Summary
Lipides sont connus pour jouer un rôle important dans les fonctions cellulaires. Nous décrivons ici une méthode pour déterminer la composition lipidique des neutrophiles, en mettant l'accent sur le taux de cholestérol, en utilisant à la fois HPTLC et HPLC pour obtenir une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents de la formation de piège extracellulaire neutrophile.
Abstract
l'analyse des lipides effectuée par chromatographie sur couche mince haute performance (CCMHP) est une méthode relativement simple et rentable de l'analyse d'une large gamme de lipides. La fonction des lipides (par exemple, dans les interactions hôte-pathogène ou l' entrée hôte) a été signalé à jouer un rôle crucial dans les processus cellulaires. Ici, nous montrons une méthode pour déterminer la composition des lipides, en mettant l'accent sur le taux de cholestérol des neutrophiles primaires dérivés du sang, par HPTLC en comparaison à une Chromatographie liquide à haute performance (HPLC). L'objectif était d'étudier le rôle des altérations des lipides / cholestérol dans la formation de pièges extracellulaires polynucléaires neutrophiles (TNE). libération NET est connu comme un mécanisme de défense de l'hôte pour empêcher les agents pathogènes de se propager à l'intérieur de l'hôte. Par conséquent, les neutrophiles humains dérivés du sang ont été traités avec du méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) pour induire des altérations lipidiques dans les cellules. En utilisant HPTLC et HPLC, nous avons montré que le traitement MβCD des cellules conduit à des lipidesles modifications associées à une réduction significative de la teneur en cholestérol de la cellule. En même temps, le traitement MβCD des neutrophiles a conduit à la formation de TNE, comme le montre la microscopie immunofluorescence. En résumé, nous présentons ici une méthode détaillée pour étudier les modifications lipidiques dans les neutrophiles et la formation de TNE.
Introduction
Lipids ont été montré à jouer un rôle important dans l' homéostasie cellulaire, la mort cellulaire, les interactions hôte-pathogène et la libération de cytokines 1. Au fil du temps, l'intérêt et les connaissances sur l'impact des lipides dans les interactions hôte-pathogène ou l'inflammation ont augmenté, et plusieurs publications confirment le rôle central de certains lipides, en particulier le cholestérol des stéroïdes, dans les réponses cellulaires. Le traitement pharmacologique avec des statines, qui sont utilisés comme inhibiteurs de la biosynthèse du cholestérol en bloquant 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme-A-réductase (HMG-CoA-réductase), peut agir comme agents anti-inflammatoires en abaissant les taux sériques d'interleukine 6 et de la protéine C-réactive 2. Cholesterol et de structures enrichi glycosphingolipides peuvent être utilisés par plusieurs agents pathogènes tels que des bactéries et des virus, comme une passerelle vers l'hôte 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sphingolipides (par exemple, sphingomyéline) ont été montrées à utiliser par des agents pathogènes pour favoriser leur pathogénicité 7. Dans les macrophages, l'utilisation des mycobactéries domaines enrichi en cholestérol pour pénétrer dans les cellules; une diminution du cholestérol inhibe l' absorption de mycobactéries 8. En outre, l' infection des macrophages avec Francisella tularensis, un agent zoonotique responsable de la tularémie (également connu sous le nom de fièvre de lapin) 9, a conduit à une infection qui a été aboli lorsque le cholestérol a été appauvri des membranes 10. De même, l'invasion de cellules hôtes de Escherichia coli par l' intermédiaire de structures riches en lipides a été démontrée comme dépendante de cholestérol 4. De plus, Salmonella expériences d'infection typhimurium des cellules épithéliales ont montré que le cholestérol est essentiel pour l' entrée des agents pathogènes dans les cellules 11. épuisement du cholestérol inhibited l'absorption de Salmonella 11. De plus, une étude récente de Gilk et al. a démontré que le cholestérol joue un rôle important dans l'adoption de Coxiella burnetii 12. De plus, Tuong et al. a révélé que 25 hydroxycholestérol joue un rôle crucial dans la phagocytose par lipopolysaccharide (LPS) 13 macrophages stimulées. Phagocytose a été réduite lorsque les macrophages ont été traités sur le plan pharmacologique pour appauvrir le cholestérol 14. , Semblent cholestérol et d' autres lipides ainsi jouer un rôle important dans l' infection et l' inflammation, car leur épuisement peut réduire le risque d'invasion de plusieurs agents pathogènes 10, 11, 12.
