Summary
Lipider är kända för att spela en viktig roll i cellfunktioner. Här beskriver vi en metod för att bestämma lipidkompositionen av neutrofiler, med betoning på kolesterolnivån, genom att använda både HPTLC och HPLC för att få en bättre förståelse för de underliggande mekanismerna för neutrofil extracellulär fälla bildning.
Abstract
Lipidanalys utförs genom högupplösande tunnskiktskromatografi (HPTLC) är en relativt enkel, kostnadseffektiv metod för att analysera ett brett spektrum av lipider. Funktionen av lipider (t ex i värd-patogen interaktioner eller värd post) har rapporterats spela en avgörande roll i cellulära processer. Här visar vi en metod för att bestämma lipidkomposition, med fokus på kolesterolnivån av primära blodhärledda neutrofiler, med HPTLC i jämförelse med högeffektiv vätskekromatografi (HPLC). Syftet var att undersöka rollen av lipid / kolesterol förändringar i bildningen av neutrofila extracellulära fällor (NET). NET frisättning är känd som en värdens försvar mekanism för att förhindra patogener från att sprida sig i värden. Därför togs blodhärledda humana neutrofiler behandlade med metyl-β-cyklodextrin (MβCD) för att inducera lipid förändringar i cellerna. Med användning av HPTLC och HPLC, har vi visat att MβCD behandling av cellerna leder till lipidändringar i samband med en betydande minskning av innehållet i cellen kolesterol. På samma gång, MβCD behandling av neutrofilerna ledde till bildandet av NET, såsom visas genom immunofluorescens-mikroskopi. Sammanfattningsvis, Här presenterar vi en detaljerad metod för att studera fett förändringar i neutrofiler och bildandet av nät.
Introduction
Lipider har visat sig spela en viktig roll i cell homeostas, celldöd, värd-patogen interaktioner och cytokinfrisättning 1. Med tiden har intresset för och kunskapen om effekterna av lipider i värd patogen interaktioner eller inflammation ökat och flera publikationer bekräftar den centrala roll som vissa lipider, särskilt steroid kolesterol, i cellulära svar. Farmakologisk behandling med statiner, vilka används som inhibitorer av kolesterolbiosyntes genom att blockera 3-hydroxi-3-metylglutaryl-coenzym-A-reduktas (HMG-CoA-reduktas), kan fungera som anti-inflammatoriska medel genom att sänka serumnivåerna av interleukin 6 och C-reaktivt protein 2. Kolesterol- och glykosfingolipid-berikade strukturer kan användas av flera patogener, såsom bakterier och virus, som en gateway i värden 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sfingolipider (t.ex. sfingomyelin) har visat sig kunna användas av patogener för att främja deras patogenicitet 7. I makrofager, mykobakterier användning kolesterolanrikad domäner för tränga in i cellerna; en utarmning av kolesterol hämmar mykobakteriell upptag 8. Vidare infektion av makrofager med Francisella tularensis, en zoonotisk medel som är ansvarigt för tularemi (även känd som kanin feber) 9, ledde till en infektion som avskaffades när kolesterol utarmades från membranen 10. På liknande sätt, var invasionen av värdceller av Escherichia coli via lipidrika strukturer visat sig vara kolesterolberoende 4. Dessutom, Salmonella typhimurium infektionsexperiment av epitelceller visade att kolesterol är väsentliga för patogen inträde in i cellerna 11. Kolesterol utarmning inhibited upptaget av Salmonella 11. Dessutom, en nyligen genomförd studie av Gilk et al. visade att kolesterol spelar en viktig roll i upptaget av Coxiella burnetti 12. Dessutom, Tuong et al. fann att 25-hydroxikolesterol spelar en avgörande roll i fagocytos av lipopolysackarid (LPS) -stimulerade makrofager 13. Fagocytos reducerades när makrofager farmakologiskt behandlas för att utarma kolesterol 14. Således, kolesterol och andra lipider verkar spela en viktig roll vid infektion och inflammation, eftersom deras utarmning kan minska risken för invasion från flera patogener 10, 11, 12.
