Summary
Mitokondrier kan utnyttja den elektrokemiska potentialen över deras inre membran (Δ Ψm) att binda kalcium (Ca2 +), så att de kan forma cytosoliskt Ca2 + signalering inuti cellen. Vi beskriver en metod för att samtidigt mäta mitokondrier Ca2 + upptagnings- och ΔΨ m i levande celler med hjälp av fluorescerande färgämnen och konfokalmikroskopi.
Abstract
Bortsett från deras viktiga roll i att generera ATP, mitokondrier fungerar också som lokal kalcium (Ca2 +) buffertar för att tätt reglera intracellulära Ca2 + -koncentrationen. För att göra detta, mitokondrier utnyttjar den elektrokemiska potentialen över deras inre membran (ΔΨ m) att avskilja Ca2 +. Inflödet av Ca2 + i mitokondrierna stimulerar tre hastighetsbegränsande dehydrogenaser i citronsyracykeln, vilket ökar elektronöverföring genom oxidativ fosforylering (OXPHOS) komplex. Denna stimulering upprätthåller ΔΨ m, som tillfälligt försvinner de positiva kalciumjoner över mitokondrie inre membranet i mitokondrie-matris.
Vi beskriver här en metod för att samtidigt mäta mitokondrier Ca2 + upptagnings- och ΔΨ m i levande celler med hjälp av konfokalmikroskopi. Genom permeabilisering av cellerna, mitokondriell Ca2 + kanmätas med användning av den fluorescerande Ca 2 + indikator Fluo-4, AM, med mätning av ΔΨ m med användning av det fluorescerande färgämnet tetrametylrodamin, metylester, perklorat (TMRM). Fördelen med detta system är att det finns mycket lite spektral överlappning mellan de fluorescerande färgämnena, vilket möjliggör noggrann mätning av mitokondriell Ca2 + och ΔΨ m samtidigt. Använda sekventiell tillsats av Ca2 + portioner, mitokondrie Ca2 + upptagning kan övervakas, och koncentrationen vid vilken Ca2 + inducerar mitokondriell membranpermeabilitet övergången och förlusten av ΔΨ m bestäms.
Introduction
Mitokondrier spelar en viktig roll vid reglering av intracellulära Ca2 + -koncentrationen genom att fungera som lokala Ca2 + buffertar 1. Ca 2 + kommer in i mitokondrierna via Ca2 + uniporter, en process som drivs av den elektrokemiska gradienten som finns över mitokondrieinnermembranet (ΔΨ m) 2. Väl inne i mitokondriella matrisen kan Ca2 + aktivera oxidativ fosforylering genom att stimulera tre hastighetsbegränsande dehydrogenaser av citronsyracykeln tre. Denna stimulering upprätthåller ΔΨ m, som tillfälligt försvinner de positiva kalciumjoner över mitokondrie inre membranet i mitokondrie-matris. Om Ca2 + koncentration i mitokondrierna blir mycket hög, kan mitokondriell permeabilitet övergång initieras, vilket resulterar i slöseri med ΔΨ m, den cessation av oxidativ fosforylering och inducering av celldöd signalvägar 4.
Den viktiga roll som mitokondrierna spela i den rumsliga buffring av cellulär kalcium gör noggrann övervakning av mitokondriell kalcium kritisk. Olika metoder har inrättats för att övervaka mitokondrie kalcium, inklusive användning av Rhodamine baserade färgämnen. Ett sådant färgämne, Rhod-2, AM, är ganska effektivt vid partitionering till mitokondrierna för att mäta mitokondrie Ca2 + nivåer 5, 6. Emellertid måste försiktighet användas som en del färgämne kommer att ackumuleras i andra organeller, såsom liposomer, eller stanna kvar i cellcytosolen. Icke desto mindre kan analyser nedströms användas för att särskilja dessa signaler från de från mitokondrierna 7.