Récemment, nous avons pu montrer que les altérations lipidiques, en particulier l'épuisement du cholestérol de la cellule, induire la formation de neutrophile milieu extracellulairepièges r (TNE) dans les neutrophiles du sang d'origine humaine 15. Depuis la découverte de TNE en 2004, ils ont démontré qu'ils jouent un rôle essentiel dans le piégeage des bactéries, et donc à entraver la propagation de l' infection 16, 17. TNE sont constitués d'un squelette d'ADN associée à des histones, des protéases, et des peptides antimicrobiens 16. La libération des EVF par des neutrophiles peut être induite par des agents pathogènes envahissant 18, 19 et des substances chimiques telles que le phorbol-myristate-acétate (PMA) ou les statines 16, 20. Cependant, les mécanismes cellulaires détaillés, et en particulier le rôle des lipides dans ce processus, ne sont pas encore tout à fait clair. L'analyse des lipides peut conduire à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans une grande variété de processus cellulaires et les interactions, telles que la libération de TNE. CholesteROL et sphingomyéline sont des constituants essentiels des membranes cellulaires et des lipides, microdomaines où ils ajoutent la stabilité et facilitent le regroupement des protéines impliquées dans le trafic des protéines et des événements de signalisation 21. Pour étudier le rôle mécanique de certains lipides amphiphiles, des agents pharmacologiques, tels que la méthyl-β-cyclodextrine oligosaccharide cyclique (MβCD), peut être utilisé pour modifier la composition lipidique d'une cellule et pour réduire le cholestérol in vitro 15. Nous présentons ici une méthode pour utiliser HPTLC pour analyser la composition lipidique des neutrophiles en réponse à MβCD. HPLC a été utilisé pour confirmer le taux de cholestérol dans la population neutrophile. De plus, nous décrivons une méthode pour visualiser la formation de TNE par microscopie immunofluorescence dans les neutrophiles dérivés du sang humain en réponse à MβCD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La collection du sang périphérique dans ce protocole a été approuvé par la commission d'éthique de la recherche humaine locale. Tous les sujets humains ont donné leur consentement éclairé.
1. Isolement du sang Neutrophiles dérivés humain par gradient de densité Centrifugation
- Isolement des neutrophiles dérivés du sang humain
- Couche ~ 20 ml de sang sur 20 ml de diatrizoate de sodium / solution de dextrane à proximité d'une flamme et sans mélange.
- Centrifuger pendant 30 min à 470 sans frein xg.
- Retirer les cellules mononucléaires et la couche de plasma jaunâtre. Transférer la phase cellules polymorphonucléaires (PMN) (deuxième phase avec des cellules d' accumulation; les figures 1 et 2) dans un nouveau tube de 50 ml et de le remplir jusqu'à 50 ml avec une solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS).
- Centrifuger pendant 10 minutes à 470 xg avec frein.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml d'eau stérile for 5 s pour lyser les erythrocytes.
- Immédiatement remplir jusqu'à 50 mL avec 1 x PBS et centrifuger pendant 10 min à 470 x g.
- Retirer le surnageant. Le culot doit être blanc. Si elle est toujours rouge, répétez les étapes 1.1.5 et 1.1.6.
- Remettre en suspension le culot dans 1000 pi de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) de moyenne. Comptez le nombre de cellules en utilisant une coloration au bleu trypan dans un hémocytomètre sous un microscope optique.
- Préparer une suspension cellulaire dans du milieu RPMI à une concentration de 2 x 10 6 / ml. Environ 2,5 x 10 7 cellules neutrophiles peuvent être récoltées à partir de 20 ml de sang.
- Le traitement pharmacologique des neutrophiles pour l' analyse des lipides
- Utiliser 5 x 10 7 cellules de l' étape 1.1.9. Ajuster le nombre de cellules en milieu pur Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) en présence ou en l'absence de 10 mM MβCD ou 25 nM de PMA dans un volume total de 300 pi dans un tube réactionnel de 1,5 ml.
