Introduction
Altersassoziierten Erkrankungen werden immer häufiger in der modernen Gesellschaft. Da die medizinische Wissenschaft und die Lebenserwartung steigt verbessert, wächst die Bevölkerung nach Alter und die Last dieser Krankheiten wächst. Effektive Behandlungen sind notwendig, um die Auswirkungen der lähmenden Bedingungen zu verringern, bleiben aber schwer in vielen Fällen. Nur wenn wir die Ursachen zu verstehen und Pathologie der Zusammenhang mit der Alterung Krankheiten können die Wissenschaftler beginnen potentielle therapeutische Targets zu identifizieren und zu entwickeln Strategien für die Intervention. Gemeinsame altersbedingten Bedingungen umfassen neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit (PD) und altersbedingte Makuladegeneration (AMD). PD ist die häufigste durch Neurodegeneration verursacht Bewegungsstörung beim Menschen. Die meisten Parkinson-Patienten zeigen Symptome wie Ruhetremor, Bradykinesie und Steifigkeit nach 50 Jahren. Frühem Beginn wurde auch in etwa 10% der Fälle beobachtet.
AMD ist die häufigste Ursache für Erblindung beiältere Menschen, progressiv und Photorezeptoren der retinalen Pigmentepithel (RPE) im Auge zu beschädigen. Zentrale Vision beeinträchtigt aber die periphere Sicht ist in der Regel nicht betroffen. Es gibt zwei Formen von AMD. In der "trockenen" Form, extrazelluläre Proteinablagerungen als Drusen Form zwischen dem RPE und Bruch-Membran (BM) bekannt, was zu einer geographischen Atrophie und Unschärfe des zentralen Sehens. Die schwereren "nasse" Form ergibt sich aus Neovaskularisation aus der Chorioidea über BM in die RPE und Photorezeptorschichten und kann unter der Netzhaut führen zu hamorrhaging, die zu dauerhaften Schäden an Netzhautgewebe verursacht. Genomweite Assoziationsstudien haben zuvor identifizierten Loci, die mit einer erhöhten Anfälligkeit für diese Krankheit und identifiziert zwei Bereiche von Interesse verbunden sind: Komplement-Faktor H (CFH) auf dem Chromosom 1 und dem 10q26-Locus, wo die altersbedingte Makulopathie Anfälligkeit 2 (ARMS2) und Hochtemperatur - Anforderung Faktor A1 (HtrA1) Gene befinden sich 1-5 3-6 verbunden sein.
CFH wirkt als negativer Regulator des alternativen Wegs (AP) des Komplementsystems durch die Aktivierung von C3 zu hemmen. A single nucleotide polymorphism (SNP) wurde zu einem erhöhten Risiko von AMD verbunden, was den Austausch von Tyrosin 402 in Exon 9 mit Histidin durch eine T nach C Substitution 1. In AMD wird angenommen, dass der AP wegen einer Funktionsverlust von CFH falsch reguliert ist aber, ob das SNP spielt eine kausale Rolle ist unklar. Eine Hypothese ist , dass die positiv geladene Histidin gedacht , ist die Fähigkeit von CFH zu negieren , um interagierende Proteine C-reaktives Protein und Heparinsulfat 1,7 zu binden. In - vitro - Studien von CFH Y402H liefern widersprüchliche Ergebnisse über funktionelle Unterschiede zwischen den Varianten und in vivo Arbeit in <em> Cfh - / - Mäusen, die humanisierte CFH 8 ist noch nicht abgeschlossen. ARMS2 stromauf HtrA1 im Primatengenom befindet, wobei das Gen in Mäusen fehlt. HtrA1 ist eine Serinprotease, aber ARMS2 ist schlecht charakterisiert. Das Kopplungsungleichgewicht zwischen SNPs in der AMD-assoziierten Locus hat es schwierig gemacht, die Beiträge zu Risiko einzelner Mutationen der Gene in dieser Region zu bestimmen, aber die jüngsten Arbeiten haben vorgeschlagen, dass es eine Überexpression von HtrA1 anstatt ARMS2, die Neovaskularisation führt und subretinalen Proteinablagerungen 9-11. Allerdings kann die große Nähe der Gene in diesem Locus für Interaktionen ermöglichen, der nicht zufällig eingefügt Transgene unter Verwendung untersucht werden können.
