Introduction
enfermedades asociados con la edad son cada vez más frecuentes en la sociedad moderna. A medida que la ciencia médica mejora y aumenta la esperanza de vida, la población continúa envejeciendo y la carga de estas enfermedades crece. Los tratamientos eficaces son necesarias para disminuir el impacto de enfermedades debilitantes, pero sigue siendo difícil en muchos casos. Sólo mediante la comprensión de las causas y la patología de las enfermedades asociadas con el envejecimiento pueden los científicos comenzar a identificar posibles dianas terapéuticas y desarrollar estrategias de intervención. Las condiciones comunes relacionadas con la edad incluyen trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson (EP) y la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). PD es el trastorno del movimiento más común causada por neurodegeneración en los seres humanos. La mayoría de los pacientes con EP muestran síntomas como temblor en reposo, bradicinesia y rigidez después de 50 años de edad. El inicio temprano también se ha observado en aproximadamente el 10% de los casos.
La DMAE es la principal causa de ceguera enlos ancianos, dañando progresivamente fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina (EPR) en el ojo. La visión central se ve afectada pero la visión periférica es generalmente no afectado. Hay dos formas de DMAE. En la forma "seca", los depósitos de proteínas extracelulares conocidas como forma de drusas entre el EPR y la membrana de Bruch (BM), que conduce a la atrofia geográfica y la difuminación de la visión central. Los resultados más graves forma "húmeda" de la neovascularización de la coroides a través de BM en las capas del EPR y fotorreceptoras y pueden conducir a hamorrhaging debajo de la retina que causa daño permanente al tejido de la retina. Genoma estudios de asociación de ancho han identificado previamente loci que están asociadas con una mayor susceptibilidad a esta enfermedad y identificó dos regiones de interés: el factor H del complemento (CFH) en el cromosoma 1 y la 10q26 locus, donde la maculopatía susceptibilidad relacionada con la edad 2 (ARMS2) y alta temperatura factor de requerimiento A1 (HTRA1) los genes se encuentran 1-5 3-6.
CFH actúa como un regulador negativo de la vía alternativa (AP) del sistema del complemento mediante la inhibición de la activación de C3. Un polimorfismo de nucleótido único (SNP) se ha relacionado con un mayor riesgo de AMD, causando intercambio de tirosina 402 en el exón 9 con histidina debido a una T a C sustitución 1. En AMD se cree que el AP es misregulated debido a una pérdida de la función de CFH pero si el SNP juega un papel causal no está claro. Una hipótesis es que la histidina cargada positivamente se piensa para negar la posibilidad de CFH para unirse a las proteínas que interactúan proteína C reactiva y el sulfato de heparina 1,7. Los estudios in vitro de CFH Y402H proporcionan resultados contradictorios sobre diferencias funcionales entre las variantes, y en vivo en el trabajo <em> Cfh - / - ratones que expresan humanizado CFH está en curso 8. ARMS2 se encuentra aguas arriba de HtrA1 en el genoma de los primates, aunque el gen está ausente en los ratones. HtrA1 es una serina proteasa, pero ARMS2 está mal caracterizada. El desequilibrio de ligamiento entre los SNPs en el locus asociado a AMD ha hecho que sea difícil determinar las contribuciones al riesgo de mutaciones individuales de los genes en esta región, pero trabajos recientes han sugerido que es la sobreexpresión de HtrA1 en lugar de ARMS2 que conduce a la neovascularización y depósitos de proteínas subretinianas 9-11. Sin embargo, la proximidad de los genes en este locus puede permitir interacciones que no pueden ser estudiados utilizando transgenes insertados aleatoriamente.