- Incuber les échantillons dans lades tubes de réaction pendant 2 h à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Centrifuger pendant 10 minutes à 470 xg avec frein.
- Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 300 pi de HBSS.
- Centrifuger pendant 10 minutes à 470 xg avec frein.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de chloroforme / méthanol (1: 1), homogénéiser avec une canule 26-G en aspirant l'échantillon dans et hors d'une seringue de 1 ml de 10 fois, et stocker les échantillons à -20 ° C.
- Le traitement pharmacologique des neutrophiles pour la quantification NET par immunofluorescence
- Préparer poly-L-Lysine-revêtu des plaques à 48 puits avec des lamelles de verre.
- Placer une lamelle de verre de 8 mm dans chaque puits, ajouter 55 ul de solution stérile à 0,01% de poly-L-Lysine, et incuber pendant ~ 20 min à température ambiante (RT).
- Laver deux fois avec 200 ul de 1 x PBS. Conserver les plaques avec 200 pi de PBS 1x par puits dans un réfrigérateur jusqu'au moment.
- Voitureefully ajouter 100 ul de suspension cellulaire (2 x 10 5/100 ul) provenant de l' étape 1.1.9 par puits dans le centre de chaque lamelle.
- Ajouter 100 pi par puits soit 10 mM finale MβCD ou PMA 25 nM finale.
- Centrifuger pendant 5 minutes à 370 xg avec frein.
- Incuber pendant 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Centrifuger pendant 5 minutes à 370 xg avec frein.
- Fixer les cellules avec 155 pl de 4% de PFA, les envelopper dans un film de paraffine plastique, et de les stocker pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 10 min à température ambiante.
NOTE: Pour les données sur la formation NET induite par MβCD, voir Neumann et al. 15.
- Préparer poly-L-Lysine-revêtu des plaques à 48 puits avec des lamelles de verre.
2. Isolement et analyse de Lipid des neutrophiles dérivés du sang humain
- Isoler les lipides à partir des neutrophiles dérivé du sang périphérique humain en fonction de Bligh et Dyer et 22 Brogden et al. 23
- Sur de la glace, une pipette les neutrophiles (présents dans du methanol et une solution de chloroforme) pour un tube de verre à bouchon à vis de 15 ml avec un joint d'étanchéité en polytétrafluoroéthylène (PTFE) et de les homogénéiser par agitation par secousses pendant 1 min. Utiliser des tubes en verre pour empêcher les lipides de se lier à des surfaces plastiques. Utilisation bouchons en PTFE pour empêcher la contamination de caoutchouc / plastique.
- Ajouter 2 ml de méthanol, puis 1 min plus tard par 1 ml de chloroforme. Bien agiter à nouveau pendant 1 min.
- Faire tourner les tubes en verre à la température ambiante et 50 tours par minute pendant 30 min.
- Pellet la fraction protéique par centrifugation de la solution à 7 ° C et 1 952 xg pendant 10 min.
- Soigneusement décanter le surnageant dans un nouveau tube de 15 ml à bouchon à vis en verre, en laissant le culot contenant des protéines derrière. Conservez le culot à -20 ° C pour la quantification future.
- Ajouter 1 ml de chloroforme, attendez 1 min, ajouter 1 ml d'eau bidistillée, et inverser le tube-bouchon à vis en verre avec l'échantillon pendant 30 s.
- Si nécessaire, effectuer une option autre étape de purification en répétant l'étape 2.1.8.
- Sécher les échantillons dans un concentrateur sous vide à 60 ° C et de les stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Préparer les quatre solutions de fonctionnement suivantes et solution de coloration.
- Solution 1: Mélanger l'acétate d'éthyle (26,6%), de 1-propanol (26,6%), du chloroforme (26,6%), de methanol (26,6%), et du chlorure de potassium (9,6%). Préparer KCl en dissolvant 0,25 g de KCl dans 100 mL d'eau de qualité HPLC.
- Solution 2: Mélanger le n-hexane (73%), de l'éther de diéthyle (23%), et d'acide citrique (2%).
