網膜下腔にアクセスするための代替と検証済みの注入方法<i>経由で</i>経強後方アプローチ
Summary
Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.
Abstract
網膜下注射は成功し、感光体への直接曝露し、網膜色素上皮（RPE）を持つinterphotoreceptor /網膜下の区画へのタンパク質の治療的介入、ウイルス剤、および細胞を送達するために、ヒトおよびげっ歯類の両方で使用されてきました。プラスミノーゲンの網膜下注射、ならびに最近の前臨床および臨床試験は、進行網膜疾患を有する個体にウイルスベクターおよび幹細胞の送達の安全性および/または有効性を実証しています。網膜疾患、特に遺伝性網膜ジストロフィーのマウスモデルは、これらの治療を試験するために不可欠です。げっ歯類で最も一般的な注入手順は、網膜の前方アプローチで小経角膜または経強切開を使用することです。このアプローチでは、注射針は、感覚神経網膜は、基礎となるRPEを中断し、挿入時に簡単にニックレンズは、非侵襲imagiのレンズ混濁や障害を引き起こすことができます浸透しますngの。経強を経由して網膜下腔へのアクセス、後方アプローチは、これらの問題を回避：針は、網膜浸透せず、視神経から約0.5mm強膜を横断し、硝子体を破壊し回避することができます。巻き添え被害は、焦点強膜切開と過渡、漿液性網膜剥離の影響に関連したものに限定されています。この方法の簡単さは、眼の損傷を最小限に抑え、迅速な網膜再付着し、回復を確保し、低故障率を持っています。最小限の網膜の損傷およびRPEは、有効性の明確な評価と治療薬自体の直接的な効果を可能にします。この原稿は、ウイルスベクター、薬剤、高い有効性、最小限の損傷、および高速回復を有するマウスにおける網膜下腔への細胞または人工多能性幹（iPS）細胞を幹細胞を標的化するために使用することができる新規な網膜下注入技術が記載されています。
Introduction
網膜下注射は、光受容体と基礎となるRPE 1,2に及ぼす影響を研究するためにマウスの網膜に細胞およびウイルス薬剤を送達するための主要な手段です。マウスのほとんどの網膜下注入プロトコルは、経角膜や赤道に経強注射部位の前方（ 図1）を使用します。このアプローチは、レンズのニッキングし、得られた白濁、感覚神経網膜および虹彩、網膜出血、実質的な網膜剥離と永続的な網膜下浮腫3-9の硝子体、浸透の完全性の破壊を含み、固有の巻き添え被害をもたらすことができます。実験操作は、治療的介入3,7,10,11の効果を評価するために、これらの影響を克服しなければなりません。この研究では、これらの合併症を回避する後方経強注入法の詳細な説明および検証を提供し、外傷を最小限にし、サブ標的の高い成功率を有しています網膜スペース。
マウスにおいて、網膜下腔をターゲット注射は、多くの場合、実行するのが非常に困難であり、ほとんどの研究者は、ベクターが誤った場所に配信されているか、重要な網膜の損傷があり、完全な網膜剥離6で例えばこれに失敗した試行の高周波を発生します。なぜなら注入合併症の分析から除外した目の数は、典型的には、マウスの研究で報告されていませんが、私たち自身の経験にし、他の研究者との議論では、失敗した注射の数は50％もの高さと経験に依存して変化させることができ、注射を行っている研究者の能力。注射の成功は、典型的には、直接眼底イメージングおよび/または光コヒーレンストモグラフィー（OCT）7,9によって評価されます。マウスでの網膜下注射のための高い成功率で簡単に習得方法の実験を早めるとTREの前臨床試験のコストを削減することができます米国における失明の主要な原因である網膜疾患のためatments。
後部、ここで説明する経強網膜下注入技術は、臨床および前臨床プロトコル9,12から適応したものです。注射したマウスで行われ、非侵襲的診断評価は軽度と高度に局在化損傷を示し、追加担保レンズ、網膜およびRPE損傷を欠いています。それにより、このような研究に関連するコストを低減すること、 – （90％以上80）さらに、比較的少ない練習で、実験者は、高い成功率と、これらの結果を達成することができます。この手順は、細胞、ウイルス、または前臨床試験における光受容体および/またはRPEへの薬理学的治療介入を提供するために、容易に実験的介入を評価するために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
網膜下注射は、ウイルスベクターの送達のための選択の方法であり、光受容体と基礎研究と臨床治療の両方でRPEを操作するための幹細胞を利用した治療法。患者では、網膜下注射は一般的に、直接可視化と針で、扁平部で前部強膜切開と網膜の後部コア硝子体切除術と浸透を行っています。目が偽すでにある場合を除き白内障形成が途中で発生するための最も硝子体切除手順と同じように、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.
Materials
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
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