Summary
미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.
Abstract
외에도 ATP를 생성하는 자신의 중요한 역할에서, 미토콘드리아는 (칼슘) 단단히 세포 내 칼슘 농도를 조절하는 버퍼 지역 칼슘 역할을합니다. 이렇게하려면 미토콘드리아는 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (ΔΨ 분)에 걸쳐 전기 잠재력을 활용합니다. 미토콘드리아에 칼슘 이온의 유입은 산화 적 인산화 (OXPHOS) 착체를 통해 전자 전달을 증가 시트르산 사이클의 세 속도 제한게나 제를 자극한다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ 분을 유지한다.
우리는 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ의 m 여기하는 방법을 설명합니다. 세포를 permeabilizing, 미토콘드리아 칼슘에 의해 2+ 수형광 염료를 사용하여 테트라 메틸 ΔΨ m의 메틸 에스테르, 퍼클로레이트 (TMRM)의 측정을, 형광 칼슘 지표 FLUO-4 AM을 사용하여 측정 될 수있다. 이 시스템의 이점은 형광 염료 사이의 아주 작은 스펙트럼 오버랩 동시에 정확한 미토콘드리아의 Ca 2+ 및 측정 ΔΨ의 m을 수 있다는 것이다. 칼슘 분취의 순차 첨가를 사용하여 미토콘드리아 칼슘 흡수를 모니터 할 수 있으며, 칼슘 미토콘드리아 막 투과성 전이 및 ΔΨ의 손실을 유도하는 농도 결정 해요.
Introduction
미토콘드리아는 지역 칼슘 버퍼 1로 작용하여 세포 내 칼슘 농도를 조절하는데 중요한 역할을한다. 칼슘은 2 +, 칼슘 2 + uniporter 통해 미토콘드리아 내막 (ΔΨ 분) 2에서 존재하는 전기 화학적 구배에 의해 구동되는 과정을 미토콘드리아로 들어갑니다. 일단 미토콘드리아 매트릭스 내부, 칼슘은 구연산 사이클 (3)의 세 가지 속도 제한 탈수소 효소를 자극하여 산화 적 인산화를 활성화 할 수 있습니다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ 분을 유지한다. 미토콘드리아 내의 칼슘 이온 농도가 매우 높아지면, 미토콘드리아 투과성 천이 ΔΨ의 m의 손실의 결과로, 초기화 될 수 있으며, cessatio산화 적 인산화 n 및 4 경로 신호 세포사의 유도.
미토콘드리아는 세포 칼슘의 공간 버퍼링에서 재생 중요한 역할은 미토콘드리아 칼슘의 정확한 모니터링이 중요합니다. 다양한 방법 로다 계 염료의 사용을 포함 미토콘드리아 칼슘을 모니터하기 위해 설립되었다. 그러한 염료, 루비로드-2, AM은 6 미토콘드리아 칼슘 레벨 5를 측정하는 미토콘드리아에 파티션에 매우 효과적이다. 몇몇 염료는 리포좀과 같은 다른 소기관에 축적 또는 세포 세포질에 남아 그러나, 치료가 사용되어야한다. 그럼에도 불구하고, 하류 분석 미토콘드리아 7 것과 이러한 신호들을 구별하기 위해 사용될 수있다.
미토콘드리아 칼슘을 모니터링하는 다른 기술은 형광 리포터 (8)를 구성 이용한다 >입니다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 이점은 특히, 예를 들어 인간 COX 소단위 VIII의 N- 말단 타겟팅 신호 내인성 N 말단 펩티드를 이용하여 미토콘드리아를 타겟팅 할 수 있다는 것이다. 이 시스템은 9 신호 미토콘드리아 칼슘 조사 매우 유용 입증되었다 미토콘드리아 타겟팅 쿼린 프로브를 생성하는데 사용되어왔다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 주요 단점은 일시적인 발현에 의해 세포 내로 도입 될 필요가 (특정 세포 유형에 대해 가능하지 가변 결과를 얻을 수 있음) 또는 안정한 발현 시스템 (이는 시간이 소비된다) 만들어 있다는 것이다.