- Solution 3: 100% de n-hexane.
- Préparer la solution de coloration parmélanger de l'eau distillée (90 ml) avec 7,5 g de sulfate de cuivre, puis ajouter 10 ml d'acide phosphorique.
- Remplir jusqu'à 5 mm de chaque solution dans une chambre de verre séparée. Ajouter tout type de papier filtre pour augmenter la vitesse de défilement dans chaque chambre.
- Pré-incuber 20 x 10 cm de gel de silice HPTLC 60 plaque de verre dans la première solution en cours d'exécution jusqu'à ce que la solution en cours d'exécution atteint le sommet de la plaque. Puis le sécher pendant 10 minutes à 110 ° C.
REMARQUE: Ces plaques peuvent être stockées pour une utilisation future dans une feuille d'aluminium et on les sèche pendant 10 minutes à 110 ° C avant utilisation. - On dissout le culot de lipide obtenue à l'étape 01.02.10 dans 200 ul de chloroforme / méthanol (1: 1) solution et incuber pendant 15 min à 37 ° C pour dissoudre.
- Utiliser une règle et un marqueur pour indiquer les points de chargement pour le nombre désiré d'échantillons, plus au moins un standard. Sélectionnez la distance de déplacement à environ 4 cm et 6 cm pour la première et la deuxième solution en cours d'exécution, respectivement.
- Pour charger les échantillons, laver la seringue de 10 ul 3 fois dans du chloroforme / méthanol: avant de charger chaque nouvel échantillon (1 1). Charge 10 pi de chaque goutte à goutte échantillon, en essayant de se concentrer sur l'échantillon une zone aussi petite que possible. Les échantillons doivent être chargés au moins en double.
- Placer la plaque verticalement dans la première chambre avec une solution courante 1 (étape 2.2.1.1). Assurez-vous que la plaque est parallèle à la paroi de la chambre de verre pour obtenir une vitesse de migration uniforme.
- Une fois que la ligne de solvant a atteint la première marque, retirer la plaque, la sécher et la placer dans la deuxième solution. Répétez les étapes similaires pour le deuxième et troisième pour les solutions en cours d'exécution; laisser la plaque dans la solution jusqu'à ce que le front de solvant atteigne le haut de la plaque, puis retirer et le sécher à température ambiante pendant 1 min.
- Placer la plaque dans une solution de sulfate de cuivre pour 7 s. Retirer la plaque, le sécher à fond, et le faire cuire dans un four pendant 7 min à 170 ° C. Attendre que la plaque se refroidir.
- USIng une Chromatographie en couche mince et un logiciel d'analyse de gel, ainsi que d' un logiciel de traitement d'image, numériser et analyser comme décrit précédemment par Brogden et al. 23.
- Attacher une colonne de 100 x 4,6 mm pour une cartouche de garde 5 um / 4,6 mm et on chauffe à 32 ° C. Utiliser le methanol comme phase mobile à un débit de 1 mL / min à 65 bars et à une mesure de détecteur UV à 202 nm pour quantifier la quantité de cholestérol dans chaque échantillon.
- Laver la machine de HPLC avec soin avant l'analyse des échantillons, d'effectuer les étapes suivantes: nettoyage de la pompe, le lavage de l'aiguille, le rinçage du pot, la purge de la seringue, et le lavage de la purge de la pompe. Laver tous avec de l'eau. Enfin, effectuer une purge du système avec du methanol à un débit de 5 ml / min pendant 5 min.
- Pour établir une courbe étalon de cholestérol, préparer au moins 4 concentrations allantde 0,05 mg / ml à 2 mg / ml de cholestérol dans du chloroforme / méthanol (1: 1) 24.
- Remettre en suspension les échantillons obtenus à partir de l'étape 02.01.10 dans 500 ul de chloroforme / méthanol (1: 1) en couleur ambre bouteilles en verre de 1,5 ml avec bouchon à vis en PTFE / couvercles de silicone blanc rouge.
- Quantifier les concentrations de cholestérol en utilisant le standard préparé à l'étape 2.3.3.