Neben AMD hat die HtrA- Familie von Serin-Proteasen wurden mit vielen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Alle HtrA-Proteine enthalten eine Serin-Protease-Domäne durch mindestens einen C-terminalen PDZ-Domäne folgt. HtrA1, HtrA3 und HtrA4 teilen sich die grissest Homologie, bestehend aus einem Signalpeptid, insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Bindungsdomäne, einer Kazal-Protease-Inhibitor-Domäne der Serinprotease-Domäne und eine PDZ-Domäne. HtrA2 hat eine andere N-Terminus, der aus einem Mitochondrienlokalisierungssequenz, Transmembrandomäne und Inhibitor der Apoptose - Bindungsdomäne durch die Protease und PDZ - Domänen 12-16 folgte. Mammalian HtrA1 wird durch substratinduzierte Remodeling in der aktiven Stelle der Protease - Domäne 17-20 reguliert und HtrA2 kann auch durch Wechselwirkung zwischen der Serin - Protease und PDZ - Domänen moduliert werden , die Proteaseaktivität 21 unterdrückt. Interessanterweise scheint die PDZ - Domäne nicht ähnliche Regelung zu HtrA3 16 verleihen scheinen. Die HtrA Proteasen können auch durch extrinsische Faktoren reguliert werden: Es wurde vor kurzem gezeigt , dass es eine regulatorische Interaktion zwischen HtrA1 existiert und Protoporphyrine 22 und HtrA2 können durch Phosphorylierung bei Aktivierung der p38 - MAP - Kinase reguliert werdenWeg in einem PINK1 abhängig 23. Die Löschung der einzelnen Mitglieder der Familie HtrA in Mäusen wurde dokumentiert, aber mechanistisch Effekte sind meist unklar, teilweise aufgrund des Fehlens von sichtbaren Phänotypen.
HtrA1 spielt eine wichtige Funktion bei der Proteinqualitätskontrolle und deren Fehlregulation oder Mutation hat mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Arthritis, Krebs und ein erhöhtes Risiko für AMD 3,4,24-32 in Verbindung gebracht worden. Der Verlust der HtrA2 Funktion in Nervengewebe wurde mit PD - Phänotypen in Menschen und Mäusen, während der Verlust aus nicht-neuronalen Gewebe führt zu einer beschleunigten Alterung 33-37 in Verbindung gebracht worden. HtrA3 Dysregulation hat mit Krankheiten wie Präeklampsie und bestimmte Arten von Krebs 38,39 in Verbindung gebracht worden. Hochregulierung von HtrA4 hat in den Plazenten von Präeklampsie - Patienten aber knockout Mäuse zeigen keine offensichtlichen Phänotyp 40,41 beobachtet. Der Mangel an Phänotypen in einigen knockout-Mäusen beobachtet wurde,postulierten ein Ergebnis der Kompensation zwischen dem HtrA Familienmitglied zu sein: es wird angenommen , dass sowohl HtrA4 und HtrA1 mit der TGF-B - Familie von Proteinen in Wechselwirkung treten, was eine Kompensation durch HtrA1 beim Löschen von HtrA4 41. In ähnlicher Weise wird angenommen , dass seit HtrA1 und HtrA3 ein hohes Maß an Domäne Homologien aufweisen könnten sie 42 ergänzende Funktionen haben. Aber es wurde vorgeschlagen , dass HtrA- Proteine teilweise antagonistische Rollen haben können, gemeinsame Ziele 43 zu regulieren , zu konkurrieren.
