה חי wild-type. עבור בדיקת תצפית יַנוּקָא, פעילות הכוללת יכולה להיות מוערכת על ידי סיכום כל האירועים (קווים חצו, גידול וטיפוח אירועים), בממוצע על פני שלושה ימים הרצופים של בדיקות. לחלופין, כל סוג מסוים של אירוע יכול להיות individually מנותח. תוצאות נציג כאן מוצגות, הוכחת פעילות מופחתת של עכברי HTRA2 KO לעומת להמלטת WT. נתונים אלה מראים כי פעילות הכולל ניתן למדוד כמותית לעומת בקבוצות (תרשים 1C). כמו כן ניתן לכמת הבדלי כוח אחיזה על ידי חישוב ממוצע יומית מהשלוש החזרות בצעו בכל יום בדיקות. כאשר עכברים KO HTRA2 הם בהשוואה לקבוצת הביקורת להמלטה, הפחתות כוח מתבטאים חביון קצר ליפול (1D איור).
צביעת H & E של הרשתית מייצר תמונות שבהן מבנה הרשתית ניתן לבחון ולעומת (איור 2). השכבות של סוגי תאים שמרכיבי הרשתית נשמרות היטב המאפשר השוואה בין קבוצות גנטיות. הנה, tm1jhoh HtrA2 '; עכברים tm1jhoh HtrA3 אינה מראה כל שינוי מבנה הרשתית, לעומת HtrA2
איור 1:. Phenotyping התנהגותיים של עכברים מהונדסים גנטית tm1jhoh HtrA2 (HTRA2 KO) עכברים היו נתונים בדיקות התנהגותיות תיאר ולעומת wildtype (WT HTRA2) שולטת להמלטה. (א - ב) מבחן השעית גפיים האחורי בוצע על ילודי WT ו KO מ-P10 P4 ומדגים ירידה עצבית-שריריתכוח בחי KO (WT: n = 28, KO: n = 19). (א) גורי KO בתחילה לעשות מספר דומה של ניסיונות למשוך כאחי WT, אבל מצביעים על ירידה בניסיונות שנעשו בנקודות זמן מאוחר יותר. (ב) "חביון בילודים KO ליפול גם בתחילה נורמלי אבל יורד מ P7 ואילך. (ג) פעילות הכולל תצפית יַנוּקָא ציון הופחת בחיות KO לעומת להמלטה WT, עולה בקנה אחד עם פעילות מופחתת של עכברים אלה (WT: n = 19, KO: n = 12). (ד) חיות KO גם היה חביון מופחת ליפול במהלך הבדיקה היפוך רשת, הפגנת כוח אחיזה מופחתת של עכברים HTRA2 KO (WT: n = 17, KO: n = 9). נתונים מייצגים הממוצע ± SEM (# 0.1 <p <0.05, * p <0.05, ** p <0.001, *** p <0.001 ידי t-בדיקות עצמאיות). נתון זה יש הבדל בין ואח 'פטרסון. 34 אנא לחצו כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. H & E מכתים של הרשתית סעיפים רשתית מכתים עם hematoxylin ו eosin מאפשר בחינה של מבנה, המגדירה את שכבות הרשתית. הנה קטעים מתוך WT HtrA2 P35; HtrA3 tm1jhoh (א) ו HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (ב) להציג מבנה הרשתית נורמלי. רשתית: אפיתל הפיגמנט ברשתית, OS: מגזרים חיצוניים, IS: מגזרים פנימיים, ONL: שכבת גרעין חיצונית, OPL: שכבת plexiform חיצונית, INL: שכבת גרעין פנימית, IPL: שכבת plexiform פנימית, GCL; שכבת תא גנגליון. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
-page = "1"> 