Nyligen kunde vi visa att Lipidförändringarna, särskilt utarmning av kolesterol från cellen, framkalla bildandet av neutrofila extracellular fällor (NET) i humana blodhärledda neutrofiler 15. Sedan upptäckten av NET 2004, har de visat sig spela viktiga roller i bakterie entrapment, och därmed hindra smittspridning 16, 17. NET består av en DNA-huvudkedja associerad med histoner, proteaser och antimikrobiella peptider 16. Frisättningen av de nät av neutrofiler kan induceras av invaderande patogener 18, 19 och kemiska substanser såsom forbol-myristat-acetat (PMA) eller statiner 16, 20. Men de detaljerade cellulära mekanismer och i synnerhet rollen av lipider i denna process är ännu inte helt klart. Analysen av lipider kan leda till en bättre förståelse av de mekanismer som är involverade i en mängd olika cellulära processer och interaktioner, såsom frisättning av NET. Cholesterol och sfingomyelin är viktiga beståndsdelar i cellmembranet och lipida mikrodomäner, där de tillför stabilitet och underlättar klustring av de proteiner som är involverade i protein trafficking och signaleringshändelser 21. För att undersöka den mekanistiska rollen av vissa lipider, amfifila farmakologiska medel, såsom den cykliska oligosackarid metyl-β-cyklodextrin (MβCD), kan användas för att förändra lipidkompositionen av en cell och för att minska kolesterol in vitro 15. Här presenterar vi en metod för att använda HPTLC att analysera lipidkompositionen av neutrofiler som svar på MβCD. HPLC användes för att bekräfta nivån av kolesterol i neutrofila populationen. Vidare beskriver vi en metod för att visualisera bildningen av NET genom immunofluorescens-mikroskopi i humana blodhärledda neutrofiler som svar på MβCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Insamlingen av det perifera blodet i detta protokoll godkändes av den lokala mänskliga forskningsetiska provision. Alla försökspersoner under förutsättning att deras skriftligt informerat samtycke.
1. Isolering av humant blod-härledda Neutrofiler genom densitetsgradientcentrifugering
- Isolering av humana blodhärledda neutrofiler
- Skikt ~ 20 ml blod på 20 ml av natriumdiatrizoat / dextranlösning nära en låga och utan blandning.
- Centrifugera i 30 min vid 470 xg utan broms.
- Avlägsna mononukleära celler och den gulaktiga plasmaskiktet. Överföra polymorfonukleära celler (PMN) fas (andra fas med ackumulerande celler; figurerna 1 och 2) in i ett nytt 50 ml rör och fyll den upp till 50 ml med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Centrifugera i 10 min vid 470 xg med broms.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml sterilt vatten for 5 s för att lysera erytrocyterna.
- Omedelbart fylla upp till 50 ml med 1 x PBS och centrifugera i 10 min vid 470 x g.
- Avlägsna supernatanten. Pelleten ska vara vit. Om det fortfarande är röd, upprepa steg 1.1.5 och 1.1.6.
- Återsuspendera pelleten i 1000 mikroliter av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium. Räkna antalet celler med användning av trypanblått-färgning i en hemocytometer under ett ljusmikroskop.
- Framställa en cellsuspension i RPMI vid en koncentration av 2 x 10 6 / ml. Ca 2,5 x 10 7 neutrofiler kan skördas från 20 ml av blod.
- Farmakologisk behandling av neutrofiler för lipid analys
- Använda 5 x 10 7 celler från steg 1.1.9. Justera cellantalet i ren Hank's balanserade saltlösning (HBSS) medium i närvaro eller frånvaro av 10 mM MβCD eller 25 nM PMA i en total volym av 300 | il i en 1,5 ml reaktionsrör.
- Inkubera proverna ireaktionsrör för 2 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Centrifugera i 10 min vid 470 xg med broms.
- Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 300 mikroliter av HBSS.
- Centrifugera i 10 min vid 470 xg med broms.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml kloroform / metanol (1: 1), homogenisera den med en 26-G kanyl genom att suga av provet i och ut i en 1 ml spruta 10 gånger, och lagra proverna vid -20 ° C.