위에 설명 된 문제를 회피하기 위해, 우리는 동시에 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ m을 측정하는 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜은 투과성이 세포에 외인성 칼슘을 추가하는 전술 한 방법에 기초S = "외부 참조"> 10. 우리의 프로토콜은 다른 방법을 통해 세 가지 주요 이점이있다 : 첫째로, 우리는 FLUO-4, AM 및 TMRM는 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ 분, 매우 독특한 스펙트럼 특성을 갖는 두 개의 염료를 모니터링하는 데 사용할; 둘째, 세포는 FLUO-4 신호는 미토콘드리아 칼슘 감지하는 2 +와 칼슘이 다른 세포 소기관이나 세포의 세포질에 지역화되지 않도록 투과성이있다; 셋째, FLUO-4의 사용 2+ 미토콘드리아 칼슘 감지 유 전적으로 인코딩 된 프로브를 사용하는 경우 존재하는 세포 또는 형질 전환 문제를 부정 빠르고 간단한 세포 염색을 허용한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
세포의 1. 준비
- 10cm 세포 배양 접시에 세포 또는 75cm 성장 5 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S가 보충 배지 [10 ㎖ 둘 베코 변형 이글스 중간 (DMEM)에서 두 플라스크 ) 37 ° C / 5 % CO 2에서.
- 세포를 수확하려면 다음 5 ml의 1 배 인산염 완충 생리 식염수 (1X PBS)로 세척, 흡인에 의해 용지를 제거합니다. 다음 (w / v)의 트립신 / 0.25 %를 1.5 ml의 0.25 %를 추가, 흡인 1X PBS를 제거 (/ w를 v)의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 2 분 동안 37 ° C / 5 % CO 2에서 배양한다. 접시를 누르거나 다음 5 ml의 배양 배지에 재현 탁, 세포를 제거하기 위해 조심스럽게 플라스크.
- 혈구에 재현 탁하고 세포를 12 μl를 첨가하여 세포를 카운트.
- 요리 또는 공 촛점 이미징 챔버 커버 슬립에 플레이트 세포.
참고 :이 거꾸로 현미경과 함께 사용하도록 설계되었습니다 적합한 플라스틱이나 유리 바닥을해야합니다. - 플레이트 세포 일 때문에~ 80 %의 컨 플루 이미징 당일 달성된다. 예를 들어, 약 2 × 104 (143B)의 골육종 세포 촬상 전에 8 웰 챔버 슬라이드 1 일 잘 하나에 도금 될 수있다.
- 세포 부착 및 복구 할 수 있도록 37 ° C / 5 % CO 2에서 하룻밤 동안 세포를 인큐베이션.
TMRM 및 FLUO-4 영상 2. 버퍼
- 156 mM의 NaCl을 3 밀리미터의 KCl, 2 mM의 황산을 포함하는 기록 솔루션 (RS)를 준비 1.25 밀리미터 KH 2 PO 4, 10mM의 D-글루코오스, 2 mM의 CaCl2를 10 mM의 HEPES pH를 7.35. -20 ºC에서 분취에 보관 RS.
- 준비 세포 내 중간 (IM) 6 mM의 NaCl을 130 밀리미터의 KCl, 7.8 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 KH 2 PO 4, 0.4 mM의 CaCl2를, 2 mM의 EGTA, 10mM의 HEDTA, 2 mM의 말산, 2 mM의 글루타메이트, 2 밀리미터 포함 ADP와 20 mM의 HEPES pH가 7.1. 말산, 글루탐산 ADP 200 mM의 스톡 용액은 별도로 제조 분취하고 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 세인트ocks은 사용 전에 IM에 첨가 될 수있다.
- 2+ 자유 행크 완충 염 용액 (HBSS)을 얻을 수있다 Ca는 상업적 공급자로부터 미리 제조. 에틸렌 글리콜 비스 (β 아미노 에틸 에테르)를 첨가 -N, N, N ', 500 μM의 최종 농도 N'- 테트라 아세트산 (EGTA).
- 100 % 메탄올의 10 밀리미터 테트라 메틸, 메틸 에스테르, 퍼클로레이트 (TMRM)의 스톡 용액을 제조 하였다. 이 주식에서 증류수 H 2 O 2 μM의 작업 재고를 확인
- 100 % 에탄올 중 10 mM의 베라파밀의 스톡 용액을 제조 하였다.