. איור 3: פעילות מורכבת הנשימה מכתים histochemical עבור diaphorase NADH (אני מורכבים) ו dehydrogenase succinate (מורכבים II) והפעילות שבוצעה חלקים במוח רוחבי של HtrA2 P25 flox / flox; Tg (נס-cre) 1Kln / J (NesKO) ו HtrA2 + / flox; Tg (נס-cre) 1Kln / J (NesWT) להמלטה. פעילות האנזים diaphorase NADH הוא ירד ב המוח הקטן (Crbl, B) בסטריאטום (D) של המוח NesKO בהשוואה לקבוצת הביקורת NesWT (A, C), אך לא קליפת המוח (E - F). SDH הפעילות מצטמצמת באופן דומה במוח קטן בסטריאטום של עכברי NesKO (H, J) בהשוואה לקבוצת ביקורת NesWT (G, I) אך אין שינוי קליפת מוח (K - L). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. זֶהדמות יש הבדל בין פטרסון et al. 34 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיפולים חזקים נדרשים להגביל את שפעת תנאים מתישים הקשורות להזדקנות אדם, אבל הם נשארים חמקמקים עבור מחלות אלו. כדי לזהות מטרות טיפוליות פוטנציאל ולפתח אסטרטגיות להתערבות, הגורמים ופתולוגיה של מחלות הקשורות להזדקנות יש להבין תחילה. לא כל העכברים המהונדסים גנטי מייד נוכחיים עם פנוטיפים ברורים שאינם קשורים למחלה של עניין, גם אם הגנים האלה קושרו בעבר למצב במחקרים בבני אדם. לכן יותר חקירות שיטתיות נדרשות מהונדסים גנטי עכברים צריכים להיות נתון ניסויים המתאימים לזהות פנוטיפים שעשויים להיות קשור למחלות הקשורות בבני אדם.
בדיקות התנהגותיות מיריאד קיימים כדי assay תפקוד נוירולוגי בעכברים 50,51. הבדיקות התנהגותיות שהותוו לעיל מתאימות פנוטיפים שיערותיו מבוססים על ממצאי אדם ואת פנוטיפים בפועל observed בעכברים. בנוסף, בדיקות אלה פשוט לבצע במעבדות ללא מעט או אפילו ניסיון בעריכת ניסויים התנהגותיים. אין דרישה לציוד מתוחכם אבל התוצאות הן משמעותיות ואינפורמטיבי כאשר נאספו כראוי, מה שהופך אותם שימושים כצעד ראשון יש לבחון את הפנוטיפ של עכברים מהונדסים גנטי, צפויים להיות בעלי פגמים תוקפים. נתוני כתוצאה מכן ניתן להשתמש כדי לכוון את הפוקוס של בדיקות נוספות, באופן פוטנציאלי עם מנגנון בדיקה מתוחכם יותר.
באופן דומה, שיטות רבות קיימות להערכה תפקוד נשימה ברקמות 52. מדידת קצב סינתזת ATP, צריכת חמצן או שינויים בפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה הוא readouts החשוב של תפקוד המיטוכונדריה אבל הם יכולים להיות מסובכים וזמן רב כדי לבצע, מחייב ריאגנטים ספציפיים וציוד 52-55. בנוסף, הם מוגבלים לעיתים קרובות ברמה של mitochondריאון או סלולריים, בהסתמך על תאים בתרבית, lysates או המיטוכונדריה מבודד. מכתים histochemical הוא צעד ראשון שימושי בזיהוי תפקוד המיטוכונדריה ללא השקעה גדולה של זמן או משאבים. יתר על כן, את היכולת להכתים סעיפי רקמות ניתנת לזיהוי הבדלים אזוריים במהירות כי בהכרח גלוי לעין כמו עם טכניקות אחרות, למשל האובדן ספציפי בתחום מכתים האנזימטית שנצפה מוח HtrA2 המחסר. בעוד הטכניקה היא מוגבלת ביכולתה כדי למדוד שינויים של פי קיבולת הנשימה, זה ממפה אזורי מוח מוגדר, כי אז יכול להיות רדוף באמצעות שיטות מורכבות יותר.