REMARQUE: Remplir le protocole d'échantillonnage, à partir d'au moins un type et un contrôle négatif, puis les échantillons. - Exprimer les résultats de la zone sous la courbe et de comparer entre les échantillons appropriés en utilisant un logiciel statistique.
REMARQUE: Les résultats peuvent également être quantifiés contre une courbe standard et peut être présentée comme la quantité de cholestérol total par ml, g, ou le nombre de cellules. L'équation de la courbe d'étalonnage doit être calculé en utilisant les valeurs obtenues dans l'étape 2.3.3.
3. Visualisation et quantification des TNE
- visualization NTE
REMARQUE: est basé sur les travaux précédemment publiés par Neumann et al La visualisation de TNE. 15.- Laver les échantillons fixés dans l'étape 1.3.8 3 fois avec 200 ul de 1 x PBS.
- Block et perméabiliser avec 100 uL de 2% de BSA, 0,2% de Triton X-100 dans du PBS par puits pendant 45 minutes à température ambiante.
- Ajouter 100 ul d'anticorps primaires: l'anti ADN-histone 1-anticorps monoclonal de souris (dilué le bouillon avec 2,2 mg / mL 1: 5000 dans du PBS contenant 2% de BSA et 0,2% de Triton X-100) ou un anticorps polyclonal contre la myéloperoxydase (MPO; de lapin anti-MPO; diluer 1: 300 dans du PBS contenant 2% de BSA et 0,2% de Triton X-100). Incuber pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver 3 fois avec 200 ul de PBS 1x.
- Ajouter 100 ul de l'anticorps secondaire (chèvre anti-souris marqué par fluorescence; 1: 1000 dans BSA-PBS-Triton X-100 et de chèvre anti-lapin, 1: 1000 BSA-PBS-Triton X-100) pendant 1 h à RT dans l'obscurité.
- Laver 3 fois avec 200 & #181; L de PBS 1x.
- Retirer les lamelles en utilisant des pinces et les placer face vers le bas avec 3 pi de milieu de montage contenant DAPI sur des lames de verre.
- Examiner les échantillons en utilisant un microscope confocal à fluorescence à base inversé équipé d'un objectif à immersion d'huile HCX PL APO 40X 0,75-1,25 15.
- Quantification des noyaux de libération NET
- Ouvrez un logiciel de traitement d'image (par exemple, ImageJ) et glisser-déposer l' image d'intérêt dans la barre d'outils.
- Cliquez sur "Plugins", "Analyze," et "contre Cell".
- Appuyez sur le bouton « Initialiser » dans la fenêtre du compteur et choisissez un type de compteur (par exemple, cliquez sur 7 en rouge pour les cellules NET libération et 8 en jaune pour les cellules non-libération, comme indiqué dans la figure 6B-i et ii).
NOTE: Les critères pour les cellules NET positif: noyau vert teinté + un Positivement nucleu moins denses (perte de lobulation) ou une perte de la forme ronde du noyau + une augmentation de la taille du noyau, ou une occurrence d'un extracellulaire distinct rejeton. - Cliquez adhérait cellulaire aux critères ci-dessus et d'écrire le nombre de cellules comptées dans une feuille de données d'un logiciel d'analyse.