- 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 FLUO -4- 아세 톡시 메틸 에스터 (FLUO-4 AM)의 스톡 용액 (V / w) 1 ㎎ / ㎖를 준비한다.
참고 : FLUO-4, AM은 칼슘 결합에 형광을 증가 전시회 칼슘 지표입니다. FLUO-4는 불소로 치환 두 염소 치환체, FLUO-3의 아날로그이다. 이것은 488 nm에서의 형광 증가 여기 높은 형광 신호 레벨을 초래한다. 그만큼AM 에스테르 기 세포막을 투과 할 수있는 대전 된 FLUO-4 분자를 초래한다. 세포 내부되면 AM 에스터 셀 내에 갇혀 FLUO-4 충전 된 형태의 결과 특이성 에스 테라 제에 의해 분해된다. - 100 % 에탄올에 1 mM의 카본 시안화 P-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)의 스톡 용액을 제조 하였다.
- 증류수 H 2 O의 주식 25 ㎎ / ㎖의 용액 (w / v)의 디기 토닌 준비
- DMSO 100 μM의 쌥시 가르 긴의 재고 솔루션을 준비합니다.
- 증류 H 2 O. 40mm의 염화칼슘 (CaCl2를)의 스톡 용액을 준비
TMRM 및 FLUO-4 AM 셀들 3. 염색법
- 20 nM의 TMRM와 RS 염색 솔루션을 준비, 5 μg의 / ㎖ (W / V) FLUO-4, AM 및 플루로 닉 F-127 RS에서와 같은 0.005 % 계면 활성제.
참고 :이 계면 활성제 FLUO-4, AM의 가용화를 용이하게하는 비이 온성 폴리올이다. 참고 : 10 μM 베라파밀 inhibi 또한 첨가 될 수있다이 세포 유형에서 발현된다면 세포막 다제 수송하여 t TMRM 보 분석된다. - 피펫으로 세포 배양 배지를 제거하고 PBS 1 배 100 μL 세척.
- 피펫 1X PBS를 제거하고, 실온에서 45 분 동안 250 ㎕의 RS의 염색 액에 세포를 배양한다.
주 : FLUO-4, AM은 셀에 진입하면, AM 에스테르 셀룰러 에스 테라 제에 의해 분해된다. 실온에서 배양하면 FLUO-4, AM은 미토콘드리아를 입력 할 수 있도록, 에스 테라 제 활성을 억제한다. - 피펫에 의해 RS의 염색 액을 제거하고 초과 FLUO-4, AM 및 TMRM을 제거하기 위해 칼슘 2 + μL (100)에 무료 HBSS를 세포를 씻는다.
- 25 μg의 / ml의 IM 이미징 솔루션을 준비 디기 토닌 (/ V w), 200 nM의 TMRM 및 IM 1 μM의 쌥시 가르 긴.
참고 디기 토닌의 농도가 발생하지 미토콘드리아 내막의 permeabilization을 위해 조정될 필요가있다. 이것은 강도를 평가함으로써 실험적으로 결정될 수있다디기 토닌 상이한 농도에서 TMRM 신호. - 피펫으로 칼슘 2 + 무료 HBSS를 제거하고 세포 IM 이미징 솔루션의 300 μl를 추가합니다. 10 분 동안 실온에서 평형 셀을 떠난다. 셀은 염화칼슘이 추가와 이미징을위한 준비가되어 있습니다.
4. 세포 이미징
- 반전 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 접시 또는 IM 이미징 솔루션 세포와 챔버 커버 슬립을 놓습니다.
- TMRM 및 FLUO-4의 여기 및 방출 스펙트럼에 대한 현미경 레이저에 설정을 사용합니다. 예를 들어, 각각 TMRM 및 FLUO-4를 가진시키기 위해 543 nm의 HE-(NE)와 473 nm의 아르곤 레이저 라인을 사용한다. 셀 어떤 광 손실을 최소화하기 위해 약 5 %의 낮은 레이저 파워를 사용한다.
- 이미지마다 25 초를 스캔 현미경을 설정합니다. 10 분 동안 스캔 세포는 TMRM와 FLUO-4 신호를 기준 판독 값을 설정합니다.