בעוד הטכניקות שהוצגו בתוך לוח הזמנים phenotyping זה הם פשוט לנהל, ביצוע צעדים מסוימים כמו שצריך הוא קריטי להצלחת הניסויים. עבור phenotyping התנהגותיים, בזהירות רבה יש לנקוט על מנת להבטיח הבדיקות מבוצעות באותו זמן באותו מקום בכל יום כדי להגביל intro וריאציהduced מהחידוש של מיקום או על ידי הבדל קצב היממה. הציוד צריך להיות מאורגן באותה צורה כל יום מסיבות דומות. ארגון החדר הוא קריטי במיוחד עבור הבדיקה הפעילות, שבו שינויים קטנים חידוש יכולים להשפיע על הפעילות של העכבר מאוד. כאשר מודדים כוח אחיזה, חוקרים צריכים לוודא שיש עכברים אחיזה נכונה של הרשת לפני ההיפוך. בדומה לכך, יש להקפיד להשעות את הגור כראוי לפני השחרור במבחן הגפיים האחורי או תוצאות הבדיקה יהיה מוטה כלפי חביון קצר לנפול.
עבור phenotyping רקמה, קבלת סעיפים טובים היא חיונית. מכתים אינפורמטיבי של הרשתית תלויה קיבוע יעיל לפני לנתיחה או חפצים תקום במהלך חתך דיסקציה ולעוות את המורפולוגיה. מכתים histochemical דורש המוח להיות קפוא במהירות לאחר לנתיחה כדי לשמור על תפקוד האנזים, אך זמן הדגירה הוא דומה critical; תנודות קטנות בטמפרטורה או את משך הזמן יכול לגרום ההבדלים בעוצמת מכתים. במידת האפשר, צריך להיות מעובד דגימות בעת ובעונה אחת על מנת לאפשר השוואה בין הקבוצות.
כאן משטר בדיקות בשימוש ללמוד עכברים מהונדסים גנטיים צפויים להציג פנוטיפים עדינים הקשורים מחלות הקשורות לגיל, כלומר AMD ו- PD, מתואר. לוח זמני phenotyping זה יכול לשמש כדי לזהות ליקויי כוח תוקפת ופעילות, וכן לזהות פגמים מבניים ותפקודיים בתוך הרקמות של עניין. לוח זמנים זה מספק ניתוח שיטתי של פנוטיפים מוקדם צעירים, עכברים שינו גנטי. בעתיד, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל עכברים מהונדסים גנטיים, יציג עם פנוטיפ הקשורים AMD או PD, כמו גם אלה של שגורם לה אינו ידוע המופיעים נורמלי בגלוי. הפשטות של הבדיקות מאפשרת בדיקה ללא השקעה משמעותית אך ניתן להשתמש בה כדי להודיע ים נוסףtudies. על ידי שילוב של בדיקות התנהגותיות עם phenotyping הסלולר, אפשר להגביל את מספר העכברים המשמשים ישירות להשוות את הביצועים חיה עם מצבו הפיזיולוגי. לוח זמני phenotyping זה מספק ניתוח ראשוני שניתן להשתמש בם כדי לכוון את הפוקוס של מחקרים מאוחרים יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מימון למחקר זה בא קרן רפואי Rosebay ואת קרן מחקר של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל דין (JH). אנו מודים לד"ר קלייר קניג לעזרה עם ניסויים התנהגותיים. גנטית קווי עכבר Engineered נוצרו ב Ozgene (פרת ', אוסטרליה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308, 385-389 (2005).
- Zareparsi, S., et al. Strong association of the Y402H variant in complement factor H at 1q32 with susceptibility to age-related macular degeneration. Am J Hum Genet. 77, 149-153 (2005).
- Yang, Z., et al. A variant of the HTRA1 gene increases susceptibility to age-related macular degeneration. Science. 314, 992-993 (2006).
- Dewan, A., et al. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration. Science. 314, 989-992 (2006).
- Francis, P. J., Zhang, H., Dewan, A., Hoh, J., Klein, M. L. Joint effects of polymorphisms in the HTRA1, LOC387715/ARMS2, and CFH genes on AMD in a Caucasian population. Mol Vis. 14, 1395-1400 (2008).