En annan teknik för att övervaka mitokondrie kalcium utnyttjar fluorescerande reporter konstruerar 8 upp>. Fördelen med dessa genetiskt kodade prober är att de kan vara specifikt riktad mot mitokondrier med hjälp av endogena N-terminala peptider, t ex den N-terminala målsignal av humant COX-subenheten VIII. Detta system har använts för att generera en mitokondriell riktade aequorin sond som har visat sig vara mycket användbar för att undersöka mitokondriell kalcium signalering 9. Den huvudsakliga nackdelen med dessa genetiskt kodade prober är att de måste införas i cellerna genom transient expression (vilket inte är möjligt för vissa celltyper och kan ge olika resultat) eller genom att skapa stabila expressionssystem (som är tidskrävande).
För att kringgå problemen som beskrivits ovan, har vi utvecklat ett nytt protokoll för att mäta mitokondrie Ca2 + och ΔΨ m samtidigt. Detta protokoll är baserad på en tidigare beskriven metod som tillför exogen kalcium till permeabiliserade cellers = "xref"> 10. Vår protokoll har tre huvudsakliga fördelar jämfört med andra metoder: för det första, använder vi Fluo-4 AM och TMRM att övervaka mitokondrie Ca2 + och ΔΨ m, två färger som har mycket olika spektrala egenskaper; för det andra, är cellerna permeabiliseras så att Fluo-4 signal endast detektera mitokondriell Ca2 + och inte Ca2 + lokaliserade till andra organeller eller cellcytosolen; och för det tredje, användning av Fluo-4 för att detektera mitokondrie Ca2 + möjliggör snabb och enkel cellfärgning, skulle eventuella cell transfektion eller transformation frågor som finns om att använda genetiskt kodade sonder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av celler
- Växa celler på 10 cm cellodlingsskålar eller 75 cm 2 kolvar i odlingsmedier [10 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) kompletterat med 5% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS) och 1 x penicillin / streptomycin (P / S )] vid 37 ° C / 5% CO2.
- Att skörda celler, ta bort media genom aspiration, tvätta sedan med 5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS). Avlägsna 1x PBS genom aspiration och tillsätt sedan 1,5 ml 0,25% (vikt / vol) Trypsin / 0,25% (vikt / volym) etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och inkubera vid 37 ° C / 5% CO2 under 2 min. Knacka maträtt eller flaskan försiktigt för att avlägsna celler, sedan resuspendera i 5 ml odlingsmedium.
- Räkna celler genom att tillsätta 12 pl resuspenderade cellerna på en hemocytometer.
- Plate celler i rätter eller chambered täck för konfokal avbildning.
OBS: Dessa kommer att ha en lämplig plast eller glas botten som har utformats för användning med inverterade mikroskop. - Plate celler så thvid ~ 80% konfluens uppnås på dagen för avbildning. Exempelvis ungefär 2 x 10 4 143B osteosarkomceller kan utströks i en brunn i en 8-brunnars kammarobjektglas ett dygn före avbildning.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C / 5% CO2 för att tillåta cellerna att fästa och återhämta sig.
2. Buffertar för TMRM och Fluo-4 Imaging
- Förbereda Record Solution (RS) innehållande 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO 4, 1,25 mM KH 2 PO 4, 10 mM D-glukos, 2 mM CaCl2 och 10 mM HEPES pH 7,35. Förvara RS i alikvoter vid -20 ° C.
- Förbereda Intracellulär Medium (IM) innehållande 6 mM NaCl, 130 mM KCl, 7,8 mM MgCl2, 1 mM KH 2 PO 4, 0,4 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM målat, 2 mM glutamat, 2 mM ADP och 20 mM HEPES pH 7,1. 200 mM stamlösningar av målat, glutamat och ADP kan framställas separat, alikvoterades och lagrades vid -20 ° C. dessa stocks kan läggas till IM omedelbart före användning.
- Ca 2 + fri Hanks buffrade saltlösning (HBSS) kan erhållas i förväg framställd från kommersiella leverantörer. Lägg etylenglykol-bis (β-aminoetyleter) -N, N, N ', N'-tetraättiksyra (EGTA) till en slutlig koncentration av 500 | iM.