- Calculer le pourcentage de cellules NET libérant en utilisant les nombres de cellules comptées de NET de libération et des cellules non-libération.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neutrophiles du sang d'origine humaine ont été isolées par centrifugation en gradient de densité (Figure 2). Pour étudier l'effet des modifications lipidiques sur les neutrophiles, les cellules ont été traitées avec 10 mM MβCD, qui appauvrit le cholestérol de la cellule. Par la suite, les lipides ont été isolés des échantillons par Bligh et Dyer (Figure 1, panneau de gauche), comme décrit par Brogden et al. 23. Les échantillons lipidiques préparées ont été chargés sur des plaques de gel de silice HPTLC et initiée en utilisant un protocole à trois solution, qui a été optimisée afin de séparer et de visualiser une large gamme de lipides, y compris le cholestérol, les esters de cholestérol, sphingomyéline, les phospholipides, et triacylglycérides, acides gras libres , monoacylglycérol, la phosphatidyléthanolamine, la cardiolipine, la phosphatidylsérine, la phosphatidylcholine et (figure 3A). les dérivés oxygénés du cholestérol (les oxystérols) ne sont pas détectables wvec cette méthode. On a effectué une analyse quantitative du cholestérol supplémentaire par CLHP (figure 3B). La valeur de la régression pour les taux de cholestérol était nettement meilleure pour l'utilisation de HPLC (figure 4A) par rapport à HPTLC (figure 4B). Pour visualiser les filets, les cellules ont été stimulées avec les stimuli mentionnés ci-dessus, fixées et colorées pour l' ADN / histone 1 (vert), MPO (rouge), et de l' ADN (bleu) comme typiques des marqueurs de NET (Figure 5A). Comme le montre la figure 5A, un accident clair de MPO, ADN / histone 1 et de l' ADN se produit dans les filets lorsque les cellules ont été traitées avec 10 mM MβCD pendant 2 h. Par la suite, l'effet de réduction du cholestérol a été analysée au microscope. Par conséquent, les cellules ont été colorées pour l' ADN (bleu) et de l' ADN / histone 1 (vert), et les noyaux de NET de libération ont été comptés à l' aide du module de compteur de cellule à partir du logiciel de traitement d'image ImageJ (figure 5B). neutrophiles non traitées ont servi de contrôle pour spontaneous formation NET (Figure 5B-i). Sur la figure affichée, la libération NET dans les neutrophiles non traitées après 2 h d'incubation était de 3,89%, alors que le traitement des cellules avec 10 mM MβCD a donné lieu à 35,17% NET formation (figure 5B).
Figure 1: représentation schématique des étapes impliquées dans la détermination de la composition lipidique et la libération du piège extracellulaire de neutrophiles du sang d'origine humaine. Les neutrophiles sont isolés à l'aide d'un gradient de densité et traités avec méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) pour induire des modifications des lipides et la formation NET. Par la suite, les lipides sont isolés et analysés par CCMHP en utilisant soit ou HPLC, et les filets sont visualisés et quantifiés par immunofluorescence.
Figure 3: HPTLC et l' analyse HPLC des lipides isolés à partir de neutrophiles. (A) La norme utilisée pour identifier les lipides présents dans les neutrophiles par HPTLC (voie de gauche). CE: Les esters de cholestérol, TG: Triglycérides, FFA: acides gras libres, Chol: cholestérol, MG: monoacylglycérol, PE: phosphatidyléthanolamine, CL: Cardiolipin, PS: Phosphatidylserine, PC: phosphatidylcholine et SM: Sphingomyelin. (B) résultat représentatif montrant un pic spécifique du cholestérol de 2 mg / mL à 4,980 min en utilisant le protocole de HPLC décrit ici.
Figure 4: HPLC et analyse HPTLC du cholestérol. Des graphiques montrant la relation entre la concentration de cholestérol et la région, telle que mesurée par HPLC (A), et l' intensité de la bande, telle que mesurée par HPTLC (B). La limite minimale de détection pour HPLC était de 0,0016 mg / ml, avec une valeur de régression de la courbe standard de 0,998 N = 3, SEM (A). Le cholestérol allant de 2 mg / mL jusqu'à 0,05 mg / mL peut être semi-quantifiés en utilisant HPTLC (B), avec un seuil de détection minimum de 0,05 mg / ml N = 3, SEM. La valeur de la régression de la courbe d'étalonnage HPTLC est 0,918.
Figure 5: fluorescence représentatives micrographies affichage structures NET et subsequent quantification NET. (A) Les neutrophiles stimulés avec 10 mM MβCD pendant 2 h ont été colorées pour (ii) MPO (rouge), (iii) ADN / histone 1 (vert), et (iv) l' ADN (bleu). (I) Recouvrement de (ii), (iii) et (iv). (B) Les cellules ont été incubées pendant 2 h avec (i) du milieu HBSS ou (ii) 10 mM MβCD, et TNE libérés ont été colorées pour les noyaux (bleu) et de l' ADN / histone 1 (vert). noyaux NET-négatifs ont été marqués avec le compteur 8 (jaune) et les noyaux NET-positif avec compteur 7 (rouge).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les méthodes décrites ici peuvent être utilisés pour analyser les lipides spécifiques, tels que le cholestérol, par HPTLC ou HPLC et d'étudier les effets des modifications lipidiques pharmacologiques sur la formation de TNE (voir Neumann et al. 15).
