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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

विधियों का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रोफिल में लिपिड बदलाव और न्युट्रोफिल कोशिकी जाल के बाद के गठन

Published: March 29, 2017 doi: 10.3791/54667
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1,4, 1, 1,4
1Department of Physiological Chemistry, University of Veterinary Medicine Hannover, 2Fish Disease Research Unit, University of Veterinary Medicine, 3Department of Clinical Sciences, Biomedical Center, Lund University, 4Research Center for Emerging Infections and Zoonoses (RIZ), University of Veterinary Medicine Hannover
* These authors contributed equally

Summary

लिपिड सेलुलर कार्यों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। यहाँ, हम न्यूट्रोफिल के लिपिड संरचना निर्धारित करने के लिए, कोलेस्ट्रॉल स्तर पर जोर देने के साथ, न्युट्रोफिल कोशिकी जाल गठन के अंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए दोनों HPTLC और एचपीएलसी का उपयोग करके एक विधि का वर्णन।

Abstract

उच्च प्रदर्शन पतली परत क्रोमैटोग्राफी (HPTLC) द्वारा किया जाता लिपिड विश्लेषण लिपिड की एक विस्तृत रेंज का विश्लेषण करने की एक अपेक्षाकृत सरल, लागत प्रभावी तरीका है। लिपिड (जैसे, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत या मेजबान प्रविष्टि में) के समारोह कोशिकीय प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सूचित किया गया है। यहाँ, हम लिपिड रचना निर्धारित करने के लिए, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) की तुलना में प्राथमिक रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल की कोलेस्ट्रॉल के स्तर, HPTLC द्वारा पर ध्यान देने के साथ एक विधि दिखा। उद्देश्य न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) के गठन में लिपिड / कोलेस्ट्रॉल परिवर्तन की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। नेट रिहाई मेजबान के भीतर फैलने से रोगाणुओं को रोकने के लिए एक मेजबान के सुरक्षा तंत्र के रूप में जाना जाता है। इसलिए, रक्त व्युत्पन्न मानव neutrophils कोशिकाओं में लिपिड परिवर्तन प्रेरित करने के लिए मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD) के साथ इलाज किया गया। HPTLC और एचपीएलसी का उपयोग करना, हम पता चला है कि कोशिकाओं के MβCD उपचार लिपिड की ओर जाता हैसेल की कोलेस्ट्रॉल सामग्री में उल्लेखनीय कमी के साथ जुड़े परिवर्तन। इसी समय, न्यूट्रोफिल की MβCD उपचार के रूप में immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाया गया है, जाल के गठन के लिए नेतृत्व। संक्षेप में, यहाँ हम न्यूट्रोफिल में लिपिड परिवर्तन और जाल के गठन का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

लिपिड सेल homeostasis, कोशिका मृत्यु, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, और साइटोकाइन रिहाई 1 में महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है। समय के साथ, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत या सूजन में लिपिड के प्रभाव पर के लिए ब्याज और ज्ञान में वृद्धि हुई है, और कई प्रकाशनों सेलुलर प्रतिक्रिया में कुछ लिपिडों की केंद्रीय भूमिका, विशेष रूप से स्टेरॉयड कोलेस्ट्रॉल, की पुष्टि करें। स्टैटिन, जो अवरुद्ध 3-हाइड्रोक्सी-3-methylglutaryl-coenzym-ए-रिडक्टेस द्वारा कोलेस्ट्रॉल जैवसंश्लेषण के अवरोधकों के रूप में उपयोग किया जाता है के साथ औषधीय उपचार (HMG-CoA-रिडक्टेस), इंटरल्यूकिन के सीरम स्तर को कम करके के रूप में विरोधी भड़काऊ एजेंट कार्य कर सकते हैं 6 और सी-रिएक्टिव प्रोटीन 2। कोलेस्ट्रॉल और glycosphingolipid-समृद्ध संरचनाओं इस तरह के बैक्टीरिया और वायरस के रूप में कई रोगाणुओं द्वारा, मेजबान 3, 4, 5 में एक प्रवेश द्वार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकतावर्ग = "xref"> 6। Sphingolipids (जैसे, sphingomyelin) दिखाया गया है रोगजनकों द्वारा प्रयोग की जाने वाली उनकी pathogenicity 7 बढ़ावा देने के लिए। मैक्रोफेज में, माइक्रोबैक्टीरिया उपयोग कोलेस्ट्रॉल समृद्ध कोशिकाओं में प्रवेश के लिए डोमेन; कोलेस्ट्रॉल की कमी माइकोबैक्टीरियल तेज 8 को रोकता है। इसके अलावा, Francisella tularensis, एक जूनोटिक एजेंट Tularemia के लिए जिम्मेदार है (यह भी खरगोश बुखार के रूप में जाना जाता है) 9, साथ मैक्रोफेज के संक्रमण एक संक्रमण है कि जब कोलेस्ट्रॉल झिल्ली 10 से समाप्त हो गया था समाप्त कर दिया गया का नेतृत्व किया। इसी तरह, लिपिड युक्त संरचनाओं के माध्यम से कोलाई द्वारा मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण कोलेस्ट्रॉल पर निर्भर 4 होने के लिए प्रदर्शित किया गया। इसके अलावा, साल्मोनेला उपकला कोशिकाओं से typhimurium संक्रमण प्रयोगों प्रदर्शन किया है कि कोलेस्ट्रॉल कोशिकाओं 11 में रोगज़नक़ प्रवेश के लिए आवश्यक है। कोलेस्ट्रॉल कमी inhibiteघ साल्मोनेला 11 की तेज। इसके अलावा, Gilk एट अल द्वारा हाल के एक अध्ययन। दिखा दिया है कि कोलेस्ट्रॉल Coxiella burnetti 12 की तेज करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। साथ ही, Tuong एट अल। पाया गया कि 25-hydroxycholesterol lipopolysaccharide (LPS) द्वारा phagocytosis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता मैक्रोफेज 13 -stimulated। Phagocytosis कम हो गया था जब मैक्रोफेज औषधीय कोलेस्ट्रॉल 14 व्यय करने के लिए इलाज किया गया। इस प्रकार, कोलेस्ट्रॉल और अन्य लिपिड, संक्रमण और सूजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए के बाद से उनकी कमी कई रोगजनकों 10, 11, 12 से आक्रमण के खतरे को कम कर सकते हैं लगता है।