주 : FLUO-4 신호가 휴식 칼슘 승낙에 약하거나 탐지 할 수있다식료품. - IM 이미징 솔루션의 300 μl를 직접 세포에 40 mM의 CaCl2를 원액의 3 μl를 추가 (1 : 100 희석)와 피펫으로 가볍게 섞는다. 추가하고, 필요한 경우 CaCl2를 혼합하면서 화상 검색을 일시 정지.
주 : 최종 자유 칼슘 이온 농도 [칼슘 상기 IM 촬상 용액 등 Maxchelator WEBMAXC 같은 소프트웨어를 사용하여 계산 될 수 EXTENDED ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) 또는 킬레이트 11. 최종 자유 칼슘 이온 농도를 계산하는 방법에 대한 자세한 설명은 [캘리포니아 2+] 아래의 (6)에 기재되어있다. - 약 4 분의 이미지 스캔을 계속하고 일반적으로 약 8 10 추가에 도달 원하는 TMRM 또는 FLUO-4 신호까지 염화칼슘 2 추가 매 4 분을 반복합니다.
- 1 mM의 FCCP 100 희석 (최종 C : 피펫을 사용하여 1을 추가직접 세포에 oncentration 10 μM)는 ΔΨ 분을 발산합니다. 또 5 분 동안 이미지 세포. 실험은 이제 완료됩니다.
5. 이미지 분석
- 이미지가 완료되면 http://downloads.openmicroscopy.org/bio에서 바이오 형식 플러그인 (다운로드 'bioformats_package.jar'로 예시 ImageJ에 소프트웨어, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 FLUO-4와 TMRM 신호의 강도를 판정 -formats /과에 저장 'C : 프로그램 파일 ImageJ에 플러그인'폴더).
- ImageJ에있는 (예를 들어 .oif 파일) 이미징 파일을 엽니 다. 미토콘드리아가 포함 된 선택 도구를 클릭하고 관심 (ROI)의 영역을 선택합니다. 투자 수익 (ROI)을 선택합니다 초기 TMRM 신호를 사용합니다.
- 열기 '분석> 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자'강도 측정을위한 선택 투자 수익 (ROI)을 포함하는 '추가'를 클릭합니다. 복수의 ROI는 측정을위한 하나의 이미지를 선택할 수 있습니다. 모든 ROI 때까지 반복하여 이전 단계s는 투자 수익 (ROI) 관리자에 추가되었습니다.
- '더보기> 멀티 측정'을 클릭 선택 '모든 조각을 측정합니다'있는지 확인하고 '조각 당 하나의 행이'선택 해제되어 있는지, 다음 TMRM 및 FLUO-4 신호의 평균 형광 강도의 표를 얻기 위해 '확인'을 클릭 각 시점에서 각 ROI합니다.
- TMRM 및 FLUO-4 신호 강도의 평균과 표준 편차를 계산하기 위해 모든 ROI들로부터 데이터를 사용한다.
6. 최종 무료 칼슘 이온 농도 [칼슘 2 +] 계산
- 유리 칼슘 이온 농도 IM 촬상 용액 [칼슘]는 Maxchelator WEBMAXC EXTENDED (같은 소프트웨어를 사용하여 결정될 수있다 http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) 또는 킬레이트 11. = 온도를 24 ° C, pH가 7 예를 들어, 다음과 같이 WEBMAXC의 변수 확장 설정합니다.1, 이온 강도 = 0.162, EGTA = 0.002 M, HEDTA = 0.01 M, 칼슘 2 + = 0.0004 M과의 Mg 2+ = 0.0078 M.이 최종 무료 칼슘 이온 농도 [칼슘 2 +] 62 nM의의 결과 . 이 프로그램은 시약의 순도 측정과 pH를 측정의 정확도로, 계정에 모든 변수를 취할 수 없습니다. 유리 칼슘 이온 농도를 결정하는 가장 정확한 방법은 교정 된 칼슘 선택성 전극을 사용하는 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
우리는 칼슘 (12)의 증가를 버퍼링 143B 세포 미토콘드리아의 능력에 MT-ND5 돌연변이의 영향을 조사하기 위해 프로토콜을 사용 하였다. 여기에 도시 된 예에서, 제어부 (143B) 세포 TMRM FLUO-4와 함께로드하고, 디기 토닌와 permeabilization 전에 AM. 촬상 5 분 후, 1 여덟 순차 추가 : CaCl2를 40 mM의 외인성 100 희석 최종 자유 칼슘 이온 농도로 만들어 하였다 캘리포니아 2+] 계산.