Además de AMD, la familia HtrA de serina proteasas se ha asociado con muchas enfermedades humanas. Todas las proteínas HtrA contienen un dominio de serina proteasa seguido por al menos un dominio PDZ C-terminal. HtrA1, HtrA3 y HtrA4 comparten el grhomología comieres, que consta de un dominio de péptido señal, la unión del factor de crecimiento similar a la insulina, un inhibidor de la proteasa de dominio Kazal, el dominio de serina proteasa y un dominio PDZ. HtrA2 tiene un extremo N-terminal diferente, compuesta de una secuencia de localización mitocondrial, dominio transmembrana y el inhibidor de dominio de unión a la apoptosis seguido por los dominios de la proteasa y PDZ 12-16. HtrA1 mamíferos está regulado por la remodelación inducido por el sustrato en el sitio activo de su dominio de proteasa 17-20, y HtrA2 también puede ser modulada por la interacción entre la serina proteasa y dominios PDZ que suprime la actividad de la proteasa 21. Curiosamente, el dominio PDZ no parece conferir regulación similar a HtrA3 16. Las proteasas HtrA también pueden ser reguladas por factores extrínsecos: se ha demostrado recientemente que existe una interacción entre regulador HtrA1 y protoporfirinas 22 y HtrA2 pueden ser reguladas por la fosforilación tras la activación de la p38 MAP quinasavía de una manera dependiente de PINK1 23. La supresión de los miembros individuales de la familia HtrA en ratones se ha documentado, sin embargo efectos mecanicistas sobre todo no están claros en parte debido a la falta de fenotipos visibles.
HtrA1 desempeña una función importante en el control de calidad de proteínas y su regulación deficiente o mutación se ha asociado con muchas enfermedades humanas diferentes, incluyendo la artritis, el cáncer y un mayor riesgo de AMD 3,4,24-32. La pérdida de función HtrA2 en los tejidos neuronales se ha asociado con fenotipos PD en los seres humanos y los ratones, mientras que su pérdida a partir de tejidos no neurales resultados en envejecimiento acelerado 33-37. Desregulación HtrA3 se ha asociado con enfermedades que incluyen preeclampsia y ciertos tipos de cáncer 38,39. Sobre regulación de HtrA4 se ha observado en las placentas de pacientes con preeclampsia, pero los ratones knockout no muestran un fenotipo abierta 40,41. La falta de fenotipos observados en algunos ratones knockout ha sidopostula que ser el resultado de la compensación entre el miembro de la familia HtrA: se cree que tanto HtrA4 y HtrA1 interactuar con la familia TGF-B de las proteínas, lo que permite la compensación por HtrA1 a la supresión de HtrA4 41. Del mismo modo, se piensa que desde HtrA1 y HtrA3 tienen un alto grado de homología de dominio que podrían tener funciones complementarias 42. Sin embargo, se ha sugerido que las proteínas HtrA pueden tener papeles parcialmente antagónicos, compitiendo para regular objetivos comunes 43.
Para investigar más a fondo estos factores de riesgo se generaron tres líneas de ratones humanizados knock-in. En Cfh TM1 (CFH * 9) jhoh y TM2 Cfh (CFH * 9) jhoh, el exón 9 del gen Cfh se sustituye con el exón 9 del homólogo humano. TM1 Cfh (CFH * 9) jhoh codifica la tirosina no enfermedad asociada resto en la posición 402, mientras que Cfh TM2 (CFH * 9) jhoh lleva el Y402H, SNP riesgo asociado. EnARMS2 tm1jhoh la secuencia ARMS2 humana fue dirigida a una región aguas arriba de HtrA1. Una secuencia de parada loxP-flanqueado colocado aguas arriba de la secuencia del gen, pero aguas abajo del promotor UBIC incluido se escindió mediante el cruce de ratones OzCre, que expresan la recombinasa Cre bajo el control del promotor de Rosa26, como se describió anteriormente 34. Además de estos knock-in líneas, se generaron alelos knockout condicional para Cfh y HtrA1 (Cfh tm1jhoh y tm1jhoh HtrA1), así como los demás miembros de la familia HtrA conocidos: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (tm1jhoh HtrA3) y HtrA4 ( tm1jhoh HtrA4). Los agujeros ciegos de la línea germinal se crearon mediante el cruce de ratones OzCre a animales modificados para flanquear exones específicos con sitios loxP, tales que la supresión provoca un cambio de marco y / o supresión del dominio activo (Cfh; exón 3, HtrA1; exones 2-3, HtrA2: exones 2-4, HtrA3; exón 3, HtrA4; exones 4-6) 34,41. Una deleción neural de HtrA2, elimina el uso de la recombinasa Cre bajo el control del promotor de nestina (HtrA2 flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), también se ha descrito 34. Sólo los ratones que carecen de HtrA2, sistémica o en los tejidos neuronales, muestran fenotipos claros, que presentan fenotipos parkinsonianos.