- Farmakologisk behandling av neutrofiler för NET kvantifiering av immunofluorescens
- Framställa poly-L-lysin-belagda 48-brunnars plattor med täckglas.
- Placera en 8-mm täckglas i varje brunn, tillsätt 55 | il av steril 0,01% Poly-L-lysin, och inkubera i ~ 20 min vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta två gånger med 200 | il av 1 x PBS. Lagra plattorna med 200 | il av 1 x PBS per brunn i kylskåp tills de behövs.
- Bilefully lägga 100 mikroliter av cellsuspension (2 x 10 5/100 | il) från steg 1.1.9 per brunn i centrum av varje täckglas.
- Tillsätt 100 pl per brunn av antingen den slutliga 10 mM MβCD eller den slutliga 25 nM PMA.
- Centrifugera i 5 minuter vid 370 X g med broms.
- Inkubera i 2 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Centrifugera i 5 minuter vid 370 X g med broms.
- Fixera cellerna med 155 mikroliter av 4% PFA, slå in dem i plastparaffinfilmen, och lagra dem över natten vid 4 ° C eller under 10 min vid RT.
OBS! Uppgifter om NET bildning inducerad av MβCD se Neumann et al. 15.
- Framställa poly-L-lysin-belagda 48-brunnars plattor med täckglas.
2. Lipid Isolering och analys av humana blodhärledda Neutrofiler
- Isolera lipiderna från humana perifera blodhärledda neutrofiler baserade på Bligh och Dyer 22 och Brogden et al. 23
- På is, pipett neutrofilerna (närvarande i metanol och kloroform lösning) till en 15 ml skruvkork glasrör med en polytetrafluoreten (PTFE) tätning och homogenisera dem genom skakning under 1 minut. Använda glasrör för att förhindra lipiderna från att binda till plastytor. Använd PTFE lock för att förhindra förorening av gummi / plast.
- Tillsätt 2 ml metanol följt en minut senare av en ml kloroform. Skaka igen under 1 min.
- Rotera glasrören vid RT och 50 varv per minut under 30 min.
- Pelleproteinfraktionen genom centrifugering av lösningen vid 7 ° C och 1952 xg under 10 min.
- Försiktigt dekantera supernatanten i en ny 15 mL glass skruvkapsylröret, lämnar proteininnehållande pelleten bakom. Lagra pelleten vid -20 ° C för framtida kvantifiering.
- Lägg 1 ml kloroform, vänta en minut, tillsätt 1 ml av dubbeldestillerat vatten, och invertera glasskruvkapsylröret med provet under 30 s.
- Om så erfordras, utför ett valfritt ytterligare reningssteg genom att upprepa steg 2.1.8.
- Torka proverna i en vakuum koncentrator vid 60 ° C och förvara dem vid -20 ° C tills de behövdes.
- Förbereda följande fyra löpande lösningar och färglösningen.
- Lösning 1: Blanda etylacetat (26,6%), en-propanol (26,6%), kloroform (26,6%), metanol (26,6%), och kaliumklorid (9,6%). Förbereda KCl genom upplösning 0,25 g KCl i 100 ml av HPLC-kvalitet vatten.
- Lösning 2: Blanda n-hexan (73%), dietyleter (23%), och citronsyra (2%).
- Lösning 3: 100% n-hexan.
- Förbereda färgningslösningen genomblanda destillerat vatten (90 ml) med 7,5 g kopparsulfat, och sedan lägga 10 ml av fosforsyra.
- Fyll upp till 5 mm av varje lösning i en separat glaskammare. Lägga någon form av filterpapper för att öka körhastigheten i varje kammare.
- Pre-inkubera en 20 x 10 cm HPTLC silikagel 60 glasplatta i den första rinnande lösningen tills driften lösningen når toppen av plattan. Sedan torka den för 10 min vid 110 ° C.
OBS: Dessa plattor kan lagras för framtida användning i aluminiumfolie och torkades under 10 min vid 110 ° C före användning. - Upplösa fettpellet erhållen från steg 2.1.10 i 200 mikroliter av kloroform / metanol (1: 1) lösning och inkubera under 15 min vid 37 ° C för upplösning.