HPTLC est une méthode relativement rentable et simple d'analyser une large gamme de lipides dans un grand nombre d'échantillons. Cette méthode a été utilisée dans de nombreux domaines de recherche, y compris la quantification antibiotique 25, le stockage des lipides dans les maladies lysosomales 26, et la détermination des taux de cholestérol et cholesterylglucoside dans les cellules épithéliales 27. La méthode décrite ici a été modifié et optimisé pour isoler les lipides à partir d'une population de neutrophiles purifiés; cependant, une version légèrement modifiée peut également être utilisé pour isoler les lipides à partir d' échantillons de tissus (voir Brogden et al. 23). L'utilisation de cette rencontreHod, les lipides peuvent également être efficacement séparés, identifiés et semi-quantifiés contre une norme connue. Une étape critique dans ce procédé est l'utilisation de la mémoire tampon nommé respectif, étant donné que l'utilisation de tout autre tampon ou milieu peut conduire à une contamination des lipides et des bandes de lipides non spécifiques dans les échantillons. Etant donné que la sensibilité est limitée par HPTLC, HPLC devrait être utilisé comme une méthode plus précise pour la quantification absolue.
HPLC facilite la quantification et l'identification des taux de cholestérol et de ses diverses formes ou des dérivés en effectuant une comparaison avec un lipide connu. En utilisant le protocole décrit ci - dessus, il est possible de quantifier de façon fiable jusqu'à 0,0016 mg / mL de cholestérol (figure 4A), avec un rapport linéaire allant jusqu'à 10 mg / mL (R = 0,990). La méthode de HPTLC permet la détection du cholestérol jusqu'à 0,05 mg / ml, mais avec une courbe sigmoïde et un coefficient de corrélation inférieur de R = 0,906 (figure 4B). La plus grande sensibilité et une corrélation plus élevée coefficient HPLC permet donc une méthode bien supérieure pour la quantification exacte des lipides, ce qui permet par la suite des différences entre les échantillons plus petits pour être détectés. Cependant, les deux méthodes peuvent être utilisées en combinaison; HPTLC peut être utilisé pour obtenir un aperçu dans lequel les lipides peuvent être modifiés, et HPLC peut être utilisé dans une approche plus ciblée pour quantifier la différence d'un lipide spécifique dans un échantillon donné. Lorsque l'on compare nos mesures avec les valeurs obtenues par d' autres 28, 29, moins de cholestérol a été quantifié dans les neutrophiles totaux. Cela peut être expliqué par la méthodologie utilisée. D'autres études ont utilisé une détection fluorimétrique, qui est basé sur une réaction couplée à une enzyme qui détecte à la fois du cholestérol libre et cholesterylesters.
Ici, HPTLC et HPLC sont utilisés en combinaison pour vérifier que MβCD conduit à une réduction significative du cholestérol comme également montré précédemment par Gorudko et al.ss = "xref"> 28. Ils ont démontré une réduction de 60% du cholestérol dans les neutrophiles de 10 mM MβCD. En outre, une légère réduction du niveau de la sphingomyéline , mais pas les esters de cholestérol était détectable dans les cellules neutrophiles traitées avec MβCD (voir Neumann et al. 15). En même temps, l'épuisement du cholestérol conduit à la formation de TNE (voir Neumann et al. 15). Ces trouver une bonne corrélation avec le phénomène que le traitement des neutrophiles avec les statines, les inhibiteurs de la 3-hydroxy 3-méthylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase, l'enzyme limitant la vitesse dans la biosynthèse du cholestérol, stimule la formation de filets. Cependant, étant donné que le traitement par une statine de neutrophiles présente induction plus forte NET par rapport au traitement MβCD (voir Neumann et al. 15 et Chow et al. 20), les effets supplémentaires des statines , par exemple sur l' effecteur membrane ancrée prénylée proteins pourrait être également impliqué dans la formation de TNE.