Um diese Gefahr zu untersuchen Faktoren drei humanisierten Knock-in-Mauslinien generiert wurden. In Cfh tm1 (CFH * 9) jhoh und Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh, Exon 9 des Cfh Gens mit Exon 9 des menschlichen Homolog ersetzt wird. Cfh tm1 (CFH * 9) jhoh codiert die nicht Krankheit assoziiert Tyrosin Rest an Position 402, während Cfh tm2 (CFH * 9) jhoh die Y402H, Risiko-assoziierten SNP trägt. ImARMS2 tm1jhoh menschlichen ARMS2 Sequenz wurde an eine Region stromaufwärts von HtrA1 abgezielt. Eine loxP-flankierte STOP - Sequenz der Gensequenz , aber stromabwärts von dem Promotor enthalten UBIC wurde OzCre Mäusen durch Kreuzung exzidiert angeordnet stromaufwärts , die Cre - Rekombinase unter der Kontrolle des Promotors exprimieren Rosa26, wie zuvor beschrieben 34. Zusätzlich zu diesen Knock-in - Linien, Knockout - Allele für Cfh und HtrA1 (CFH tm1jhoh und HtrA1 tm1jhoh) sowie die anderen Mitglieder HtrA- Familie bekannt wurden erzeugt: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) und HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). Die Keimbahn Vorprägungen wurden konstruiert durch Kreuzung OzCre Mäuse Tiere erstellt spezifische Exons mit loxP - Stellen zu flankieren, so dass das Löschen bewirkt eine Rahmenverschiebung und / oder Löschung der aktiven Domäne (CFH; Exon 3, HtrA1; Exons 2-3, HtrA2: Exons 2-4, HtrA3; Exon 3, HtrA4; Exons 4-6) 34,41. Ein neuronales Deletion HtrA2, deletiert unter Verwendung von Cre - Rekombinase unter der Kontrolle des Nestin - Promotor (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), wurde ebenfalls 34 beschrieben. Nur Mäuse HtrA2, entweder systemisch oder in Nervengewebe, zeigte klare Phänotypen fehlt, mit Parkinson- Phänotypen zu präsentieren.
Da einige dieser Gene von Interesse gesetzt zu Mitochondrien 11,44-47 lokalisiert werden, und Löschen von HtrA2 erzeugt Parkinsonian Phänotypen, eine Phänotypisierung Regime mit einer mitochondrialen und neurologischen Fokus wird hier beschrieben und repräsentative Ergebnisse aus den Tests von Interesse zur Verfügung gestellt werden . Um gentechnisch veränderten Mäusen zu untersuchen, erzeugt ein Mensch zu untersuchen, gründlich altersbedingte Krankheiten und systematisch eine anfängliche Phänotypisierung Zeitplan festgelegt wurde, die aus einer Reihe von Tests an den beiden HauptbezogenenKrankheiten von Interesse: AMD und Parkinson.
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Protocol
Ethik Aussage: Studien Tiere wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Yale University durchgeführt.
1. Verhaltenstest von genetisch veränderten Mäuse
Hinweis: Alle Mäuse sollten auf den gleichen Testprozeduren unterzogen werden, um Unterschiede in Gewöhnung zu begrenzen Handhabung. Tests sollte jedes Mal an der gleichen Tageszeit durchgeführt werden.
- Neonatal Hind Gliedmaßen-Test
Hinweis: Die hinteren Gliedmaßen Test durchgeführt täglich von postnatalen Tag (P) 4 bis P10 proximalen hinteren Gliedmaßen Muskelkraft, Schwäche und Müdigkeit zu bewerten.- Transport Mäuse Testbereich und lassen Sie es 30 Minuten vor dem Test zur Ruhe.
- Bereiten Sie Testgerät durch eine 50 ml konischen Röhrchen mit 70% Ethanol Reinigung, Drücken von zwei (P4-P8) oder ein (P9-P10) Wattebällchen auf dem Boden des tube und in einer vertikalen Position zu sichern.
- Entfernen Sie einen Welpen aus dem Käfig und Rekordgewicht. Halten Sie pup Tablett auf Heizkissen in halten, wenn nicht zu testen.
- Sanft suspendieren die Hinterbeine des Neugeborenen über den Rand des konischen Rohrs, so dass es in Richtung der Wattebäusche nach unten zeigt. Zählen Sie die Anzahl der Ziehversuche gemacht und messen die Latenz zu fallen, um eine Stoppuhr.
- Wiederholen Sie einmal dann mit der Markierung den Welpen beschriften. Danach P6 Welpen durch Zehen Clipping identifizieren. Reiben Sie Welpen sanft mit Bettwäsche von zu Hause Käfig vor dem Austausch.
- Wisch konisches Rohr mit 70% Ethanol.
- Wiederholen Sie Prüfung auf der nächsten Welpen, bis die ganze Wurf wurde getestet.
- Entsorgen Wattebausch und konischen Röhrchen. Reinigen Sie alle Geräte mit 70% Ethanol.
- Weanling Observation-Test
Hinweis: Der Absetzer Beobachtungstest verabreicht wird täglich von P19 bis P21 Bewegung und allgemeine Aktivitätsniveau zu erzielen.- Transport Mäuse Testbereich einnd lassen Sie es 30 Minuten vor dem Test zur Ruhe.