- Cameron, D. J., et al. HTRA1 variant confers similar risks to geographic atrophy and neovascular age-related macular degeneration. Cell Cycle. 6, 1122-1125 (2007).
- Herbert, A. P., et al. Structure shows that a glycosaminoglycan and protein recognition site in factor H is perturbed by age-related macular degeneration-linked single nucleotide polymorphism. J Biol Chem. 282, 18960-18968 (2007).
- Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor h prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged cfh knockout mice. Am J Pathol. 185, 29-42 (2015).
- Nakayama, M., et al. Overexpression of HtrA1 and exposure to mainstream cigarette smoke leads to choroidal neovascularization and subretinal deposits in aged mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 6514-6523 (2014).
- Liu, J., Hoh, J. Postnatal overexpression of the human ARMS2 gene does not induce abnormalities in retina and choroid in transgenic mouse models. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 1387-1388 (2015).
- Kanda, A., et al. A variant of mitochondrial protein LOC387715/ARMS2, not HTRA1, is strongly associated with age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16227-16232 (2007).
- Zumbrunn, J., Trueb, B. Primary structure of a putative serine protease specific for IGF-binding proteins. FEBS Lett. 398, 187-192 (1996).
- Clausen, T., Southan, C., Ehrmann, M. The HtrA family of proteases: implications for protein composition and cell fate. Mol Cell. 10, 443-455 (2002).
- Nie, G. Y., Hampton, A., Li, Y., Findlay, J. K., Salamonsen, L. A. Identification and cloning of two isoforms of human high-temperature requirement factor A3 (HtrA3), characterization of its genomic structure and comparison of its tissue distribution with HtrA1 and HtrA2. Biochem J. 371, 39-48 (2003).
- Runyon, S. T., et al. Structural and functional analysis of the PDZ domains of human HtrA1 and HtrA3. Protein Sci. 16, 2454-2471 (2007).
- Glaza, P., et al. Structural and Functional Analysis of Human HtrA3 Protease and Its Subdomains. PLoS One. 10, e0131142. 10, e0131142 (2015).
- Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3, 380-387 (2003).
- Grau, S., et al. Implications of the serine protease HtrA1 in amyloid precursor protein processing. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6021-6026 (2005).
- Lecha, M., Puy, H., Deybach, J. C. Erythropoietic protoporphyria. Orphanet J Rare Dis. 4, 19 (2009).
- Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy. Chem Soc Rev. 40, 340-362 (2011).
- Li, W., et al. Structural insights into the pro-apoptotic function of mitochondrial serine protease HtrA2/Omi. Nat Struct Biol. 9, 436-441 (2002).
- Jo, H., Patterson, V., Stoessel, S., Kuan, C. Y., Hoh, J. Protoporphyrins enhance oligomerization and enzymatic activity of HtrA1 serine protease. PLoS One. 9, 115362 (2014).
- Bogaerts, V., et al. Genetic variability in the mitochondrial serine protease HTRA2 contributes to risk for Parkinson disease. Hum Mutat. 29, 832-840 (2008).
- Baldi, A., et al. The HtrA1 serine protease is down-regulated during human melanoma progression and represses growth of metastatic melanoma cells. Oncogene. 21, 6684-6688 (2002).
- Oka, C., et al. HtrA1 serine protease inhibits signaling mediated by Tgfbeta family proteins. Development. 131, 1041-1053 (2004).
- Chien, J., et al. A candidate tumor suppressor HtrA1 is downregulated in ovarian cancer. Oncogene. 23, 1636-1644 (2004).
- Grau, S., et al. The role of human HtrA1 in arthritic disease. J Biol Chem. 281, 6124-6129 (2006).
- Chien, J., et al. Serine protease HtrA1 modulates chemotherapy-induced cytotoxicity. J Clin Invest. 116, 1994-2004 (2006).
- Chien, J., Campioni, M., Shridhar, V., Baldi, A. HtrA serine proteases as potential therapeutic targets in cancer. Curr Cancer Drug Targets. 9, 451-468 (2009).
- Hara, K., et al. Association of HTRA1 mutations and familial ischemic cerebral small-vessel disease. N Engl J Med. 360, 1729-1739 (2009).