각 CaCl2를 첨가 후, TMRM 신호는 미토콘드리아 막 전위 ΔΨ의 m (그림 1) 방산 2+ 이온 미토콘드리아에 칼슘의 유입으로 감소한다. 호흡 ΔΨ의 m을 유지하기 위해 증가함에 ΔΨ m은 복원한다. 이것은 각 염화칼슘 후 네 번 발생
매체의 여유 [칼슘]가 0.32 μM (도 2)에 도달 할 때 미토콘드리아 칼슘 농도 (FLUO-4 신호) 제 CaCl2를 첨가 한 다음에 증가하기 시작한다. 이후의 CaCl2를 첨가 미토콘드리아 칼슘의 점진적 증가가 발생했습니다.
ΔΨ 분의 동시 측정 (TMRM, 적색 신호)과 미토콘드리아 칼슘의 이미지 (FLUO-4, 녹색 시그NAL)) (그림 3에 나타낸다.
그림 1 : 디기 토닌의 미토콘드리아 ΔΨ의 m의 측정은 TMRM를 사용하여 143B 세포 투과성이. 143B 세포 디기 토닌과 permeabilization 전에 FLUO-4, AM 및 TMRM 미리로드되었다. 1 : CaCl2를 40 mM의 외인성 100 희석 순차 분량 씩 첨가 하였다. 마지막 자유는 [칼슘 2 +] 미디어에서 각 추가 (*)에 대해 표시됩니다. FCCP 약 40 분 후에 10 μM의 최종 농도로 첨가 하였다. ΔΨ의 m은 TMRM 신호의 상대 강도 (RI)으로 나타내는 적색에 나타낸다. SD N = 3. 그림을 참조 (12)로부터 허가를 적응 ± 데이터는 뜻이다. 더 큰 버전?을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 N.
그림 2 : 디기 토닌의 미토콘드리아 칼슘의 측정은 FLUO-4, AM을 사용하여 143B 세포 투과성이. 143B 세포 디기 토닌과 permeabilization 전에 FLUO-4, AM 및 TMRM 미리로드되었다. 1 : CaCl2를 40 mM의 외인성 100 희석 순차 분량 씩 첨가 하였다. 마지막 자유는 [칼슘 2 +] 미디어에서 각 추가 (*)에 대해 표시됩니다. FCCP 약 40 분 후에 10 μM의 최종 농도로 첨가 하였다. 미토콘드리아 칼슘는 FLUO-4 신호의 상대 강도 (RI)로 나타내는 녹색으로 도시되어있다. SD N = 3. 그림을 참조 (12)로부터 허가를 적응 ± 데이터는 뜻이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 디기 토닌의 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ (m)의 동시 측정 FLUO-4, AM 및 TMRM를 사용하여 143B 세포 투과성이. 143B 세포 디기 토닌과 permeabilization 전에 FLUO-4, AM 및 TMRM 미리로드되었다. 1 : CaCl2를 40 mM의 외인성 100 희석 순차 분량 씩 첨가 하였다. 마지막 자유는 [칼슘 2 +] 언론에 각각 추가 할 표시됩니다. ΔΨ (m)의 동시 염색 (적색 TMRM)와 미토콘드리아 칼슘 (FLUO-4, 녹색)을 보여주는 대표 공 촛점 이미지. FLUO-4 신호가 0.062 μM의 휴식 칼슘 농도로 검출하기 어려운합니다. 화이트 스케일 바는 10 μm의 =. 그림은 참조 (12)로부터 허가 구성된다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
칼슘은 근육 수축, 신경 신호 전달 및 세포 증식 (13)를 포함한 많은 세포 공정에서 중요한 역할을한다. 세포의 칼슘 농도의 증가는 종종 직접 ATP 생성 3을 높이기 위해 미토콘드리아의 산화 적 인산화를 자극 할 수 칼슘, 에너지 수요와 연결되어 있습니다. 우리가 효과적으로 미토콘드리아 칼슘 축적을 모니터링하고,이 기능은 유전 적 요인 및 약리학 적 제제 모두에 의해 영향을받는 방법을 비교할 수있는 능력을 가지고 있다는 것이 필수적이다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
이 프로토콜은 FLUO-4 AM 및 TMRM 동시에 미토콘드리아 칼슘 축적 ΔΨ의 m을 감시하는 기능을 설명한다. 염색 과정은 FLUO-4의 효과를 최적화하기 위해 실온에서 세포를 배양 중요 미토콘드리아 검출에 AM칼슘. 실온에서 인큐베이션 미토콘드리아 막을 통과하고 미토콘드리아 매트릭스를 입력 비 대전 FLUO-4 AM을 허용 세포질 에스 테라 제의 활성을 감소시킨다. 반대로, 37 ℃에서 배양은 세포질에서 에스 테라 제 활성을 효과적으로 향상 미토콘드리아 막을 통과 할 수 없을 것이다 충전 FLUO-4 염료를 남기기 위해 AM 에스테르를 절단한다.