Dado que algunos de estos genes de interés se postulan para ser localizado en las mitocondrias 11,44-47, y la supresión de HtrA2 generó fenotipos parkinsonianos, un régimen de fenotipificación con un enfoque mitocondrial y neurológico se describen aquí y se proporcionan resultados representativos de las pruebas de interés . Con el fin de examinar ratones genéticamente modificados producidos para investigar humano, la enfermedad relacionada con la edad a fondo y sistemáticamente se estableció un programa inicial fenotipificación, que consiste en una serie de pruebas relacionadas con los dos principalesenfermedades de interés: AMD y el Parkinson.
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Protocol
Ética declaración: Los estudios con animales se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud en las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Yale.
1. Ensayo de comportamiento de los ratones modificados genéticamente
Nota: Todos los ratones deben ser sometidos al mismo régimen de pruebas para limitar las diferencias en la habituación a la manipulación. Las pruebas deben realizarse a la misma hora del día cada vez.
- Neonatal Hind prueba Limb
Nota: La prueba del miembro posterior se lleva a cabo todos los días de día postnatal (P) 4 a P10 para evaluar la fuerza muscular de las extremidades posteriores proximal, debilidad y fatiga.- los ratones de transporte a la zona de pruebas y dejar reposar durante 30 minutos antes de la prueba.
- Preparar aparato de ensayo por la limpieza de un 50 ml tubo cónico con 70% de etanol, empujando dos (P8-P4) o un (P9-P10) bolas de algodón para la parte inferior de la tUbe y asegurar en una posición vertical.
- Retirar una cría a partir del peso de la jaula y registro. Mantenga las crías en que sostiene la bandeja en la almohadilla de calor cada vez que no probar.
- suspender suavemente las extremidades posteriores del recién nacido por encima del borde del tubo cónico, de modo que esté orientada hacia abajo hacia las bolas de algodón. Contar el número de intentos de tracción realizados y medida de latencia para caer usando un cronómetro.
- Repetir una vez más y luego etiquetar el cachorro con marcador. Después, identificar las crías P6 por el recorte del dedo del pie. Frotar suavemente con crías de las camas jaula antes de reemplazar.
- Limpiar tubo cónico con 70% de etanol.
- Repetir la prueba en el próximo cachorro hasta que toda la camada ha sido probado.
- Disponer de bola de algodón y tubo cónico. Limpiar todo el equipo con un 70% de etanol.
- Prueba de Observación Destetado
Nota: La prueba de observación del destete se administra todos los días de P19 a P21 para anotar los niveles de movimiento y la actividad general.- los ratones de transporte a una zona de pruebasnd dejar reposar durante 30 minutos antes de la prueba.
- Preparar cuadro de pruebas de plexiglás marcada con una cuadrícula de 6x6 de 2 cuadrados pulgadas en la base por la limpieza con 70% de etanol. Configurar un equipo de vídeo a un lado de tal manera que toda la caja está en el campo de visión. Mantenga el equipo y los alrededores de la misma cada día para evitar la introducción de novedad.
- Retire un niño destetado de la jaula y colocar en una taza limpia de retención. Registrar el peso.
- Iniciar la grabación de vídeo por el rodaje de la tarjeta de identificación de la prueba, con el número de identificación del ratón, la edad y la fecha de la prueba. Transferir el ratón que sostiene la taza de la plaza del centro. Tiempo durante tres minutos, contando el número de líneas atravesadas por las dos patas delanteras del ratón durante la prueba.
- Volver ratón a una grabación de vídeo jaula y limpieza final.
- Limpiar el aparato de ensayo con 70% de etanol.