- Vorbereitung Testfeld Plexiglas markiert mit einem 6x6-Raster von 2 inch Quadrate auf der Basis von mit 70% Ethanol gereinigt wird. Richten Sie Videogerät an der Seite, so dass das ganze Feld im Blickfeld ist. Halten Sie die Einrichtung und Umgebung jeden Tag das gleiche zu vermeiden Neuheit einzuführen.
- Entfernen Sie einen Absetzer aus dem Käfig und in einem sauberen Betrieb Tasse. Nehmen Sie Gewicht.
- Beginnen Videoaufzeichnung durch die Testidentifikationskarte filmt, mit Maus-Identifikationsnummer, Alter und Datum der Prüfung. Übertragen Sie die Maus aus dem Becher zu der Mitte Platz zu halten. Zeit für drei Minuten die Anzahl der Zeilen von beiden Vorderpfoten der Maus während des Tests durchlaufen zu zählen.
- Rück Maus in einen sauberen Käfig und End-Videoaufzeichnung.
- Reinigen der Testvorrichtung mit 70% Ethanol.
- Wiederholen, bis alle Wurf getestet wird, dann wieder alle Welpen an den Käfig.
- Reinigen Sie alle Prüfgeräte mit 70% Ethanol.
- Wire Mesh Grip Festigkeitstest
Hinweis: Die Grifffestigkeit Test an abwechselnden Tagen zwischen P22 und P26 durchgeführt wird, um die neuromuskuläre Stärke beurteilen.- Transport Mäuse Testbereich und lassen Sie es 30 Minuten vor dem Test in Heimkäfig zur Ruhe.
- Bereiten Sie Gerät durch ein Plexiglas-Box und Maschengitter mit 70% Ethanol reinigen. Setzen Sie Luftpolsterfolie im Boden der Schachtel und Deckel mit Papier.
- Getrennte Mäuse in Gruppen von drei, in einzelnen Haltebecher platzieren.
- Platzieren erste Maus auf die Mitte des Drahtgeflecht und invertieren langsam 10-20 cm über die weiche Oberfläche in den Boden des Plexiglas-Box. Messen Sie die Latenzzeit zu fallen, um eine Stoppuhr. Beenden Tests nach 60 sec verstrichen sind, wenn die Maus nicht tutFall.
- Rück Maus zu halten Tasse, Abwischen mit 70% Ethanol Netz und ersetzen Papier über die Luftpolsterfolie. Führen Sie den Test auf den verbleibenden zwei Mäuse in der Gruppe, bevor mit dem ersten zurückkehrt. Wiederholen, bis jede Maus insgesamt dreimal getestet wurde.
- Bringen Sie die Gruppe in einen sauberen Käfig und weiter mit anderen Gruppen. Bei weniger als drei Mäuse in jeder Gruppe sind, stellen Sie sicher, dass ein 5 min zu interProbeErholungsIntervall erlaubt ist.
- Gibt alle Mäuse an den Käfig, entsorgen Papier und saubere Prüfgeräte mit 70% Ethanol.
2. Die Prüfung der Retinal Struktur
- Anästhesieren Tiere an P30-35 durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Beurteilen Tiefe der Anästhesie durch den Fußballen Quetschung und nur in Abwesenheit einer Antwort, in Übereinstimmung mit IACUC Richtlinien erfolgen. Perfuse mit 4% PFA / PBS 48.
- Um die Augen zu entfernen, reinigen Sie die Haut an der Einschnitt site mit 70% Ethanol, bevor an der Basis des Schädels durch die Haut zu schneiden. Ziehen Sie die Haut wieder auf den Schädel und sauber mit 70% Ethanol aus. Mit sauberen Instrumente, schneiden Sie vorsichtig durch den Schädel, die Augenhöhlen zu erreichen und die Augen aus. Sever den Sehnerv, sanft entfernen Sie das Auge aus der Steckdose und spülen in PBS.
- Fix Augen in 4% PFA / PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
- Zeigen die Augen in eine kleine Petrischale mit PBS. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Mitte der Hornhaut unter Verwendung von Stichentfernung Schere. Entfernen Sie die Hornhaut durch die Kante zwischen der Hornhaut und Lederhaut zu schneiden. Verwenden einer Pinzette, die Iris zu entfernen. Schließlich schälen die RPE Schichten, so dass die Netzhaut intakt und die Linse an Ort und Stelle aus.