- Använd en linjal och en mjuk penna för att markera last platser för önskat antal prover, plus åtminstone en standard. Märket körsträckan vid ca 4 cm och 6 cm för den första och andra rinnande lösning, respektive.
- Att ladda proverna, tvätta 10 mikroliter sprutan 3 gånger i kloroform / metanol (1: 1) före laddning varje nytt sampel. Belastning 10 mikroliter av varje prov droppvis, försöker koncentrera provet på så liten yta som möjligt. Prover ska laddas åtminstone dubbletter.
- Placera plattan vertikalt i den första kammaren med rinnande lösning 1 (steg 2.2.1.1). Se till att plattan är parallell med väggen av glaskammaren för att uppnå en enhetlig migrationshastighet.
- När lösningsmedlet linje har nått det första märket, ta bort plattan, torka den, och placera den i den andra lösningen. Upprepa liknande steg för den andra och för den tredje driftslösningar; lämna plattan i lösningen tills lösningens front når toppen av plattan, ta sedan bort och torka den vid rumstemperatur under 1 min.
- Placera plattan i kopparsulfatlösning under 7 s. Ta bort plattan, torka den grundligt, och grädda den i en ugn under 7 min vid 170 ° C. Vänta plattan svalna.
- Using ett tunnskiktskromatografi och gelanalys programvara, såväl som en bildbehandlingsprogram, skanna och analysera som tidigare beskrivits av Brogden et al. 23.
- Bifoga en 100 x 4,6 mm kolonn till en mm skyddspatron 5 pm / 4,6 och värm till 32 ° C. Använda metanol som mobil fas vid en flödeshastighet av 1 ml / min vid 65 bar och en UV-detektor mätning vid 202 nm för att kvantifiera mängden kolesterol i varje prov.
- Tvätta HPLC maskinen noggrant före analysering av prover, utföra följande steg: rengöring av pumpen, tvättning av nålen, sköljning potten, spolning sprutan, och tvättning av pumpspolning. Tvätta alla med vatten. Slutligen utföra en systemrensning med metanol vid en flödeshastighet av 5 ml / min under 5 min.
- Att etablera en kolesterolstandardkurva, förbereda minst 4 koncentrationer varierandefrån 0,05 mg / ml till 2 mg / ml av kolesterol i kloroform / metanol (1: 1) 24.
- Resuspendera prover erhållna från steg 2.1.10 i 500 mikroliter av kloroform / metanol (1: 1) i bärnstensfärgad 1,5 ml glasflaskor med skruvlock röd PTFE / vit silikon lock.
- Kvantifiera kolesterolkoncentrationer med användning av standard framställts i steg 2.3.3.
OBS: Fyll i provtagningsprotokoll, som börjar med minst en standard och en negativ kontroll, följt av proverna. - Uttryck resultaten som området under kurvan och jämföra mellan lämpliga prover använder någon statistisk programvara.
OBS: Resultaten kan också kvantifieras mot en standardkurva och kan visas som den totala kolesterol belopp per ml, g, eller antalet celler. Standardkurvan ekvationen bör beräknas med hjälp av de värden som erhållits i steg 2.3.3.
3. Visualisering och kvantifiering av NET
- Visualization av NET
OBS: visualisering av NET bygger på tidigare publicerade arbete av Neumann et al. 15.- Tvätta de fasta proverna från steg 1.3.8 tre gånger med 200 | il av 1 x PBS.
- Blocket och permeabilisera med 100 mikroliter av 2% BSA, 0,2% Triton X-100 i PBS per brunn under 45 min vid RT.
- Lägga 100 mikroliter av primära antikroppar: mus-monoklonal anti-DNA-histon 1-antikropp (späd lager med 2,2 mg / ml 1: 5000 i PBS innehållande 2% BSA och 0,2% Triton X-100) eller polyklonal antikropp mot myeloperoxidas (MPO; kanin-anti-MPO; späd 1: 300 i PBS innehållande 2% BSA och 0,2% Triton X-100). Inkubera över natten vid 4 ° C.
- Tvätta 3 gånger med 200 | il av 1 x PBS.