- Repita hasta que toda la basura se prueba, a continuación, devolver todos los cachorros a la jaula.
- Limpiar todo el equipo de prueba con un 70% de etanol.
- Alambre de malla prueba la fuerza de agarre
Nota: La prueba de la fuerza de prensión se lleva a cabo en días alternos entre P22 y P26, para evaluar la fuerza neuromuscular.- los ratones de transporte al área de prueba y dejar reposar en la jaula durante 30 minutos antes de la prueba.
- Preparar aparato de limpieza por una caja y acoplamiento de la rejilla de plexiglás con 70% de etanol. Coloque el plástico de burbujas en la parte inferior de la caja y cubrir con papel.
- ratones separados en grupos de tres, poniendo en tazas individuales de cartera.
- Colocar primero ratón en el centro de la malla de alambre y lentamente invertir 10-20 cm por encima de la superficie suave en la parte inferior de la caja de plexiglás. Medir la latencia a caer usando un cronómetro. Terminar la prueba después de haber transcurrido 60 segundos si el ratón no lo haceotoño.
- Volver ratón para sujeción de copa, limpie la malla con un 70% de etanol y reemplazar el papel sobre el plástico de burbujas. Llevar a cabo la prueba en los dos ratones restantes en el grupo antes de regresar a la primera. Repita hasta que cada ratón se ha puesto a prueba un total de tres veces.
- Devolver al grupo a una jaula limpia y continuar con el resto de grupos. Si hay menos de tres ratones en cualquier grupo, asegúrese de que se permite un intervalo de recuperación entre ensayos 5 min.
- Devolver todos los ratones de la jaula de alojamiento, a disponer de papel y equipos de prueba limpia con un 70% de etanol.
2. Examen de la estructura de la retina
- Anestesiar los animales en P30-35 por inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Evaluar la profundidad de la anestesia pellizcando la almohadilla plantar y proceder sólo en la ausencia de una respuesta, de acuerdo con las directrices del IACUC. Perfusión con PFA al 4% / PBS 48.
- Para eliminar los ojos, limpiar la piel en la incisión SIde TE con 70% de etanol, antes de cortar a través de la piel en la base del cráneo. Pelar la piel para exponer el cráneo y limpio, con un 70% de etanol. El uso de instrumentos limpios, cortar cuidadosamente a través del cráneo para llegar a las cuencas de los ojos y exponer los ojos. Cortar el nervio óptico, retire suavemente el ojo de la toma y enjuague en PBS.
- Fijar los ojos en 4% PFA / PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
- Coloque los ojos en una pequeña placa de Petri que contiene PBS. Hacer una pequeña incisión en el centro de la córnea utilizando tijeras de eliminación de puntadas. Retire la córnea cortando el borde entre la córnea y la esclerótica. El uso de fórceps para extraer el iris. Por último, pelar las capas de RPE, dejando intacta la retina y el cristalino en su lugar.
Nota: El PFA / PBS fijación 4% causará desprendimiento de RPE que permite la RPE a ser fácilmente pelado desde el exterior de la retina. - Re-fix en 4% PFA / 30% sacarosa / PBS durante 15 min a temperatura ambiente antes de volver el ojo a una placa de Petri que contiene PBS. Tire de la lens utilizando pinzas, con lo que el cuerpo vítreo junto con él.
- Cryoprotect en sacarosa al 30% durante la noche a 4 ° C.
- los ojos de la capa en el compuesto óptimo de corte de temperatura (OCT) y la transferencia a un molde de inclusión que contiene frescos PTU. Oriente el ojo de tal manera que el plano sagital es paralelo con la cara de corte, utilizando como pocos movimientos como sea posible y evitando la introducción de burbujas de aire. Flash congelación por inmersión del molde en un baño de hielo seco / etanol. bloques almacenar a -80 ° C.
- El uso de un criostato, cortar 20 micras secciones sagitales y recoger en portaobjetos ya lavadas.
- Secciones se tiñen con hematoxilina y eosina de acuerdo con protocolos estándar 49. Imagen utilizando un microscopio óptico equipado para microscopía de campo claro.