- Bered en förrådslösning av 10 mM tetrametylrodamin, metylester, perklorat (TMRM) i 100% metanol. Av denna utgångs, göra en fungerande lager av 2 ^ M i destillerat H2O
- Bered en förrådslösning av 10 mM Verapamil i 100% etanol.
- Bered en 1 mg / ml (vikt / volym) stamlösning av Fluo-4 acetoximetylester (Fluo-4, AM) i dimetylsulfoxid (DMSO).
OBS: Fluo-4, är AM en kalciumindikator som uppvisar ökad fluorescens vid bindning Ca2 +. Fluo-4 är en analog av fluo-3, med de två klorsubstituenter ersatta med fluoratomer. Detta resulterar i ökad fluorescens excitation vid 488 nm och högre fluorescenssignalnivåer. DeAM estergruppen resulterar i en oladdad Fluo-4-molekyl som kan tränga cellmembran. Väl inne i cellen, är AM-ester klyvs av ospecifika esteraser, vilket resulterar i en laddad form av Fluo-4 som är fångade i cellen. - Bered en stamlösning av 1 mM karbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) i 100% etanol.
- Bered en stamlösning av 25 mg / ml (vikt / volym) digitonin i destillerat H2O
- Bered en stamlösning av 100 iM tapsigargin i DMSO.
- Bered en förrådslösning av 40 mM kalciumklorid (CaCl2) i destillerat H2O
3. Färgning av celler med TMRM och Fluo-4 AM
- Förbereda RS färgningslösning med 20 nM TMRM, 5 | ig / ml (vikt / volym) Fluo-4, AM- och 0,005% ytaktivt medel såsom Pluronic F-127 i RS.
OBS: Denna tensid är en nonjonisk polyol som underlättar solubiliseringen av Fluo-4 AM. Obs: 10 iM Verapamil kan också tillsättas för att inhibit TMRM export av plasmamembranet multitransportör om det uttrycks i celltyp som analyseras. - Ta odlingsmedia från celler med pipett och tvätta med 100 ul 1x PBS.
- Ta 1x PBS med pipett och inkubera celler i 250 pl RS färglösningen under 45 minuter vid rumstemperatur.
OBS: När Fluo-4 AM in i cellen, AM ester klyvs av cellulära esteraser. Inkubation vid rumstemperatur hämmar esterasaktivitet, vilket Fluo-4 AM att ange mitokondrierna. - Ta bort RS färglösningen med pipett och tvätta cellerna i 100 ^ Ca2 + fri HBSS för att avlägsna överskott Fluo-4 AM och TMRM.
- Förbered IM avbildning lösning med 25 mikrogram / ml (vikt / volym) digitonin, 200 nM TMRM och en iM tapsigargin i IM.
OBS: Koncentrationen av digitonin kan behöva justeras för att säkerställa att permeabilisering av det mitokondriella innermembranet inte inträffar. Detta kan bestämmas empiriskt genom att utvärdera intensitetenav TMRM signalen vid olika koncentrationer av digitonin. - Avlägsna Ca2 + fri HBSS med pipett och tillsätt 300 pl IM avbildning lösning till cellerna. Lämna celler ekvilibrera vid rumstemperatur under 10 min. Cellerna är nu redo för avbildning med CaCl2 tillägg.
4. Cell Imaging
- Placera skålen eller kammare täck med celler i IM avbildning lösning på en inverterad laserskanning konfokalmikroskop.
- Använd inställningen på mikroskopet lasrar för excitation och emissionsspektra av TMRM och Fluo-4. Använd till exempel 543 nm He-Ne och 473 nm argon laserlinjer för att excitera TMRM och Fluo-4. Använda en låg lasereffekt av ungefär 5% för att minimera något foto-skada på cellerna.
- Ställ mikroskop för att skanna bilder varje 25 sek. Scan celler under 10 minuter för att fastställa baslinjen avläsningar för TMRM och Fluo-4 signaler.