세포 염색을 수행 한 후, 세포를 IM 촬상 용액에 침지된다. 이 용액은 초기 RS 염색 용액에 비해 높은 TMRM 농도를 갖는다. 이제 세포 투과성이되도록 상기 TMRM 더이상 세포막에 걸쳐 평형화 없다. 따라서, TMRM 농도는 미토콘드리아의 내막에 걸쳐 정확한 평형을 달성하기 위해 IM 촬상 용액에서 발생된다. 이는 IM 촬상 쌥시 가르 긴 용액을 포함하는이 단계에서 매우 중요하다. 블록 소포체 (ER) 칼슘 쌥시 가르 긴+ ATP 아제는 FLUO-4 신호가 ER 칼슘이 감지되지 않음을 보장.
수정 및 문제 해결
일부 유형의 세포는 세포막에 다 약제 내성 트랜스 (MDR1 또한 P 또는 당 단백질로 알려진)을 표현할 수있다. 이 단백질은 셀 (14)에서 세포질에서, AM 에스테르 유도체를 포함하는 형광 표시를 수출하는 것으로 알려져있다. 운반체가 표현되는 경우, 두 FLUO-4, AM 및 TMRM는 차선 염색 결과 세포 세포질에서 반출 될 수있다. 이 효과를 차단하기 위해, 베라파밀은 염색 과정 FLUO-4 AM 및 TMRM 수출 억제는 다 약제 내성 수송을 차단하는 RS 염색 용액에 첨가 될 수있다.
분석 할 수있는 세포를 permeabilizing으로 FLUO-4 AM 다른 소기관 또는 세포질에서 경쟁없는 신호와 미토콘드리아 칼슘 검출하는데 사용될 수있다. 우리는 일상적으로 비 이온 detergen를 사용25 μg의 / ml의 농도에서 permeabilization에 대한 t의 디기 토닌. 이 농도는 발생하지 않습니다 미토콘드리아 세포막의 용해를 보장하기 위해 조정해야 할 수도 있습니다. 이것은 디기 토닌 상이한 농도에서 TMRM 신호의 강도를 평가함으로써 실험적으로 결정될 수있다. 디기 토닌의 농도가 너무 높은 경우, 미토콘드리아 막은 TMRM 신호를 감소 부분적 용해 될 것이다.
기술의 한계
이 프로토콜의 주요 이점 중 하나는, 미토콘드리아 칼슘 감지 AM FLUO-4를 사용하여, TMRM 동시에 두 염료 사이 무시할 스펙트럼 오버랩으로 ΔΨ의 m을 측정하는데 사용될 수 있다는 것이다. 미토콘드리아 칼슘 FLUO-4의 특이성을 확인하기 위해 세포를 검사 할 필요가 세포질 FLUO-4 신호를 제거하기 위해 투과성이된다. 이 permeabilization는이 기술의 하나의 제한 사항입니다. 메신저 이미징 솔루션 클리오 동안sely 세포 세포질의 이온 강도와 일치 완전히 그 모든 구성 요소를 복제 할 수있다. 특정 세포질 성분이 실험 시스템을 검사 할 필요하면이 결과에 영향을 미칠 수있다. 세포는 투과성이되고 더욱이,이 프로토콜은, 1 시간보다 긴 실험에 적합하지 않을 수있다.