हाल ही में, हम, कि लिपिड परिवर्तन, सेल से कोलेस्ट्रॉल का विशेष रूप से कमी दिखाने न्युट्रोफिल extracellula के गठन के लिए प्रेरित करने में सक्षम थेआर जाल (नेट) मानव रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल 15 में। 2004 में जाल के खोज के बाद से वे इस तरह संक्रमण की 16, 17 के प्रसार में बाधा उत्पन्न में बैक्टीरिया फंसाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते दिखाया गया है, और। जाल हिस्टोन, proteases, और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स 16 के साथ जुड़े एक डीएनए रीढ़ की हड्डी से मिलकर बनता है। न्यूट्रोफिल द्वारा जाल के रिलीज रोगजनकों 18, 19 और रासायनिक पदार्थों ऐसे phorbol-myristate-एसीटेट (PMA) या 16 स्टैटिन, 20 के रूप में हमलावर द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। हालांकि, विस्तृत सेलुलर तंत्र, और इस प्रक्रिया में लिपिड के विशेष रूप से भूमिका है, अभी भी नहीं पूरी तरह से स्पष्ट कर रहे हैं। लिपिड के विश्लेषण इस तरह के जाल के रिलीज के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं और बातचीत, की एक विस्तृत विविधता में शामिल तंत्र का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। CholesteROL और sphingomyelin कोशिका झिल्ली और लिपिड microdomains, जहां वे स्थिरता जोड़ सकते हैं और प्रोटीन की तस्करी और घटनाओं 21 संकेत में प्रोटीन शामिल क्लस्टरिंग की सुविधा के महत्वपूर्ण घटक हैं। इस तरह के चक्रीय oligosaccharide मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD) के रूप में कुछ लिपिड, amphiphilic औषधीय एजेंटों, की यंत्रवत भूमिका की जांच करने के लिए, एक सेल के लिपिड संरचना को बदलने के लिए और इन विट्रो 15 में कोलेस्ट्रॉल को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम HPTLC उपयोग करने के लिए MβCD के जवाब में न्यूट्रोफिल के लिपिड संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। एचपीएलसी न्युट्रोफिल आबादी में कोलेस्ट्रॉल के स्तर पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, हम MβCD के जवाब में मानव रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल में immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा मच्छरदानी का गठन कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में परिधीय रक्त का संग्रह स्थानीय मानव अनुसंधान नैतिकता आयोग द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी मानव विषयों उनकी लिखित सूचित सहमति प्रदान की है।

घनत्व ढाल centrifugation द्वारा मानव रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल की 1. अलगाव

  1. मानव रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल का अलगाव
    1. परत ~ एक लौ के पास और मिश्रण के बिना सोडियम diatrizoate / dextran समाधान के 20 एमएल पर खून की 20 एमएल।
    2. ब्रेक के बिना 470 XG पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    3. mononuclear कोशिकाओं और पीले रंग के प्लाज्मा परत निकालें। (कोशिकाओं जमा के साथ दूसरे चरण; आंकड़े 1 और 2) Polymorphonuclear सेल (PMN) चरण स्थानांतरण एक नया 50 एमएल ट्यूब में और 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ 50 एमएल के लिए इसे भरें।
    4. ब्रेक के साथ 470 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    5. तैरनेवाला निकालें और बाँझ पानी के 5 एमएल के लिए में गोली resuspendआर 5 रों एरिथ्रोसाइट्स lyse करने के लिए।
    6. इसके तत्काल बाद में 470 x जी 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ 50 एमएल और अपकेंद्रित्र को भरें।
    7. सतह पर तैरनेवाला निकालें। गोली सफेद होना चाहिए। अगर यह अभी भी लाल है, दोहराने 1.1.5 और 1.1.6 कदम दूर है।
    8. रोजवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) माध्यम के 1000 μL में गोली Resuspend। सेल संख्या की गणना के लिए एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे एक hemocytometer में trypan नीले रंग धुंधला का उपयोग कर।
    9. 2 एक्स 10 6 / एमएल की एकाग्रता पर RPMI में एक सेल निलंबन तैयार करें। लगभग 2.5 x 10 7 न्यूट्रोफिल खून की 20 एमएल से काटा जा सकता है।
  2. लिपिड विश्लेषण के लिए न्यूट्रोफिल के औषधीय उपचार
    1. कदम 1.1.9 से 5 x 10 7 कोशिकाओं का प्रयोग करें। एक 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में 300 μL की कुल मात्रा में उपस्थिति या 10 मिमी MβCD या 25 एनएम पीएमए के अभाव में शुद्ध Hank's बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) मध्यम में सेल नंबर समायोजित करें।
    2. में नमूने सेते37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए प्रतिक्रिया ट्यूबों।
    3. ब्रेक के साथ 470 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    4. तैरनेवाला निकालें और HBSS के 300 μL में सेल गोली resuspend।
    5. ब्रेक के साथ 470 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    6. में और 10 बार एक 1 एमएल सिरिंज में बाहर नमूना चूस कर, यह एक 26-जी प्रवेशनी के साथ homogenize, और -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की दुकान: (1 1) क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल के 1 एमएल में सेल गोली Resuspend।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा नेट मात्रा के लिए न्यूट्रोफिल के औषधीय उपचार
    1. -लाइसिन में लिपटे पाली एल तैयार कांच coverslips के साथ 48-अच्छी तरह प्लेटें।
      1. अच्छी तरह से प्रत्येक में एक 8 मिमी कांच coverslip रखें, बाँझ 0.01% पाली-एल लाइसिन के 55 μL जोड़ें, और ~ के लिए सेते कमरे के तापमान (आर टी) पर 20 मिनट।
    2. 1x पीबीएस के 200 μL के साथ दो बार धोएं। एक रेफ्रिजरेटर में अच्छी तरह से प्रति 1x पीबीएस के 200 μL के साथ प्लेटें स्टोर जब तक की आवश्यकता है।
    3. गाड़ीefully प्रत्येक coverslip के केंद्र में अच्छी तरह से प्रति कदम 1.1.9 से सेल निलंबन (2 x 10 5/100 μL) के 100 μL जोड़ें।
    4. या तो अंतिम 10 मिमी MβCD या अंतिम 25 एनएम पीएमए की अच्छी तरह से प्रति 100 μL जोड़ें।
    5. ब्रेक के साथ 370 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं।
    7. ब्रेक के साथ 370 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    8. , 4% की 155 μL पीएफए ​​के साथ कोशिकाओं को ठीक करें उन्हें प्लास्टिक तेल फिल्म में लपेट, और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर या आरटी पर 10 मिनट के लिए रात भर की दुकान।
      नोट: MβCD से प्रेरित नेट गठन पर डेटा के लिए, न्यूमन एट अल देखें। 15।