- Lägga 100 mikroliter av den sekundära antikroppen (fluorescens-märkt get-anti-mus; 1: 1000 i BSA-PBS-Triton X-100 och get-anti-kanin; 1: 1000 BSA-PBS-Triton X-100) under 1 h vid RT i mörker.
- Tvätta 3 gånger med 200 & #181; L av 1 x PBS.
- Ta bort täck använder pincett och placera dem nedåt med 3 mikroliter av monteringsmedium som innehåller DAPI på objektglas.
- Undersöka proverna med användning av ett konfokalt inverterad-bas fluorescensmikroskop utrustat med en HCX PL APO 40X 0,75-1,25 oljeimmersion mål 15.
- Kvantifiering av NET-frisättande kärnorna
- Öppna en bildbehandlingsprogram (t.ex. ImageJ) och dra och släpp bild av intresse i verktygsfältet.
- Klicka på "Plugins", "analysera" och "Cell disk."
- Tryck på "Initiera" -knappen i räknaren fönstret och välj en räknare typ (t.ex. klicka på 7 i rött för NET-frisättande celler och 8 i gult för icke-frisättande celler, såsom visas i fig 6B-i och ii).
OBS: Kriterierna för NET-positiva celler: Positivt färgade grön kärna + en mindre tät nucleus (förlust av lobformighet) eller en förlust av den runda formen av kärnan + en ökad storlek av kärnan, eller en förekomst av en distinkt extracellulär off-shoot. - Klicka varje cell som vidhäftar till ovanstående kriterier och skriver det räknade antalet celler i ett datablad för en analysprogram.
- Beräkna den procentuella NET-frisättande celler med användning de räknade cellantal av NET-frisättande och icke-frisättande celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Humana blodhärledda neutrofiler isolerades genom densitetsgradientcentrifugering (Figur 2). Att undersöka effekten av lipid förändringar på neutrofiler, behandlades cellerna med 10 mM MβCD, vilket utarmar kolesterol från cellen. Därefter överfördes lipiderna isolerats från proverna genom Bligh och Dyer (figur 1, vänster panel), såsom beskrivs av Brogden et al. 23. De framställda lipid Proverna laddades på silikagelplattor HPTLC plattor och körning med användning av en tre-lösning-protokollet, som har optimerats för att separera och visualisera ett brett spektrum av lipider, däribland kolesterol, kolesterolestrar, sfingomyelin, fosfolipider, och triacylglycerider, fria fettsyror , monoacylglycerol, fosfatidyletanolamin, kardiolipin, fosfatidylserin, och fosfatidylkolin (figur 3A). Oxygene derivat av kolesterol (oxysteroler) är inte detekterbar wed denna metod. En ytterligare kvantitativ analys av kolesterol utfördes med användning av HPLC (figur 3B). Regressions värde för kolesterol var markant bättre vid användning av HPLC (figur 4A) jämfört med HPTLC (Figur 4B). Att visualisera NET, stimulerades cellerna med de ovan nämnda stimuli, fixerades och färgades för DNA / histon 1 (grön), MPO (röd), och DNA (blå) som typiska NET markörer (Figur 5A). Såsom visas i figur 5A, en tydlig förekomst av MPO, DNA / histon 1, och DNA sker i NET när cellerna behandlades med 10 mM MβCD för 2 h. Därefter effekten av kolesterolreduktion rades mikroskopiskt analyseras. Därför färgades celler för DNA (blå) och DNA / histon 1 (grön), och NET-frisättande kärnorna räknades med användning av cellräknaren plugin från bildbehandlingsprogram ImageJ (figur 5B). Obehandlade neutrofiler fungerade som en kontroll för spontaneous NET bildning (figur 5B-i). I den visade figuren, NET frisättning i obehandlade neutrofiler efter 2 h inkubation var 3,89%, medan behandling av cellerna med 10 mM MβCD resulterade i 35,17% NET bildning (figur 5B).