3. La tinción histoquímica
- Preparación de la muestra
- La eutanasia a los animales en P30-35 usando sobredosis de isoflurano (30% en propilenglicol) a través de la inhalación gota abierta. Evaluar la eutanasia por el cesede la respiración, los latidos del corazón y la falta de respuesta a pellizcar la almohadilla plantar. Confirmar la muerte por dislocación cervical y la extracción de órganos, de acuerdo con las directrices del IACUC.
- Para retirar el cerebro, limpiar la piel en el sitio de la incisión con 70% de etanol, antes de cortar a través de la piel en la base del cráneo. Pelar la piel para exponer el cráneo y limpio, con un 70% de etanol. El uso de instrumentos limpios, cuidadosamente cortados a través del cráneo y retirar para exponer el cerebro. Retire las membranas, y retire con cuidado el cerebro de la cavidad del cráneo. Enjuague en PBS.
- Escudo. El cerebro en OCT y la transferencia a un molde de inclusión que contiene frescos octubre Oriente el cerebro de tal modo que el plano sagital es paralelo con la cara de corte, utilizando como pocos movimientos como sea posible y evitando la introducción de burbujas de aire. Flash de congelación por inmersión del molde en un baño de hielo seco / etanol y se almacena a -80 ° C.
- El uso de un criostato, cortar 10 micras secciones sagitales y recoger en portaobjetos ya lavadas.
<li> NADH diaforasa tinción - Preparar tampón de 0,05 M Tris, pH 7,6 mediante la disolución de 5,72 g de Tris-HCl y 1,66 g de base Tris en agua 1L-desionizada. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de seis semanas.
- Preparar la solución de NADH (NADH 2,25 mM en tampón Tris 0,05 M). Alícuota y almacenar a -20 ° C.
- Preparar la solución de NBT (2,5 mM nitro-azul de tetrazolio en tampón Tris 0,05 M). Almacenar a 4 ° C durante hasta seis semanas en una botella de vidrio.
- Combinar volúmenes iguales de solución de NADH y solución de NBT para hacer solución de tinción y añadir 1 ml de cada diapositiva. Incubar a 37 ° C en una cámara humidificada durante 30 min.
- Solución de tinción Aspirar y lavar tres veces con dH2O
- Lavar tres veces cada uno en orden ascendente y descendente concentraciones de acetona / dH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Enjuague tres veces en dH 2 O y montar las secciones con un medio acuoso. Imagen utilizando un microscopio óptico equipado para f brillanteLa microscopía ield. La tinción con azul corresponde a la actividad enzimática.
- La tinción histoquímica la succinato deshidrogenasa
- Preparar 0,2 M de fosfato de sodio monobásico / dH 2 O y 0,2 M de fosfato de sodio dibásico / dH2O
- Hacer tampón de 0,2 M fosfato, pH 7,6 mediante la combinación de 3 partes de fosfato monobásico con fosfato dibásico de 20 partes de sodio.
- Preparar la solución de tinción (succinato de sodio 0,1 M, 1,25 M NBT en tampón fosfato 0,2 M) y se añade 1 ml a cada diapositiva. Incubar a 37 ° C en una cámara humidificada durante 60 minutos.
- Solución de tinción Aspirar y lavar tres veces en dH 2 O.
- Lavar tres veces cada uno en orden ascendente y descendente concentraciones de acetona / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Enjuague tres veces en dH 2 O y montar las secciones con un medio acuoso. Imagen utilizando un microscopio óptico equipado para microscopía de campo claro. La tinción con azul corresponde a la norma ENzymatic actividad.