2. लिपिड अलगाव और मानव रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल का विश्लेषण

  1. Bligh और डायर 22 और Brogden एट अल के आधार पर मानव परिधीय रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल से लिपिड को अलग। 23
    1. बर्फ पर, एक polytetrafluoroethylene (PTFE) मुहर के साथ एक 15 एमएल पेंच टोपी शीशे की नली को न्यूट्रोफिल (मेथनॉल और क्लोरोफॉर्म समाधान में मौजूद) विंदुक और 1 मिनट के लिए मिलाने से उन्हें homogenize। प्लास्टिक सतहों के लिए बाध्य से लिपिड को रोकने के लिए कांच ट्यूब का प्रयोग करें। उपयोग PTFE रबर / प्लास्टिक से संक्रमण को रोकने के लिए सीमित।
    2. मेथनॉल के 2 एमएल जोड़ें क्लोरोफॉर्म के 1 एमएल से 1 मिनट के बाद में पीछा किया। 1 मिनट के लिए फिर से हिला।
    3. आरटी पर कांच ट्यूब और 30 मिनट के लिए 50 rpm घुमाएँ।
    4. 7 डिग्री सेल्सियस पर समाधान और 10 मिनट के लिए 1,952 XG पर centrifuging द्वारा प्रोटीन अंश गोली।
    5. ध्यान से एक नया 15 मल ग्‍लास पेंच टोपी ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला छानना, प्रोटीन युक्त गोली अकेली रह गई। भविष्य मात्रा के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली संग्रहित करें।
    6. क्लोरोफॉर्म के 1 एमएल जोड़ें, 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें, डबल आसुत जल के 1 एमएल जोड़ने के लिए, 30 s के लिए नमूने के साथ कांच पेंच टोपी ट्यूब को उलटने के। 7 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र और 10 मिनट के लिए 1,952 XG पर और ऊपरी चरण त्यागें, करने के लिए नीचे है, लेकिन सहित नहीं, बादल परत।
    7. यदि आवश्यक हो, कदम 2.1.8 को दोहराते हुए एक वैकल्पिक आगे शुद्धि कदम प्रदर्शन करते हैं।
    8. 60 डिग्री सेल्सियस पर एक निर्वात सांद्रक में नमूने सूखी और डिग्री सेल्सियस -20 पर संग्रहीत जब तक की आवश्यकता है।
  2. उच्च प्रदर्शन पतली परत क्रोमैटोग्राफी के लिए (HPTLC) कोलेस्ट्रॉल, फॉस्फोलिपिड, और sphingomyelin सहित कई लिपिड, की राशि अर्द्ध यों
    1. निम्नलिखित चार चल समाधान और धुंधला समाधान तैयार करें।
      1. समाधान 1: एथिल एसीटेट (26.6%), 1-propanol (26.6%), क्लोरोफॉर्म (26.6%), मेथनॉल (26.6%), और पोटेशियम क्लोराइड (9.6%) मिक्स। एचपीएलसी गुणवत्ता वाले पानी की 100 एमएल में KCl का 0.25 ग्राम भंग द्वारा KCl तैयार करें।
      2. समाधान 2: मिक्स एन-हेक्सेन (73%), diethyl ईथर (23%), और साइट्रिक एसिड (2%)।
      3. समाधान 3: 100% एन-हेक्सेन।
      4. द्वारा धुंधला समाधान तैयारकॉपर सल्फेट के 7.5 ग्राम के साथ आसुत जल (90 एमएल) मिश्रण, और फिर फॉस्फोरिक एसिड के 10 एमएल जोड़ें।
    2. एक अलग गिलास कक्ष में प्रत्येक समाधान के 5 मिमी अप करने के लिए भरें। फिल्टर पेपर के किसी भी प्रकार प्रत्येक कक्ष में चल रहा है गति को बढ़ाने में जोड़े।
    3. पहले चल समाधान में एक 20 x 10 सेमी HPTLC सिलिका जेल 60 गिलास प्लेट पूर्व सेते हैं जब तक चल रहा है समाधान प्लेट के ऊपर तक पहुँचता है। फिर 110 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इसे सूखने।
      नोट: ये प्लेटें एल्यूमीनियम पन्नी में भविष्य में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है और उपयोग करने से पहले 110 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सूखे।
    4. (1: 1) लिपिड गोली क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल के 200 μL में कदम 2.1.10 से प्राप्त भंग समाधान और भंग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. एक शासक और एक नरम पेंसिल नमूने की वांछित संख्या के लिए लोड हो रहा है स्पॉट चिह्नित करने के लिए, के साथ साथ कम से कम एक मानक का प्रयोग करें। मार्क चल दूरी पर लगभग 4 सेमी और पहले और दूसरे चल समाधान, क्रमशः के लिए 6 सेमी।