Figur 1: Schematisk visning de steg som ingår vid bestämning av lipidkomposition och extracellulär fälla frisättning från humana blodhärledda neutrofiler. Neutrofiler isolerades med användning av en densitetsgradient och behandlades med metyl-β-cyklodextrin (MβCD) för att inducera lipid förändringar och NET bildning. Därefter lipider isoleras och analyseras genom användning av antingen HPTLC eller HPLC, och NET visualiseras och kvantifieras genom immunofluorescens.
Figur 3: HPTLC och HPLC-analys av lipider isolerade från neutrofiler. (A) Standard som används för att identifiera de lipider som föreligger i neutrofiler via HPTLC (vänster körfält). CE: kolesterol estrar, TG: triacylglycerider, FFA gratis: fettsyror, Chol: kolesterol, MG: monoacylglycerol, PE: fosfatidyletanolamin, CL: kardiolipin PS: fosfatidylserin, PC: fosfatidylkolin och SM: sfingomyelin. (B) Representativa resultat som visar en kolesterol specifik topp för 2 mg / ml vid 4,980 min med användning av HPLC-protokoll som beskrivs här.
Figur 4: HPLC och HPTLC-analyser av kolesterol. Diagram som visar förhållandet mellan kolesterolkoncentrationen och området, mätt med HPLC (A), och bandintensitet, mätt med HPTLC (B). Den lägsta detektionsgränsen för HPLC var 0,0016 mg / ml, med en regressions värde för standardkurvan av 0,998 N = 3, SEM (A). Kolesterol som sträcker sig från 2 mg / ml ned till 0,05 mg / ml kan vara semi-kvantifieras med hjälp av HPTLC (B), med en minimidetektionsgräns på 0,05 mg / ml N = 3, SEM. Regressions värdet för HPTLC standardkurvan är 0,918.
Figur 5: representativa fluorescensmikrofotografier visar NET strukturer och subseqödet NET kvantifiering. (A) Neutrofiler stimulerades med 10 mM MβCD under 2 h färgades för (ii) MPO (röd), (iii) DNA / histon 1 (grön), och (iv) DNA (blått). (I) överlagring av (ii), (iii) och (iv). (B) Cellerna inkuberades under 2 h med (i) HBSS-medium eller (ii) 10 mM MβCD, och frisatta NET färgades för kärnor (blå) och DNA / histon 1 (grön). NET-negativa kärnor märkta med räknaren 8 (gul) och NET-positiva kärnor med räknaren 7 (röd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs här kan användas för att analysera specifika lipider, såsom kolesterol, genom HPTLC eller HPLC och för att undersöka effekterna av farmakologiska Lipidförändringarna på bildandet av NET (se et al. Neumann 15).
HPTLC är en relativt kostnadseffektiv och enkel metod för att analysera ett brett spektrum av lipider i ett stort antal prover. Denna metod har använts i många forskningsområden, inklusive antibiotikum kvantifiering 25, lipid lagring i lysosomala lagringssjukdomar 26, och bestämningen av kolesterol och cholesterylglucoside nivåer i epitelceller 27. Den här beskrivna metoden modifierades och optimerats för att isolera lipider från en renad neutrofil population; emellertid, kan en något modifierad version också användas för att isolera lipider från vävnadsprover (se Brogden et al. 23). Med hjälp av denna träffadehod, lipider kan också effektivt separeras, identifieras, och semi-kvantifieras mot en känd standard. Ett kritiskt steg i denna metod är användningen av den respektive namngivna buffert, eftersom användningen av någon annan buffert eller medium kan leda till lipid förorening och ospecifika lipid band i proven. Eftersom känsligheten är begränsad med HPTLC, bör HPLC användas som en mer noggrann metod för absolut kvantifiering.