- Jones, A., et al. Increased expression of multifunctional serine protease, HTRA1, in retinal pigment epithelium induces polypoidal choroidal vasculopathy in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14578-14583 (2011).
- Vierkotten, S., Muether, P. S., Fauser, S. Overexpression of HTRA1 leads to ultrastructural changes in the elastic layer of Bruch's membrane via cleavage of extracellular matrix components. PLoS One. 6, e22959 (2011).
- Strauss, K. M., et al. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 14, 2099-2111 (2005).
- Patterson, V. L., et al. Neural-specific deletion of Htra2 causes cerebellar neurodegeneration and defective processing of mitochondrial OPA1. PLoS One. 9, 115789 (2014).
- Jones, J. M., et al. Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice. Nature. 425, 721-727 (2003).
- Martins, L. M., et al. Neuroprotective role of the Reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by targeted deletion in mice. Mol Cell Biol. 24, 9848-9862 (2004).
- Kang, S., et al. Loss of HtrA2/Omi activity in non-neuronal tissues of adult mice causes premature aging. Cell Death Differ. 20, 259-269 (2013).
- Dynon, K., et al. HtrA3 as an early marker for preeclampsia: specific monoclonal antibodies and sensitive high-throughput assays for serum screening. PLoS One. 7, e45956 (2012).
- Singh, H., et al. HtrA3 Is Downregulated in Cancer Cell Lines and Significantly Reduced in Primary Serous and Granulosa Cell Ovarian Tumors. J Cancer. 4, 152-164 (2013).
- Inagaki, A., et al. Upregulation of HtrA4 in the placentas of patients with severe pre-eclampsia. Placenta. 33, 919-926 (2012).
- Liu, J., Li, Y., Hoh, J. Generation and characterization of mice with a conditional null allele of the HtrA4 gene. Mol Med Rep. , (2015).
- Bowden, M. A., Di Nezza-Cossens, L. A., Jobling, T., Salamonsen, L. A., Nie, G. Serine proteases HTRA1 and HTRA3 are down-regulated with increasing grades of human endometrial cancer. Gynecol Oncol. 103, 253-260 (2006).
- Chen, Y. Y., et al. Functional antagonism between high temperature requirement protein A (HtrA) family members regulates trophoblast invasion. J Biol Chem. 289, 22958-22968 (2014).
- Fritsche, L. G., et al. Age-related macular degeneration is associated with an unstable ARMS2 (LOC387715) mRNA. Nat Genet. 40, 892-896 (2008).
- Beleford, D., Rattan, R., Chien, J., Shridhar, V. High temperature requirement A3 (HtrA3) promotes etoposide- and cisplatin-induced cytotoxicity in lung cancer cell lines. J Biol Chem. 285, 12011-12027 (2010).
- Hegde, R., et al. Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J Biol Chem. 277, 432-438 (2002).
- Martins, L. M., et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J Biol Chem. 277, 439-444 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008. 2008, pdb prot4986 (2008).
- Wahlsten, D. A developmental time scale for postnatal changes in brain and behavior of B6D2F2 mice. Brain Res. 72, 251-264 (1974).
- El-Khodor, B. F., et al. Identification of a battery of tests for drug candidate evaluation in the SMNDelta7 neonate model of spinal muscular atrophy. Exp Neurol. 212, 29-43 (2008).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435, 297-312 (2011).
- Chance, B., Williams, G. R., Holmes, W. F., Higgins, J. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. V. A mechanism for oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 217, 439-451 (1955).
- Kamo, N., Muratsugu, M., Hongoh, R., Kobatake, Y. Membrane potential of mitochondria measured with an electrode sensitive to tetraphenyl phosphonium and relationship between proton electrochemical potential and phosphorylation potential in steady state. J Membr Biol. 49, 105-121 (1979).
- Brown, G. C., Brand, M. D. Proton/electron stoichiometry of mitochondrial complex I estimated from the equilibrium thermodynamic force ratio. Biochem J. 252, 473-479 (1988).