    6. नमूने लोड करने के लिए, क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल में 10 μL सिरिंज 3 बार धोने (1: 1) पहले प्रत्येक नया नमूना लोड हो रहा है। लोड प्रत्येक नमूने बूंद-वार के 10 μL, संभव के रूप में छोटा स्थान पर नमूना ध्यान केंद्रित करने की कोशिश कर रहा। नमूने डुप्लिकेट में कम से कम लोड किया जाना चाहिए।
    7. समाधान 1 (कदम 2.2.1.1) चल साथ पहली चेंबर में खड़ी प्लेट रखें। सुनिश्चित करें कि प्लेट एक समान माइग्रेशन की गति को प्राप्त करने के कांच कक्ष की दीवार के समानांतर है।
    8. एक बार जब विलायक लाइन पहले के आंकड़े तक पहुंच गया है, थाली निकालने के लिए, यह सूखी, और दूसरा समाधान में रखें। दूसरे के लिए और तीसरे चल समाधान के लिए समान चरणों को दोहराएं; समाधान में थाली छोड़ जब तक विलायक सामने प्लेट के ऊपर तक पहुँच जाता है, तो 1 मिनट के लिए हटा दें और आरटी पर यह सूखी।
    9. कॉपर सल्फेट के घोल में थाली 7 s के लिए रखें। थाली निकालें, इसे अच्छी तरह से सूखे, और 170 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट के लिए एक ओवन में बेक यह। थाली शांत करने के लिए प्रतीक्षा करें।
    10. उसीएनजी एक पतली परत क्रोमैटोग्राफी और जेल विश्लेषण सॉफ्टवेयर, और साथ ही एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर, स्कैन और के रूप में Brogden एट अल द्वारा पहले बताए का विश्लेषण। 23।
  3. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) कोलेस्ट्रॉल की मात्रा अंदाजा लगाना
    1. एक 5 सुक्ष्ममापी / 4.6 मिमी गार्ड कारतूस के लिए एक 100 x 4.6 मिमी स्तंभ संलग्न करें और यह 32 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी। प्रत्येक नमूने में कोलेस्ट्रॉल की मात्रा की गणना कर 65 बार में 1 एमएल / मिनट की प्रवाह की दर और 202 एनएम पर एक यूवी डिटेक्टर को मापने पर मोबाइल चरण के रूप में मेथनॉल का प्रयोग करें।
    2. पंप की सफाई, सुई धोने, बर्तन धोने, सिरिंज के शुद्धिकरण, और पंप पर्ज धोने: एचपीएलसी मशीन को अच्छी तरह से, नमूने का विश्लेषण करने के लिए निम्न चरणों का प्रदर्शन से पहले धो लें। पानी के साथ सभी को धो लें। अन्त में, 5 मिनट के लिए 5 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर पर मेथनॉल के साथ एक प्रणाली पर्ज प्रदर्शन करते हैं।
    3. एक कोलेस्ट्रॉल मानक वक्र की स्थापना करने के लिए, कम से कम 4 से लेकर सांद्रता तैयार0.05 मिलीग्राम से / एमएल 2 मिलीग्राम / क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल में कोलेस्ट्रॉल की एमएल (1: 1) 24।
    4. नमूने क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल के 500 μL में कदम 2.1.10 से प्राप्त Resuspend (1: 1) पेंच शीर्ष लाल PTFE / सफेद सिलिकॉन पलकों के साथ एम्बर रंग का 1.5 मल ग्‍लास की बोतलों में।
    5. मानक कदम 2.3.3 में तैयार का उपयोग कर कोलेस्ट्रॉल सांद्रता यों।
      नोट: नमूना प्रोटोकॉल में भरें, कम से कम एक मानक और एक ऋणात्मक नियंत्रण, नमूने के बाद के साथ शुरू।
    6. वक्र के तहत क्षेत्र के रूप में परिणाम एक्सप्रेस और किसी सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उचित नमूनों के बीच की तुलना करें।
      नोट: परिणाम भी एक मानक वक्र के खिलाफ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और प्रति मिली कुल कोलेस्ट्रॉल राशि, ग्राम, या कोशिकाओं की संख्या के रूप में दिखाया जा सकता है। मानक वक्र समीकरण मूल्यों कदम 2.3.3 में प्राप्त का उपयोग करके गणना की जानी चाहिए।