HPLC underlättar kvantifiering och identifiering av kolesterol och dess olika former eller derivat genom att utföra en jämförelse med en känd lipid. Genom att använda det protokoll som beskrivs ovan, är det möjligt att tillförlitligt kvantifiera ner till 0,0016 mg / ml kolesterol (figur 4A), med en linjär förhållande upp till 10 mg / ml (R = 0,990). HPTLC metod möjliggör kolesterol detektering ned till 0,05 mg / ml, men med en sigmoid kurva och en lägre korrelationskoefficient på R = 0,906 (figur 4B). Den högre känslighet och högre korrelation koefficient gör det således HPLC en mycket överlägsen metod för exakt kvantifiering av lipider, som därefter möjliggör mindre skillnader mellan proverna som skall detekteras. Emellertid kan båda metoderna användas i kombination; HPTLC kan användas för att få en överblick i vilket lipider kan ändras, och HPLC kan användas på ett mer riktat tillvägagångssätt för att kvantifiera skillnaden av en specifik lipid i ett givet prov. När man jämför våra mätningar med de värden som erhålls av andra 28, 29, var mindre kolesterol kvantifieras i totala neutrofiler. Detta kan förklaras av den metod som används. Andra studier använde en fluorimetrisk detektering, som är baserad på en enzymkopplad reaktion som detekterar både fritt kolesterol och cholesterylesters.
Här, HPTLC och HPLC används i kombination för att verifiera att MβCD leder till en betydande minskning av kolesterol som tidigare också visas av Gorudko et al.ss = "xref"> 28. De visade en minskning 60% av kolesterol i neutrofiler genom 10 mM MβCD. Dessutom kan en liten minskning av sfingomyelin nivå men inte kolesterolestrar var detekterbart i neutrofilerna vid behandling med MβCD (se et al. Neumann 15). På samma gång, utarmning av kolesterol leder till bildning av NET (se Neumann et al. 15). Dessa finna korrelerar väl med fenomenet att behandling av neutrofiler med statiner, hämmare av 3-hydroxi 3-metylglutaryl coenzym A (HMG-CoA) reduktas, det hastighetsbegränsande enzymet vid kolesterolbiosyntes, ökar bildningen av NET. Eftersom statinbehandling av neutrofiler uppvisar starkare NET induktion jämfört med MβCD behandling (se et al. Neumann 15 och Chow et al. 20), ytterligare effekter av statiner t.ex. på prenylerad membranförankrat effektor proteins kan också vara involverad i bildandet av nät.
Bildandet av NET är en relativt ny beskrivna värdförsvarsmekanismen. De extracellulära DNA-fibrer har nu beskrivits inte bara i däggdjur 30, 31, men också i kyckling, fisk, räkor, och växter 32, 33, 34, 35. Vid stimulering av neutrofiler med patogener eller andra stimuli, är NET släpps ut i det extracellulära utrymmet där de snärja och döda eventuellt invaderande patogener 36. Studerar lipidkompositionen av en aktiverad neutrofil kan hjälpa till att förstå de cellulära mekanismer som förmedlar dess antimikrobiella aktivitet. Eftersom vi mätte endast den totala lipid nivån på neutrofiler, återstår det att bestämma hur fetthalten varierar och påverkas av MβCD helt cell kontra plasma membran och mellan olika membranmikrodomäner. Detta kräver dock specifika membranseparationsförfaranden såsom tidigare beskrivits (Xu et al.). 37
Förutom kromatin, humana NET innehålla flera neutrofila proteiner, såsom MPO; elastas, den antimikrobiella peptiden LL-37; eller kalgranulin 17, 36. Senare forskning har fokuserat mycket på den roll som dessa specifika proteiner och morfologiska förändringar, som initierar och underlättar bildningen av NET 15, 38, 39. Men än så länge finns det bara begränsad kunskap om vikten av vissa lipider under denna process 15, 20. Därför är detta ett särskilt intressant område som ska undersökas närmare i framtiden. Slutligen kunskap om lipid membran ändringarkan ligga till grund för terapeutiska metoder för att stärka immunförsvaret mot infektioner. Som ett exempel, visades det att utarmning av kolesterol kan hjälpa i kampen mot antibiotikaresistenta patogener såsom H. pylori, eftersom det visades att kolesterol förbättrar motståndet hos dessa fel mot antibiotika och antimikrobiella peptider 40. Liknande studier kan vara till hjälp för att förstå värd patogen interaktioner med olika bakteriearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett stipendium på Akademie für Tiergesundheit (Aid for Trade) och ett stipendium från forskarutbildningen, "Animal och zoonotiska infektioner" vid University of Veterinary Medicine, Hannover, Tyskland, under förutsättning att Ariane Neumann.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