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Representative Results
Esta sección describe ejemplos de los resultados que se pueden obtener usando estos métodos. En la prueba de las extremidades posteriores, el número de intentos de tracción hecha y la latencia para el otoño son sumados por dos pruebas consecutivas para cada día. Esta prueba puede ser utilizada para comparar genéticamente diferentes grupos para distinguir los ratones con reducida fuerza neuromuscular tm1jhoh HtrA2 (HtrA2 KO) ratones en la Figura 1A -. B demuestran ningún cambio en el número de tirones y latencia a caer de P4-6 seguido de una reducción en fuerza neuromuscular en P7-10, en comparación con los compañeros de camada (HtrA2 WT). El aumento previsto de la fuerza con la edad también es observable en los animales de tipo salvaje. Para la prueba de observación del destete, la actividad total se puede evaluar mediante la suma de todos los eventos (líneas atravesadas, la crianza y la preparación de eventos), promediado en los tres días consecutivos de pruebas. Alternativamente, cada tipo específico de evento puede ser individually analizó. Resultados Aquí representativos se presentan, lo que demuestra una actividad reducida de ratones KO HtrA2 en comparación con compañeros de camada WT. Estos datos demuestran que la actividad total puede ser cuantitativamente mide y se compara entre los grupos (Figura 1C). También es posible cuantificar las diferencias en la fuerza de agarre mediante el cálculo de un promedio diario de las tres repeticiones realizadas en cada día de prueba. Cuando los ratones KO HtrA2 se comparan con los controles de la misma camada, reducciones en la resistencia manifestarse en una latencia más corta a caer (Figura 1D).
H & E tinción de la retina genera imágenes en las que la estructura de la retina puede ser examinado y comparado (Figura 2). Las capas de los tipos de células que componen la retina están claramente delineadas que permite la comparación entre los grupos genéticos. Aquí, HtrA2 tm1jhoh '; ratones HtrA3 tm1jhoh no muestran cambios en la estructura de la retina, en comparación con HtrA2
Figura 1:. Fenotipificación de comportamiento de los ratones modificados genéticamente tm1jhoh HtrA2 (KO HtrA2) los ratones fueron sometidos a la prueba de comportamiento descrito y en comparación con tipo salvaje (WT) HtrA2 littermate controles. (A - B) Se realizó la prueba de suspensión de las extremidades posteriores en WT y KO neonatos de P4-P10 y demuestra una reducción en neuromuscularfuerza en los animales KO (WT: n = 28, KO: n = 19). Cachorros (A) KO inicialmente hacen un número similar de intentos de extracción como hermanos WT, pero muestran una disminución de los intentos realizados en momentos posteriores. Latencia (B) KO 'neonatos a caer también es inicialmente normal, pero disminuye desde P7 en adelante. (C) La puntuación de la actividad total de la observación del destete se redujo en los animales KO en comparación con compañeros de camada WT, en consonancia con la actividad reducida de estos ratones (WT: n = 19, KO: n = 12). Animales (D) KO también tenían una latencia reducida a caer durante la prueba de inversión de malla, lo que demuestra reducida la fuerza de agarre de los ratones KO HtrA2 (WT: n = 17, KO: n = 9). Los datos representan la Media ± SEM (# 0,1 <p <0,05, * p <0,05, ** p <0,001, *** p <0,001 por pruebas t independientes). Esta cifra ha sido modificado a partir de Patterson et al. 34 Haga clic aquí para veruna versión más grande de esta figura.