3. विज़ुअलाइज़ेशन और जाल के मात्रा

  1. विज़जाल के ualization
    नोट: जाल के दृश्य न्यूमन एट अल द्वारा पहले से प्रकाशित काम पर आधारित है। 15।
    1. 1x पीबीएस के 200 μL के साथ 1.3.8 3 बार कदम से तय नमूने धो लें।
    2. ब्लॉक और आरटी पर 45 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रति पीबीएस में 2% बीएसए के 100 μL, 0.2% ट्राइटन X-100 के साथ permeabilize।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें: माउस मोनोक्लोनल विरोधी डीएनए हिस्टोन 1 एंटीबॉडी (2.2 मिलीग्राम के साथ शेयर पतला / एमएल 1: पीबीएस 2% बीएसए और 0.2% युक्त 5000 ट्राइटन X-100) या myeloperoxidase के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (MPO; खरगोश विरोधी MPO; पतला 1: पीबीएस 2% बीएसए और 0.2% ट्राइटन X-100) युक्त में 300। 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    4. 1x पीबीएस के 200 μL के साथ 3 बार धोएं।
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μL जोड़ें (; 1 प्रतिदीप्ति लेबल बकरी विरोधी माउस: 1,000 बीएसए-पीबीएस-ट्राइटन X-100 और बकरी विरोधी खरगोश में, 1: 1,000 बीएसए-पीबीएस-ट्राइटन X-100) पर 1 घंटे के लिए अंधेरे में आरटी।
    6. 200 & # के साथ 3 बार धोएं181; 1x पीबीएस के एल।
    7. चिमटी का उपयोग कर coverslips निकालें और जगह उन्हें बढ़ते मध्यम गिलास स्लाइड पर DAPI युक्त के 3 μL के साथ नीचे का सामना।
    8. एक कोंफोकल उल्टे आधार प्रतिदीप्ति एक HCX पी एल एपीओ 40X 0.75-1.25 तेल विसर्जन उद्देश्य 15 से लैस खुर्दबीन का इस्तेमाल करके नमूनों की जांच करना।
  2. नेट रिहा नाभिक के मात्रा
    1. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ) और खींचें और खोलें उपकरण पट्टी में छोड़ ब्याज की तस्वीर।
    2. "प्लग इन," "का विश्लेषण करें," और "सेल काउंटर पर क्लिक करें।"
    3. (जैसे, पर 7 लाल रंग में नेट रिहा कोशिकाओं के लिए पीले रंग में गैर रिहा कोशिकाओं के लिए, जैसा कि चित्र में दिखाया गया है पर क्लिक करें और 8 6B-मैं और ii) काउंटर विंडो में "प्रारंभ" बटन दबाएं और एक काउंटर प्रकार चुनें।
      नोट: नेट पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए मापदंड: सकारात्मक दाग हरी नाभिक + एक कम घना nucleus (lobulation की हानि) या नाभिक का गोल आकार + नाभिक का एक बढ़ा आकार, या बंद शूट एक अलग बाह्य की एक घटना का नुकसान।
    4. उपरोक्त मानदंडों के लिए हर सेल पालन क्लिक करें और एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का एक डाटा शीट में गिना सेल नंबर लिखें।
    5. नेट रिहा नेट रिहा और गैर रिहा कोशिकाओं की गिना सेल नंबर का उपयोग कर कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना।

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Representative Results

मानव रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल घनत्व ढाल centrifugation (चित्रा 2) द्वारा पृथक किया गया। न्यूट्रोफिल पर लिपिड परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए, कोशिकाओं 10 मिमी MβCD, जो कोशिका से कोलेस्ट्रॉल को क्षीण करता साथ इलाज किया गया। इसके बाद, लिपिड के रूप में Brogden एट अल द्वारा वर्णित है, Bligh और डायर (चित्रा 1, बाएं पैनल) द्वारा नमूनों से पृथक किया गया। 23। तैयार लिपिड नमूने सिलिका जेल HPTLC प्लेटें और रन एक तीन समाधान प्रोटोकॉल है, जो अलग और लिपिड की एक विस्तृत रेंज, कोलेस्ट्रॉल, कोलेस्ट्रॉल एस्टर, sphingomyelin, फॉस्फोलिपिड, और triacylglycerides, मुक्त फैटी एसिड सहित कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया गया है का उपयोग कर पर लोड किया गया , monoacylglycerol, phosphatidylethanolamine, cardiolipin, phosphatidylserine, और phosphatidylcholine (चित्रा 3A)। कोलेस्ट्रॉल के ऑक्सीजन डेरिवेटिव (oxysterols) w पता लगाने योग्य नहीं हैंइस विधि रबर। कोलेस्ट्रॉल का एक अतिरिक्त मात्रात्मक विश्लेषण एचपीएलसी (चित्रा 3 बी) का उपयोग किया गया था। कोलेस्ट्रॉल के लिए प्रतिगमन मूल्य स्पष्ट रूप से बेहतर जब एचपीएलसी (चित्रा 4 ए) का उपयोग कर HPTLC (चित्रा 4 बी) की तुलना में था। जाल कल्पना करने के लिए, कोशिकाओं, उपर्युक्त उत्तेजनाओं के साथ प्रेरित तय, और डीएनए / हिस्टोन 1 (हरा), MPO (लाल), और डीएनए (नीला) के रूप में ठेठ नेट मार्कर (चित्रा 5 ए) के लिए दाग रहे थे। चित्रा 5 ए, MPO, डीएनए / हिस्टोन 1 का एक स्पष्ट घटना में दिखाया गया है, और डीएनए जाल में तब होता है जब कोशिकाओं 2 घंटे के लिए 10 मिमी MβCD साथ इलाज किया गया है। बाद में, कोलेस्ट्रॉल में कमी के प्रभाव को माइक्रोस्कोप से विश्लेषण किया गया था। इसलिए, कोशिकाओं के डीएनए (नीला) और डीएनए / हिस्टोन 1 (हरा) के लिए दाग रहे थे, और नेट रिहा नाभिक इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर ImageJ (चित्रा 5 ब) से सेल काउंटर प्लगइन का उपयोग कर की गिनती की गई। अनुपचारित न्यूट्रोफिल spontaneou के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवानेट गठन (चित्रा 5 ब-i) है। दिखाया गया चित्र में, ऊष्मायन के 2 घंटे के बाद इलाज न्यूट्रोफिल में नेट जारी, 3.89% थी, जबकि 10 मिमी MβCD साथ कोशिकाओं के इलाज 35.17% नेट गठन (चित्रा 5 ब) में हुई।