Hinweis: Die 4% PFA / PBS Fixierung bewirkt RPE Ablösung so dass für die RPE leicht von der Außenseite der Netzhaut abgeschält werden. - Re-fix in 4% PFA / 30% Saccharose / PBS für 15 min bei Raumtemperatur vor dem Auge auf eine Petrischale mit PBS zurückkehrt. Ziehen Sie die lens Zange, womit sich die Glaskörper zusammen mit ihm mit.
- Cryoprotect in 30% Saccharose über Nacht bei 4 ° C.
- Mantel Augen in eine optimale Schnitt Temperatur Verbindung (OCT) und Übertragung auf eine Einbettform mit frischem Oktober Orientieren des Auges, so dass der Sagittalebene ist parallel mit der Schneidfläche, indem so wenig wie möglich Bewegungen und die Vermeidung der Einführung von Luftblasen. Blitzeis, indem die Form in einem Trockeneis / Ethanol-Bad eingetaucht wird. Store Blöcke bei -80 ° C.
- Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten 20 um Sagittalschnitte und sammeln sich auf vorgereinigte Dias.
- Stain Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardprotokollen 49. Bild mit einem Lichtmikroskop für Hellfeldmikroskopie ausgestattet.
3. histochemische Färbung
- Probenvorbereitung
- Euthanize Tiere bei P30-35 mit Isofluran Überdosierung (30% in Propylenglykol) über offene Tropfen Einatmen. Beurteilen Sie die Euthanasie durch das Aufhörender Atmung, Herzschlag und der Mangel an Reaktion auf die Fußballen Kneifen. Bestätigen Tod durch Genickbruch und Organentnahme mit IACUC Richtlinien im Einklang.
- Um das Gehirn zu entfernen, reinigen Sie die Haut an der Einschnittstelle mit 70% Ethanol, bevor an der Basis des Schädels durch die Haut zu schneiden. Ziehen Sie die Haut wieder auf den Schädel und sauber mit 70% Ethanol aus. Mit sauberen Instrumente, sorgfältig durch den Schädel schneiden und entfernen Sie das Gehirn zu belichten. Entfernen Sie die Membranen und sanft das Gehirn aus dem Schädelhöhle zu entfernen. Spülen in PBS.
- Coat das Gehirn in OCT und Übertragung auf eine Einbettform mit frischem Oktober Orientieren das Gehirn, so dass der sagittalen Ebene ist parallel zu der Schnittfläche unter Verwendung von möglichst wenigen Bewegungen wie möglich und der Vermeidung der Einführung von Luftblasen. Blitzeis, indem die Form in einem Trockeneis / Ethanol-Bad und bei -80 ° C eingetaucht wird.
- Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten 10 um Sagittalschnitte und sammeln sich auf vorgereinigte Dias.
<li> NADH Diaphorase-Färbung - Bereiten 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6 durch Auflösen von 5,72 g Tris-HCl und 1,66 g Tris-Base in 1L-VE-Wasser. Lagerung bei 4 ° C für bis zu sechs Wochen.
- Bereiten NADH-Lösung (2,25 mM NADH in 0,05 M Tris-Puffer). Aliquotieren und bei -20 ° C.
- Bereiten NBT-Lösung (2,5 mM Nitro-Blue-Tetrazolium in 0,05 M Tris-Puffer). Lagerung bei 4 ° C für bis zu sechs Wochen in einer Glasflasche.
- Kombinieren Sie gleiche Volumina von NADH-Lösung und NBT-Lösung Färbelösung machen und 1 ml zu jeder Folie. in einer befeuchteten Kammer für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
- Absaugen Färbelösung und waschen dreimal mit dH 2 O.
- Waschen dreimal jeweils in aufsteigender und absteigenden Konzentrationen von Aceton / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) für 2 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie dreimal in dH 2 O und montieren Abschnitte mit wässrigem Medium. Bild mit einem Lichtmikroskop ausgestattet für helle field Mikroskopie. Blau-Färbung entspricht der enzymatischen Aktivität.
- Succinatdehydrogenase histochemische Färbung
- Bereiten 0,2 M Natrium monobasischen Phosphat / dH 2 O und 0,2 M Natriumhydrogenphosphat / dH 2 O.
- Machen 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,6 durch die Kombination von 3 Teilen einbasischen Phosphat mit 20 Teilen Natriumhydrogenphosphat.
- Bereiten Sie Färbungslösung (0,1 M Natriumsuccinat, 1,25 M NBT in 0,2 M Phosphatpuffer) und 1 ml zu jeder Folie. in einer befeuchteten Kammer für 60 min bei 37 ° C inkubieren.