기존의 / 대안적인 방법에 대한 기술의 중요성
다양한 형광 염료는 미토콘드리아 8 칼슘을 평가하기 위해 개발되어왔다. 이러한 염료를 사용하기 간단하고 짧은 시간에 유용한 데이터를 제공 할 수있다. 이 염료는 미토콘드리아에 주로 축적 있지만, 일부는 리포좀을 포함하여 다른 세포 소기관, 축적, 또는 세포 세포질에 남아있을 수 있습니다. 따라서, 이러한 치료는 다른 신호가 미토콘드리아 칼슘 신호에 영향을주지 않도록주의해야한다.
이 프로토콜, mitochondr에서IAL 칼슘은 쌥시 가르 긴의 존재 투과성이 세포에서 측정된다. 이 방법의 장점은 ER 및 세포질 칼슘 신호가 제거된다는 것이다. 또한, permeabilization는 FLUO-4의 사용은, AM은 칼슘 미토콘드리아 감지 할 수 있습니다. FLUO-4, 오전 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ의 m이 두 염료를 사용하여 동시에 측정 할 수 있음을 의미 TMRM와 거의 스펙트럼 중첩이있다.
미토콘드리아 칼슘 2+ 또한 유 전적으로 인코딩 된 형광 리포터 (8)를 이용하여 측정 할 수있다. 이 기자는 특정 미토콘드리아 칼슘 신호의 결과, 미토콘드리아를 대상으로 할 수 있습니다. 유 전적으로 인코딩 된 프로브는 일부 경우에 상당한 시간과 노력이 소요될 수 연구되고 세포 내로 도입 될 필요가있다. 반대로, 우리의 프로토콜은 미토콘드리아 칼슘을 측정하는 빠르고 간단한 세포 얼룩을 허용, 염료 FLUO-4, AM 및 TMRM를 사용
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램이나 방향
로컬 칼슘 완충액 미토콘드리아 작용은 세포 내 칼슘 농도와 세포의 에너지 요구를 조정한다. 이 프로세스가 중단되는 경우, 과도한 미토콘드리아 칼슘 흡수는 ΔΨ의 m의 붕괴와 세포 사멸 유도 사를 트리거 프로 사멸 분자의 방출을 초래 미토콘드리아 투과성 천이를 유도 할 수있다.
우리는 미토콘드리아 칼슘의 검사 및 ΔΨ 분의 관계와 미토콘드리아 투과성 전이의 유도를 위해 빠르고 직선 앞으로 프로토콜을 제시한다. 이는 당뇨병 (15) 및 노화 관련 포함한 이러한 파라미터 인간 미토콘드리아 질병의 광범위한 발병에 미치는 영향을 조사하기 위해 사용될 수있다알츠하이머와 파킨슨 병 (16)과 같은 신경 퇴행 조건. 더욱이,이 프로토콜은 미토콘드리아 칼슘 ΔΨ의 m은 유전 적 결함이나 환경 독소에 의해 영향을 받는지 조사하기 위해 사용 할 수 있고, 또한 이들 요법 또는 미토콘드리아 타겟팅 약물에 의해 변조 할 수에 미치는 영향. 미토콘드리아 칼슘은 인간의 건강과 질병 모두에서 활약하는 것이 미래의 실험 이러한 유형의 역할에 중요한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
우리는 금융 지원을 위해 박사 Kirstin Elgass 및 기술 지원 모나 마이크로 이미징 박사 사라 크리드, 그리고 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)과 의료 연구위원회 UK 감사합니다. MMcK는 호주 연구위원회 미래 원정대 제도 (FT120100459), 윌리엄 버클 랜드 재단, 호주 미토콘드리아 질환 재단 (AMDF), 의료 연구 및 모나 쉬 대학의 허드슨 연구소 지원됩니다. 이 작품은 빅토리아 정부 운영 인프라 지원 제도에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