आकृति 1
चित्र 1: योजनाबद्ध दिखा चरणों मानव रक्त व्युत्पन्न न्यूट्रोफिल से लिपिड रचना और बाह्य जाल रिहाई का निर्धारण करने में शामिल किया गया। न्यूट्रोफिल एक घनत्व ढाल का उपयोग कर अलग किया और लिपिड परिवर्तन और नेट गठन प्रेरित करने के लिए मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD) के साथ इलाज कर रहे हैं। इसके बाद, लिपिड अलग हो जाती हैं और या तो HPTLC या HPLC का उपयोग करके विश्लेषण किया, और जाल कल्पना और immunofluorescence द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं।

चित्र 2
रोंग> चित्रा 2: छवियाँ ताजा-पृथक खून से Polymorphonuclear कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता एक विशिष्ट घनत्व ढाल चित्रण। प्लाज्मा, mononuclear कोशिकाओं, Polymorphonuclear कोशिकाओं, और एरिथ्रोसाइट्स: चार परतों दिखाई पद centrifugation हैं।

चित्र तीन
चित्र 3: न्यूट्रोफिल से अलग लिपिड के HPTLC और एचपीएलसी विश्लेषण। (ए) स्टैंडर्ड HPTLC (बाईं लेन) के माध्यम से लिपिड न्यूट्रोफिल में मौजूद पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया। सीई: कोलेस्ट्रॉल एस्टर, TG: Triacylglycerides, एफएफए: नि: शुल्क फैटी एसिड, चोल: कोलेस्ट्रॉल, एमजी: Monoacylglycerol, पीई: phosphatidylethanolamine, CL: cardiolipin, पुनश्च: फॉस्फेटीडाइलसिरिन, पीसी: Phosphatidylcholine, और एसएम: Sphingomyelin। (बी) 4.980 मिनट में / 2 मिलीग्राम के लिए एक कोलेस्ट्रॉल विशिष्ट शिखर एमएल दिखा यहाँ वर्णित एचपीएलसी प्रोटोकॉल का उपयोग प्रतिनिधि परिणाम।

jove_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 4
चित्र 4: एचपीएलसी और HPTLC कोलेस्ट्रॉल का विश्लेषण करती है। , कोलेस्ट्रॉल एकाग्रता और क्षेत्र के बीच संबंधों को दिखा के रूप में, एचपीएलसी (ए), और बैंड तीव्रता द्वारा मापा HPTLC (बी) द्वारा मापा रेखांकन। एचपीएलसी के लिए न्यूनतम पता लगाने की सीमा 0.998 एन = 3, SEM (ए) के मानक वक्र के लिए एक प्रतिगमन मूल्य के साथ, 0.0016 मिलीग्राम / एमएल था। 2 मिलीग्राम से लेकर कोलेस्ट्रॉल / एमएल नीचे 0.05 मिलीग्राम / एमएल अर्द्ध मात्रा निर्धारित HPTLC (बी) का उपयोग करते हुए, हो सकता है 0.05 मिलीग्राम / एमएल एन = 3, SEM की एक न्यूनतम पता लगाने की सीमा के साथ। HPTLC मानक वक्र के लिए प्रतिगमन मूल्य 0.918 है।

चित्रा 5
चित्र 5: प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति micrographs नेट संरचनाओं और subseq प्रदर्शितनेट मात्रा uent। (ए) न्यूट्रोफिल 10 मिमी MβCD साथ प्रेरित 2 घंटे के लिए के लिए (ii) MPO (लाल), (iii) डीएनए / हिस्टोन 1 (हरा) दाग रहे थे, और (iv) डीएनए (नीला)। (I) के ओवरले (ii), (ग), और (iv)। (बी) कोशिकाओं (i) HBSS मध्यम या (ii) 10 मिमी MβCD, और जारी की नेट के साथ 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट गया नाभिक (नीला) और डीएनए / हिस्टोन 1 (हरा) के लिए दाग रहे थे। नेट नकारात्मक नाभिक काउंटर 8 (पीला) और नेट पॉजिटिव साथ काउंटर 7 (लाल) नाभिक के साथ चिह्नित किया गया।

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Discussion

(देखें न्यूमन एट अल। 15) यहाँ वर्णित विधियों ऐसे कोलेस्ट्रॉल के रूप में विशिष्ट लिपिड, HPTLC या HPLC द्वारा, विश्लेषण करने के लिए और जाल के गठन पर औषधीय लिपिड परिवर्तन के प्रभाव की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