- Absaugen Färbelösung und waschen dreimal in dH 2 O.
- Waschen dreimal jeweils in aufsteigender und Konzentrationen von Aceton / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) für 2 min bei Raumtemperatur absteigend.
- Spülen Sie dreimal in dH 2 O und montieren Abschnitte mit wässrigem Medium. Bild mit einem Lichtmikroskop für Hellfeldmikroskopie ausgestattet. Blau-Färbung entspricht enzymatic Aktivität.
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Representative Results
In diesem Abschnitt werden Beispiele für die Ergebnisse, erhältlich unter Verwendung dieser Verfahren. Im Hinterschenkel-Test hat die Anzahl der Ziehversuche und die Latenzzeit für jeden Tag summiert werden in zwei aufeinander folgenden Tests zu fallen. Dieser Test kann verwendet werden , genetisch verschiedenen Gruppen zu vergleichen Mäuse mit reduzierter Stärke neuromuskulären HtrA2 tm1jhoh (HtrA2 KO) -Mäusen in 1A zu unterscheiden -. B zeigen keine Veränderung in der Anzahl von Zügen und Latenz von P4-6 gefolgt von einer Reduktion zu fallen in neuromuskuläre Stärke bei P7-10, im Vergleich zu littermates (HtrA2 WT). Der erwartete Anstieg der Festigkeit mit dem Alter ist auch zu beobachten in den Wildtyp-Tiere. Für die Absetzer Beobachtungstest kann die Gesamtaktivität durch alle Ereignisse Summieren ausgewertet werden (Linien durchzogen, die Aufzucht und Pflege Veranstaltungen), in den drei aufeinanderfolgenden Testtagen gemittelt. Alternativ kann jeder bestimmte Art von Ereignis sein individually analysiert. Hier repräsentative Ergebnisse präsentiert werden, reduzierte Aktivität von HtrA2 KO-Mäuse im Vergleich zu WT littermates demonstriert. Diese Daten zeigen , dass die Gesamtaktivität quantitativ gemessen werden und im Vergleich zwischen den Gruppen (Abbildung 1C). Es ist auch möglich, Unterschiede in der Griffstärke zu quantifizieren durch einen täglichen Durchschnitt aus den drei Wiederholungen an jedem Testtag durchgeführt zu berechnen. Wenn HtrA2 KO - Mäuse zu littermate Kontrollen verglichen werden, Kürzungen in Kraft manifestiert sich in einer kürzeren Latenzzeit zu fallen (Abbildung 1D).
H & E - Färbung der Netzhaut erzeugt Bilder in dem Netzhautstruktur untersucht und im Vergleich (Bild 2). Die Schichten von Zelltypen, die die Netzhaut zusammensetzen werden abgegrenzt klar wodurch ein Vergleich zwischen genetischen Gruppen. Hier HtrA2 tm1jhoh '; HtrA3 tm1jhoh Mäuse zeigen keine Veränderungen in der Netzhautstruktur, im Vergleich zu HtrA2
Abb . 1: Behavioral Phänotypisierung von gentechnisch veränderten Mäusen HtrA2 tm1jhoh (HtrA2 KO) Mäuse wurden dem beschriebenen Verhaltenstests unterzogen und im Vergleich zu Wildtyp (HtrA2 WT) littermate Kontrollen. (A - B) Die hinteren Gliedmaßen Suspensionstest auf WT und KO Neugeborenen von P4-P10 und zeigt eine Reduktion der neuromuskulären durchgeführt wurde ,Stärke in KO Tiere (WT: n = 28, KO: n = 19). (A) KO Welpen zunächst eine ähnliche Anzahl von Pull - Versuche als WT Geschwistern, aber zeigen eine Abnahme der Versuche zu späteren Zeitpunkten gemacht. (B) KO Neugeborenen 'Latenz ist auch aber nimmt von P7 ab anfangs normal zu fallen. (C) Die weanling Beobachtung Gesamtaktivität Score wurde in KO Tieren im Vergleich zu WT littermates, im Einklang mit reduzierter Aktivität dieser Mäuse reduziert (WT: n = 19, KO: n = 12). (D) KO Tiere hatten auch eine reduzierte Latenz während der Mascheninversionstest zu fallen, was zeigt , reduziert Griffstärke von HtrA2 KO - Mäusen (WT: n = 17, KO: n = 9). Die Daten stellen Mittelwert ± SEM (# 0,1 <p <0,05, * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,001 durch unabhängige t-Tests). Diese Zahl wurde von Patterson et al modifiziert. 34 Klicken Sie hier um zu seheneine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2:. H & E - Färbung der Retina Färbung retinalen Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin ermöglicht die Untersuchung der Struktur, die Netzhautschichten abgrenzen. Hier Abschnitte von P35 HtrA2 WT; HtrA3 tm1jhoh (A) und HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (B) Anzeige normalen Netzhautstruktur. RPE: retinalen Pigmentepithel, OS: Außensegmente, IS: Innensegmente, ONL: äußere Kernschicht, OPL: äußere Plexiformschicht, INL: innere Kernschicht, IPL: innere Plexiformschicht, GCL; Ganglion Zellschicht. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 3: Respiratory komplexe Aktivität histochemische Färbung für NADH Diaphorase (Komplex I) und Succinat - Dehydrogenase (Komplex II) Aktivität wurde an Querhirnschnitten von P25 HtrA2 ausgeführt flox / flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (Nesko) und HtrA2 + / flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (NesWT) littermates. NADH Diaphorase Enzymaktivität wird in Cerebellum (Crbl, B) und Striatum (D) von Nesko Gehirn verringert im Vergleich zu Kontrollen NesWT (A, C), aber nicht in cerebral cortex (E - F). (- L K) SDH - Aktivität wird in Cerebellum und Striatum von Nesko Mäuse (H, J) im Vergleich zu Kontrollen NesWT (G, I) , aber es gibt keine Veränderung in cerebral cortex ähnlich reduziert. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. DiesFigur wurde von Patterson modifiziert et al. 34 Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Robust Behandlungen notwendig, um die Auswirkungen der lähmenden Bedingungen menschlichen Alterungs Bezug zu begrenzen, aber sie bleiben schwer für viele Bedingungen. Um potentielle therapeutische Targets zu identifizieren und zu entwickeln Strategien für die Intervention, die Ursachen und die Pathologie der Zusammenhang mit der Alterung Krankheiten müssen zuerst verstanden werden. Nicht alle genetisch veränderten Mäusen unmittelbar gegenwärtig mit klaren Phänotypen, die für die Krankheit von Interesse verbunden sind, auch wenn diese Gene zuvor auf den Zustand in Studien am Menschen in Verbindung gebracht worden. Daher systematischer Untersuchungen sind erforderlich, und genetisch veränderte Mäuse sollten angemessen Experimenten unterworfen werden Phänotypen zu identifizieren, die zu den damit verbundenen Krankheiten bei Menschen in Zusammenhang stehen können.
Myriad Verhaltenstests existieren neurologische Funktion bei Mäusen 50,51 zu untersuchen. Die Verhaltenstests hierin beschrieben werden, um die Hypothese aufgestellt, Phänotypen geeignet auf Basis menschlichen Erkenntnisse und den tatsächlichen Phänotypen Observed in Mäusen. Darüber hinaus sind diese Tests einfach in Laboratorien mit wenig oder gar keine Erfahrung in der Durchführung von Verhaltensexperimenten durchzuführen. Es besteht keine Notwendigkeit für anspruchsvolle Ausstattung, aber die Ergebnisse sind aussagekräftig und informativ, wenn sie richtig gesammelt, so dass sie nützlich als einen ersten Schritt zu machen in den Phänotyp genetisch veränderten Mäusen untersuchen, die neuromuskuläre Defekte zu erwarten ist. Die erhaltenen Daten können dann den Fokus der weiteren Prüfung zu lenken verwendet werden, möglicherweise mit anspruchsvolleren Testgerät.
In ähnlicher Weise gibt es viele Techniken für die 52 in Geweben Atmungsfunktion zu beurteilen. Die Messung der Geschwindigkeit der ATP - Synthese, Sauerstoffverbrauch oder Veränderungen in der mitochondrialen Membranpotentials sind wichtige Ablesungen der mitochondrialen Funktion , sondern sie kann kompliziert sein und Zeit auszuführen aufwendig und erfordern spezifische Reagenzien und Geräte 52-55. Darüber hinaus sind sie auf der Ebene des mitochond oft begrenztRion oder Zelle, an kultivierten Zellen zu verlassen, Lysate oder isolierten Mitochondrien. Die histochemische Färbung ist ein nützlicher erster Schritt in mitochondriale Dysfunktion ohne großen Aufwand an Zeit und Ressourcen zu identifizieren. Darüber hinaus verleiht die Fähigkeit, Gewebeschnitte zu färben sich schnell regionale Unterschiede zu identifizieren, die nicht so offensichtlich mit anderen Techniken sein könnte, beispielsweise die flächenspezifische Verlust der enzymatischen Färbung in HtrA2-defizienten Gehirn beobachtet. Während die Technik in seiner Fähigkeit begrenzt ist Falte Veränderungen der Atemkapazität zu messen, ordnet es definiert Hirnregionen aus, die dann mit komplexeren Methoden verfolgt werden können.