Figura 2:. H & E tinción de retina secciones de la retina de la tinción con hematoxilina y eosina permite el examen de la estructura, la delimitación de las capas de la retina. A continuación, las secciones de WT P35 HtrA2; HtrA3 tm1jhoh (A) y tm1jhoh HtrA2; tm1jhoh HtrA3 (B) de visualización de la estructura normal de la retina. EPR: epitelio pigmentario de la retina, SO: segmentos exteriores, IS: segmentos internos, ONL: capa externa nuclear, OPL: capa plexiforme externa, INL: capa nuclear interna, IPL: la capa plexiforme interna, GCL; capa de células ganglionares. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 3: Actividad de complejo respiratorio tinción histoquímica para NADH diaforasa (complejo I) y la actividad succinato deshidrogenasa (complejo II) se realizó en secciones de cerebro transversales de HtrA2 P25 flox / flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (Nesko) y HtrA2 + / Flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (NesWT) hermanos de camada. Actividad de la enzima diaforasa NADH se disminuye en el cerebelo (CRBL, B) y el cuerpo estriado (D) de Nesko cerebro en comparación con los controles NesWT (A, C), pero no en la corteza cerebral (E - F). Actividad SDH se reduce de manera similar en el cerebelo y el cuerpo estriado de los ratones Nesko (H, J) en comparación con los controles NesWT (G, I), pero no hay cambio en la corteza cerebral (K - L). Barra de escala = 200 micras. Estacifra ha sido modificado a partir de Patterson et al. 34 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se necesitan tratamientos robustos para limitar el impacto de las condiciones relacionadas con el envejecimiento humano debilitante, pero sigue siendo difícil para muchas condiciones. Para identificar posibles dianas terapéuticas y desarrollar estrategias de intervención, las causas y la patología de las enfermedades asociadas con el envejecimiento primero deben ser entendidos. No todos los ratones modificados genéticamente inmediatamente presentes con fenotipos claros que están relacionados con la enfermedad de interés, incluso si estos genes han sido previamente vinculado a la condición en estudios humanos. Por lo tanto se requieren investigaciones más sistemáticas y ratones modificados genéticamente deben ser sometidos a experimentos adecuados para identificar fenotipos que pueden estar relacionados con las enfermedades asociadas en los seres humanos.
Existen pruebas de comportamiento Myriad para ensayar la función neurológica en los ratones 50,51. Las pruebas de comportamiento descritos en el presente documento son adecuados para los fenotipos hipótesis basadas en los resultados humanos y los fenotipos reales OBSErved en ratones. Además, estas pruebas son simples de realizar en laboratorios con poca o ninguna experiencia en la realización de experimentos de comportamiento. No hay ningún requisito para un equipo sofisticado, pero los resultados son significativos e informativo cuando se reciben correctamente, que los hace útiles como una primera etapa en el examen del fenotipo de ratones genéticamente modificados que se espera que tengan defectos neuromusculares. Los datos resultantes se pueden entonces utilizar para dirigir el foco de más pruebas, potencialmente con aparato de ensayo más sofisticado.
De manera similar, existen muchas técnicas para la evaluación de la función respiratoria en los tejidos 52. La medición de la tasa de síntesis de ATP, el consumo de oxígeno o cambios en el potencial de membrana mitocondrial son lecturas importantes de la función mitocondrial pero puede ser complicado y requiere mucho tiempo para llevar a cabo, lo que requiere reactivos y equipo 52-55 específicas. Además, a menudo se limitan a nivel de la mitochondRion o célula, basándose en las células cultivadas, de lisados o mitocondrias aisladas. La tinción histoquímica es un primer paso útil en la identificación de la disfunción mitocondrial y sin una gran inversión de tiempo o recursos. Además, la capacidad para teñir secciones de tejido se presta a la rápida identificación de las diferencias regionales que podrían no ser tan evidente con otras técnicas, por ejemplo la pérdida de la zona específica de la tinción enzimática observada en el cerebro HtrA2 deficientes. Aunque la técnica está limitada en su capacidad de medir cambios veces en la capacidad respiratoria, se traza regiones cerebrales definidas que pueden ser entonces perseguidos utilizando métodos más complejos.
Mientras que las técnicas presentadas dentro de este programa de fenotipificación son simples de realizar, la realización de ciertos pasos correctamente es fundamental para el éxito de los experimentos. Para el fenotipado conductual, el gran cuidado se debe tomar para asegurarse de pruebas se llevan a cabo al mismo tiempo y en el mismo lugar cada día para limitar la introducción de la variaciónproducida por la novedad de ubicación o por la diferencia en el ritmo circadiano. El equipo debe estar organizada de la misma manera cada día por razones similares. La organización de la sala es especialmente crítico para la prueba de actividad, donde los pequeños cambios en la novedad pueden influir en gran medida la actividad del ratón. Cuando se mide la fuerza de agarre, los investigadores deben asegurarse de que los ratones tienen una retención adecuada de la malla antes de la inversión. Del mismo modo, se debe tener cuidado para suspender adecuadamente el cachorro antes de soltar en la prueba de las extremidades posteriores o los resultados de las pruebas será sesgada hacia una latencia más corta a caer.