HPTLC नमूने की एक बड़ी संख्या में लिपिड की एक विस्तृत रेंज का विश्लेषण करने के लिए एक अपेक्षाकृत लागत प्रभावी और आसान तरीका है। इस विधि एंटीबायोटिक मात्रा 25, लाइसोसोमल भंडारण रोगों 26 में लिपिड भंडारण, और उपकला कोशिकाओं 27 में कोलेस्ट्रॉल और cholesterylglucoside स्तरों के निर्धारण सहित कई अनुसंधान क्षेत्रों में इस्तेमाल किया गया है। विधि यहाँ वर्णित संशोधित और एक शुद्ध न्युट्रोफिल आबादी से लिपिड को अलग करने के लिए अनुकूलित किया गया था; हालांकि, एक थोड़ा संशोधित संस्करण भी ऊतक के नमूने से लिपिड (Brogden एट अल। 23 देखें) को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मुलाकात का उपयोग करनाविभागाध्यक्ष, लिपिड भी प्रभावी ढंग से अलग किया जा सकता है की पहचान की है, और एक ज्ञात मानक के खिलाफ सेमी-मात्रा निर्धारित। के बाद से किसी भी अन्य बफर या मध्यम के उपयोग लिपिड प्रदूषण और नमूनों में unspecific लिपिड बैंड को जन्म दे सकती इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम है, संबंधित नामित बफर के उपयोग है। चूंकि संवेदनशीलता HPTLC साथ ही सीमित है, एचपीएलसी पूर्ण मात्रा के लिए एक और अधिक सटीक पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

एचपीएलसी एक ज्ञात लिपिड के लिए एक तुलना प्रदर्शन से मात्रात्मक और कोलेस्ट्रॉल और इसके विभिन्न रूप या डेरिवेटिव की पहचान की सुविधा। प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित का उपयोग करके, यह मज़बूती से, 0.0016 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल (चित्रा 4 ए) करने के लिए नीचे मात्रा को जानने के 10 मिलीग्राम / एमएल (आर = 0.990) करने के लिए एक रेखीय अनुपात के साथ संभव है। HPTLC विधि 0.05 मिलीग्राम / एमएल के लिए नीचे कोलेस्ट्रॉल का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन एक अवग्रह वक्र और अनुसंधान के एक कम सहसंबंध गुणांक = 0.906 (चित्रा 4 बी) के साथ। उच्च संवेदनशीलता और उच्च सहसंबंध गुणांक इस प्रकार एचपीएलसी लिपिड की सही मात्रा, जो बाद में सक्षम बनाता है नमूने के बीच छोटे मतभेदों को पता लगाया जा करने के लिए एक बहुत बेहतर विधि बनाता है। हालांकि, दोनों तरीकों संयोजन में उपयोग किया जा सकता है; HPTLC एक सिंहावलोकन जिसमें लिपिड बदला जा सकता है हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और एचपीएलसी किसी दिए गए नमूने में एक विशिष्ट लिपिड के अंतर आकलन करना बहुत अधिक लक्षित दृष्टिकोण में इस्तेमाल किया जा सकता है। जब दूसरे लोग 28, 29 के द्वारा प्राप्त मूल्यों के साथ हमारे माप तुलना, कम कोलेस्ट्रॉल की कुल न्यूट्रोफिल में मात्रा निर्धारित किया गया था। यह प्रयुक्त पद्धति के द्वारा समझाया जा सकता है। अन्य अध्ययनों से एक fluorimetric का पता लगाने, जो एक एंजाइम युग्मित प्रतिक्रिया है कि दोनों मुक्त कोलेस्ट्रॉल और cholesterylesters का पता लगाता है पर आधारित है प्रयोग किया जाता है।

इधर, HPTLC और एचपीएलसी की पुष्टि है कि MβCD कोलेस्ट्रॉल का एक महत्वपूर्ण कमी के रूप में भी पहले Gorudko एट अल द्वारा दिखाया गया है की ओर जाता है संयोजन में उपयोग किया जाता है।एस एस = "xref"> 28। वे एक 60% 10 मिमी MβCD द्वारा न्यूट्रोफिल में कोलेस्ट्रॉल की कमी का प्रदर्शन किया। साथ ही, sphingomyelin स्तर नहीं बल्कि कोलेस्ट्रॉल एस्टर की एक मामूली कमी न्यूट्रोफिल में पहचाने जा सकते जब MβCD के साथ इलाज किया था (देखें न्यूमन एट अल। 15)। इसी समय, कोलेस्ट्रॉल की कमी मच्छरदानी का गठन (न्यूमन एट अल देखें। 15) की ओर जाता है। ये खोजने घटना का अच्छा सहसंबंधी कि स्टैटिन के साथ न्यूट्रोफिल के उपचार, 3-हाइड्रोक्सी 3-methylglutaryl coenzyme एक के अवरोधक (HMG-CoA) रिडक्टेस, कोलेस्ट्रॉल जैवसंश्लेषण का दर सीमित एंजाइम, नेट के गठन को बढ़ा देता है। हालांकि, बाद से न्यूट्रोफिल की स्टैटिन उपचार MβCD उपचार की तुलना में मजबूत नेट प्रेरण दर्शाती है (देखें न्यूमन एट अल। 15 और चाउ एट अल। 20), स्टैटिन के अतिरिक्त प्रभाव prenylated झिल्ली लंगर प्रेरक prote पर जैसेइन भी जाल के गठन में शामिल हो सकता है।