Während die Techniken in diesem Phänotypisierung Zeitplan vorgestellt werden sind einfach durchzuführen, ist von entscheidender Bedeutung, bestimmte Schritte richtig funktioniert für den Erfolg der Experimente. Für die Verhaltens Phänotypisierung muss große Sorgfalt Tests zu achten, werden zur gleichen Zeit und am gleichen Ort jeden Tag durchgeführt Variation Intro zu begrenzenvon der Neuartigkeit der Lage duced oder durch den Unterschied in den zirkadianen Rhythmus. Die Ausrüstung sollte jeden Tag aus ähnlichen Gründen in gleicher Weise organisiert werden. Der Raum Organisation ist besonders kritisch für den Aktivitätstest, wo kleine Änderungen in Neuheit stark die Aktivität der Maus beeinflussen können. Bei der Messung der Griffstärke, sollten die Ermittler fest, dass Mäuse, die eine richtige halten, das Gitter vor dem Umdrehen haben. Außerdem muss auf richtig getroffen werden, um den Welpen unterbrechen, bevor wird verzerrt werden in den hinteren Gliedmaßen Test oder die Testergebnisse die Freigabe auf eine kürzere Latenzzeit zu fallen.
Für Gewebe Phänotypisierung, ist eine gute Abschnitte zu erhalten lebenswichtig. Informative Färbung der Retina hängt von wirksamen Fixierung vor Dissektion oder Artefakte während des Schneidens und Dissektion und verzerren die Morphologie entstehen. Histochemische Färbung erfordert Gehirne schnell nach der Sektion eingefroren werden Enzymfunktion zu erhalten, aber die Inkubationszeit ist ähnlich critical; kleine Schwankungen in der Temperatur oder in der Länge der Zeit, können Unterschiede in der Färbungsintensität führen. Wenn möglich, sollten die Proben gleichzeitig verarbeitet werden, Vergleich zwischen den Gruppen zu ermöglichen.
Hier ein Testschema verwendet, um genetisch veränderten Mäusen untersucht werden erwartet subtile Phänotypen mit altersbedingten Krankheiten, nämlich AMD und PD assoziiert anzuzeigen, wird beschrieben. Dieser Phänotypisierung Zeitplan kann verwendet werden, um Defizite in neuromuskuläre Stärke und Aktivität zu identifizieren, identifizieren sowie strukturelle und funktionelle Defekte im Gewebe von Interesse. Dieser Zeitplan sieht eine systematische Analyse der frühen Phänotypen bei jungen, genetisch veränderten Mäusen. In Zukunft kann diese Methode auf alle genetisch veränderten Mäuse aufgetragen werden voraussichtlich mit einem AMD oder PD im Zusammenhang mit Phänotyp zu präsentieren, als auch solche unbekannter Ätiologie, die offenkundig normal erscheinen. Die Einfachheit der Tests ermöglicht das Testen ohne erhebliche Investitionen, sondern kann dazu verwendet werden, um weitere s zu informierenTUDIEN. Verhaltenstests mit zellulären Phänotypisierung durch Kombination ist es möglich, die Anzahl der verwendeten Mäuse zu begrenzen und direkt Tierleistung mit dem physiologischen Zustand vergleichen. Dieser Phänotypisierung Zeitplan sieht eine erste Analyse, die verwendet werden können, um den Fokus von nachfolgenden Studien zu lenken.
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Acknowledgments
Die Finanzierung für diese Forschung kam von Rosebay Medical Foundation und Yale Medical School Deans Research Fund (JH). Wir danken Dr. Claire Koenig für die Hilfe bei Verhaltensexperimenten. Gentechnisch veränderte Mauslinien wurden bei Ozgene (Perth, Australien) erzeugt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
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