La formation de TNE est un mécanisme de défense de l'hôte décrit relativement nouveau. Les fibres d'ADN extracellulaire ont maintenant été décrits non seulement chez les mammifères 30, 31, mais aussi dans le poulet, le poisson, les crevettes et les plantes 32, 33, 34, 35. Lors de la stimulation des neutrophiles par des agents pathogènes ou d' autres stimuli, les TNE sont libérés dans l'espace extracellulaire, où ils emprisonnent et éventuellement tuer les agents pathogènes envahisseurs 36. L'étude de la composition lipidique d'un neutrophile activé peut aider à comprendre les mécanismes cellulaires médiatrices son activité anti-microbienne. Étant donné que nous avons mesuré que le niveau total des lipides des neutrophiles, il reste à déterminer la façon dont la teneur en lipides est différent et est affectée par MβCD dans la cellule entière par rapport plasmembranes ma et entre les différents domaines de micro membrane. Cependant, cela nécessite des procédés de séparation membranaire spécifique comme décrit précédemment (Xu et al.). 37
En plus de la chromatine, les TNE humaines contiennent plusieurs protéines, telles que neutrophile FTU; l'élastase, le peptide antimicrobien LL-37; ou calgranuline 17, 36. Des recherches récentes ont porté en grande partie sur le rôle de ces protéines spécifiques et des changements morphologiques, qui initient et facilitent la formation de TNE 15, 38, 39. Cependant, jusqu'à présent, il n'y a que des connaissances limitées sur l'importance de certains lipides au cours de ce processus 15, 20. Par conséquent, il est un domaine particulièrement intéressant à explorer plus en détail dans l'avenir. Enfin, les connaissances sur les modifications de la membrane lipidiquepourrait servir de base à des approches thérapeutiques pour stimuler le système immunitaire contre les infections. À titre d'exemple, on a montré que l'épuisement du cholestérol pourrait aider dans la lutte contre les agents pathogènes résistants aux antibiotiques tels que H. pylori, car il a été démontré que le cholestérol améliore la résistance de ces insectes contre les antibiotiques et les peptides antimicrobiens 40. Des études similaires pourraient être utiles pour la compréhension des interactions hôte-pathogène avec différentes espèces bactériennes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une bourse de l'Akademie für Tiergesundheit (AFT) et une bourse du programme de doctorat, « animale et infections zoonotiques » de l'Université de médecine vétérinaire de Hanovre, en Allemagne, fourni à Ariane Neumann.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
- Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. Membrane rafts in host-pathogen interactions. Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).
- Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients. Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).
- Bavari, S., et al. Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. J Exp Med. 195, 593-602 (2002).
- Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright,, J,, Abraham, S. N. The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections. Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).
- Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci. Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).
- Grassme, H., et al. Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts. Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).
- Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. Role of sphingolipids in microbial pathogenesis. Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).
- Gatfield, J., Pieters, J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages. Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).
- Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. Dermatology 2-Volume Set. , St. Louis: Mosby. (2007).
- Tamilselvam, B., Daefler, S. Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages. J Immunol. 180 (12), Baltimore, Md. 8262-8271 (2008).
- Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking. Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).
- Gilk, S. D., et al. Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol. PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).
- Tuong, Z. K., et al. Disruption of Rorα1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice. Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).
- Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J Vis Exp. (94), (2014).
- Neumann, A., et al. Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps. Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- von Köckritz-Blickwede, M., Nizet, V. Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps. J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
- Lauth, X., et al. M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition. J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).
- Chow, O. A., et al. Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps. Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
- Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).
- Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors. J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).
- Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry. J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).
- Maalouf, K., et al. A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV. J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).
- Correia, M., et al. Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).
- Gorudko, I. V., et al. Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils. Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).
- Masoud, R., Bizouarn, T., Houée-Levin, C. Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study. Redox Biol. 3, 16-24 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus. J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).
- Reichel, M., et al. Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii. Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).
- Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).
- Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
- Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria. Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).
- Hawes, M. C., et al. Extracellular DNA: the tip of root defenses? Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin? J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
- Xu, T., et al. Lipid raft-associated β-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin. J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).
- Ermert, D., et al. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections. J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).