Para el fenotipo del tejido, obteniendo buenas secciones es vital. tinción informativo de la retina depende de la fijación efectiva antes surgirán disección o artefactos durante el corte y disección y distorsionan la morfología. La tinción histoquímica requiere cerebros para ser congelado rápidamente después de la disección para preservar la función de la enzima, pero el tiempo de incubación es de manera similar critical; pequeñas fluctuaciones en la temperatura o en la longitud de tiempo pueden causar diferencias en la intensidad de la tinción. Siempre que sea posible, las muestras deben ser procesados al mismo tiempo para permitir la comparación entre los grupos.
Aquí un régimen de pruebas utilizado para estudiar ratones modificados genéticamente esperados para mostrar fenotipos sutiles asociados a las enfermedades relacionadas con la edad, a saber, AMD y PD, se describe. Este programa de fenotipificación se puede utilizar para identificar los déficits en la fuerza y la actividad neuromuscular, así como identificar los defectos estructurales y funcionales dentro de los tejidos de interés. Este programa proporciona un análisis sistemático de los primeros fenotipos en ratones jóvenes, alterados genéticamente. En el futuro, este método se puede aplicar a cualquier ratones modificados genéticamente se considera que represente con un fenotipo relacionado AMD o PD, así como las de etiología desconocida que aparece abiertamente normal. La sencillez de las pruebas permite realizar pruebas sin una inversión significativa, pero se puede utilizar para informar a otros sos estudios. Mediante la combinación de las pruebas de comportamiento con el fenotipo celular, es posible limitar el número de ratones utilizados y comparar directamente el rendimiento del animal con la condición fisiológica. Este programa de fenotipificación ofrece un análisis inicial que se puede utilizar para dirigir el foco de estudios posteriores.
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Acknowledgments
Los fondos para esta investigación provino de la Fundación Médica Adelfa y el Fondo de Investigación del Decano Facultad de Medicina de la Universidad de Yale (JH). Agradecemos al Dr. Koenig Claire para obtener ayuda con los experimentos de comportamiento. Genéticamente líneas de ratón diseñado se generaron en Ozgene (Perth, Australia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Decon (Fisher Scientific) | 435541 | |
| 50 ml conical tube | Fisher Scientific | 1443222 | |
| cotton balls | Walmart | ||
| heat mat | Sunbeam | 0000756-500-000 | |
| Holding tray (ice cube tray) | Walmart | ||
| Electronic stopwatch | GOGO | PC396 | |
| Plexiglass box | constructed in workshop | 12" by 12" | |
| Vixia HF R400 Camcorder | Canon | 8155B004 | |
| 9 oz Clear Cups | Walmart | ||
| 1/4 inch wire mesh | Home Depot | 204331884 (online) / 554219 (in store) | 12" by 12" |
| Bubble wrap | VWR | 470092-416 | |
| Straight specimen forceps | VWR | 82027-438 | |
| Fine-tip dissecting forceps | VWR | 82027-408 | |
| Fine scissors | VWR | 82027-578 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10x phosphate buffered saline pH 7.4 | American Bioanalytical | AB11072-04000 | |
| Sucrose | JT Baker | 4072-01 | |
| superfrost slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hematoxylin Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 353016 | |
| Eosin Y Stain Solution | Fisher Scientific (Ricca) | 2845-32 | |
| Tris hydrochloride | Sigma | T3253 | |
| Tris | American Bioanalytical | AB02000-01000 | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate | Sigma | N8129 | |
| Nitrotetrazolium Blue chloride | Sigma | N6876 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-05 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S2378 | |
| VectaMount aqueous mounting medium | Vector Labs | H-5501-60 | |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-545-M | 60 mm x 24 mm |
| AxioImager A1 microscope | Zeiss | ||
| Video camera tripod | Amazon | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fischer Scientific | 23730571 | |
| Cryostat Sectioning Machine | Leica | CM1900 | Discontinued but since replaced by CM1950 |
References
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