जाल के गठन के एक अपेक्षाकृत उपन्यास में वर्णित मेजबान सुरक्षा तंत्र है। कोशिकी डीएनए फाइबर अब वर्णित किया गया है न केवल स्तनधारियों 30, 31 में, लेकिन यह भी चिकन, मछली, चिंराट, और पौधों 32, 33, 34, 35 में। रोगाणुओं या अन्य उत्तेजनाओं के साथ न्यूट्रोफिल की उत्तेजना होने पर, नेट बाह्य अंतरिक्ष, जहां वे फंसाने और संभवतः हमलावर रोगज़नक़ों 36 को मारने में जारी किया जाता। एक सक्रिय न्युट्रोफिल के लिपिड संरचना का अध्ययन इसके रोगाणुरोधी गतिविधि मध्यस्थता सेलुलर तंत्र को समझने में मदद कर सकते हैं। जब से हम न्यूट्रोफिल का केवल कुल लिपिड स्तर मापा जाता है, यह निर्धारित किया जा करने के लिए कैसे लिपिड सामग्री अलग रहता है और plas बनाम पूरे सेल में MβCD से प्रभावित होता हैमा झिल्ली और विभिन्न झिल्ली सूक्ष्म डोमेन के बीच में। बहरहाल, यह पहले से वर्णित के रूप में विशिष्ट झिल्ली जुदाई प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती (जू एट अल।)। 37

क्रोमेटिन इसके अलावा, मानव जाल इस तरह के MPO के रूप में कई न्युट्रोफिल प्रोटीन, शामिल हैं; इलास्टेज, रोगाणुरोधी पेप्टाइड डालूँगा-37; या 17, 36 calgranulin। हाल के शोध से उन विशिष्ट प्रोटीन और morphological परिवर्तन, जो आरंभ और जाल 15, 38, 39 के गठन की सुविधा की भूमिका पर काफी जोर दिया गया है। हालांकि, अब तक, वहाँ केवल कुछ लिपिडों के महत्व के बारे में ज्ञान के लिए इस प्रक्रिया 15, 20 के दौरान सीमित है। इसलिए, यह एक विशेष रूप से दिलचस्प क्षेत्र भविष्य में और अधिक विस्तार में पता लगाया जा रहा है। अंत में, लिपिड झिल्ली संशोधनों पर ज्ञानएक आधार के रूप में सेवा के लिए चिकित्सा दृष्टिकोणों को संक्रमण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रणाली को बढ़ावा देने के लिए कर सकता है। एक उदाहरण के रूप में, यह दिखाया गया था कि कोलेस्ट्रॉल की कमी इस तरह के एच पाइलोरी के रूप में एंटीबायोटिक प्रतिरोधी रोगज़नक़ों से लड़ने में मदद कर सकता है, क्योंकि यह प्रदर्शन किया गया है कि कोलेस्ट्रॉल एंटीबायोटिक दवाओं और रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स 40 के खिलाफ उन कीड़े के प्रतिरोध को बढ़ाता है। इसी तरह के अध्ययन विभिन्न बैक्टीरियल प्रजातियों के साथ मेजबान रोगज़नक़ बातचीत को समझने के लिए उपयोगी हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के एरियन न्यूमन के लिए प्रदान की पशु चिकित्सा, हनोवर, जर्मनी के विश्वविद्यालय, के Akademie फर Tiergesundheit (पीछे) और पीएचडी कार्यक्रम, से एक फैलोशिप के एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया "पशु और जूनोटिक संक्रमण,"।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG Invitrogen A-21070
Anti-MPOα antibody Dako A0398
BSA Sigma-Aldrich 3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber Celeromics MF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner Leica DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10x Sigma-Aldrich P5493-1L Dilute 1:10 in water for 1x working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed Thermo Fisher Scientific 35503
Excel Microsoft 2010
DNA/Histone 1 antibody Millipore MAB3864
ImageJ NIH 1.8 http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscope VWR 630-1554
Methyl-β-cyclodextrin Sigma-Aldrich C4555-1G
PFA Carl Roth 0335.3 dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution
PMA Sigma-Aldrich P8139-1MG Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Polymorphprep AXIS-SHIELD AN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Invitrogen P7581
RPMI1640 PAA E 15-848
HBSS with CaCl and Mg Sigma H6648
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ml
Trypanblue Invitrogen 15250-061 0.4% solution
Water Carl Roth 3255.1 endotoxin-free
Name Company Catalog Number  Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanol Sigma-Aldrich 33538
10 µL syringe Hamilton 701 NR 10 µl
Diethyl ether Sigma-Aldrich 346136
Ethyl acetate Carl Roth 7336.2
Canullla 26 G Braun 4657683
Copper(II)sulphatepentahydrate Merck 1027805000
Chloroform Carl Roth 7331.1
CP ATLAS software Lazarsoftware 2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column Merck 152022
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster Hitachi HITA 892-0080-30Y Paramaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV Detector Hitachi 5410
HPLC Column Oven Hitachi 5310
HPLC Auto Sampler Hitachi 5260
HPLC Pump Hitachi 5160
Methanol Carl Roth 7342.1
n-Hexane Carl Roth 7339.1
Phosphoric acid Sigma-Aldrich 30417
Potassium chloride Merck 49,361,000
Potters LAT Garbsen 5 ml
SDS Carl Roth CN30.3
HPTLC silica gel 60 Merck 105553
Vacufuge plus basic device Eppendorf 22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom Sigma CLS3548
Coverslip Thermo Fisher Scientific 1198882
Glass slide Carl Roth 1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 mL BD Bioscience 309659

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 121 न्यूट्रोफिल न्युट्रोफिल कोशिकी जाल (नेट) कोलेस्ट्रॉल मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD) उच्च निष्पादन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) उच्च निष्पादन पतली परत क्रोमैटोग्राफी (HPTLC)
विधियों का अध्ययन करने के लिए न्यूट्रोफिल में लिपिड बदलाव और न्युट्रोफिल कोशिकी जाल के बाद के गठन
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Brogden, G., Neumann, A., Husein, D. … More

Brogden, G., Neumann, A., Husein, D. M., Reuner, F., Naim, H. Y., von Köckritz-Blickwede, M. Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps. J. Vis. Exp. (121), e54667, doi:10.3791/54667 (2017).

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