OBS! Fluo-4-signalen kan vara svag eller odetekterbara vid vila kalcium concentransoner. - Tillsätt 3 | il av 40 mM CaCl 2 förrådslösning direkt till cellerna i 300 | il IM avbildning lösning (en 1: 100 spädning) och blanda försiktigt med en pipett. Pausa bildskanning samtidigt lägga till och blanda CaCl2 vid behov.
OBS: Den slutliga fri Ca2 + jonkoncentration [Ca2 +] i IM avbildning lösning kan beräknas med hjälp av programvara som Maxchelator WEBMAXC Extended ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) eller kelatbildande 11. En detaljerad beskrivning av hur man beräknar den slutliga fri Ca2 + jonkoncentration [Ca2 +] beskrivs i avsnitt 6 nedan. - Fortsätt bildskanning för cirka fyra minuter, sedan upprepa CaCl2 tillägg varje 4 min tills önskat TMRM eller Fluo-4 signaler uppnås, vanligtvis runt 8 till 10 tillägg.
- Med hjälp av en pipett till en 1: 100 spädning av 1 mM FCCP (slutlig concentration av 10 ^ M) direkt till cellerna för att skingra ΔΨ m. Bildceller för ytterligare 5 min. Experimentet är nu färdig.
5. Bildanalys
- När avbildning är klar, bestämma intensiteten av Fluo-4 och TMRM signaler med hjälp av bildanalys programvara, till exempel ImageJ programvara med Bio-format plugin (ladda ner "bioformats_package.jar" från http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / och spara den i "C: Program Files ImageJ plugins" mapp).
- Öppna bildfilen (t.ex. en .oif fil) i ImageJ. Klicka på markeringsverktyget och välj en region av intresse (ROI) som innehåller mitokondrier. Använd inledande TMRM signalen för att välja ROI.
- Öppna "Analysera> Verktyg> ROI Manager", klicka på "Lägg till" för att inkludera den valda ROI för intensitetsmätning. Flera ROI kan väljas på en enda bild för mätning. Upprepa föregående steg tills alla ROIs har lagts till i ROI Manager.
- Klicka på "Mer> Multi Measure", se till att "mäta alla skivor" väljs och att "en rad per skiva" är markerat och klicka sedan på "OK" för att få en tabell med genomsnittlig fluorescensintensitet av TMRM och Fluo-4 signaler för varje ROI vid varje tidpunkt.
- Använd data från alla ROI för att beräkna genomsnittsnivåerna och standardavvikelse för TMRM och Fluo-4 signaler.
6. Beräkning av slutlig fri Ca2 + jonkoncentration [Ca2 +]
- Den fria Ca2 + jonkoncentration [Ca2 +] i IM avbildning lösning kan bestämmas med hjälp av programvara som Maxchelator WEBMAXC Extended ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) eller kelatbildande 11. Till exempel ställa in variablerna i WEBMAXC UTÖKAT följande: Temperatur = 24 ° C, pH = 7.1, jonstyrka = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca2 + = 0,0004 M och Mg 2+ = 0,0078 M. Detta resulterar i en slutlig fri Ca2 + jonkoncentration [Ca2 +] av 62 nM . Observera att dessa program inte kan ta hänsyn till varje variabel, såsom reagens renhet, mätnoggrannheten och pH-bestämning. Den mest exakta metoden för att bestämma den fria Ca2 + -koncentrationen är att använda en kalibrerad Ca2 + selektiv elektrod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har använt detta protokoll för att undersöka effekterna av en MT-ND5 mutation på förmågan hos 143B cellens mitokondrier att buffra ökningar i kalcium 12. I nedanstående exempel har kontroll 143B-celler laddade med TMRM och Fluo-4, AM före permeabilisering med digitonin. Efter 5 min av avbildning, åtta sekventiella tillsatser av en 1: var 100-spädning av 40 mM exogena CaCl2 gjort, med den slutliga fria Ca2 + jonkoncentration [Ca2 +] beräknades.
Efter varje CaCl2 Dessutom minskar TMRM signalen som inflödet av Ca2 + joner i mitokondrierna avleder den mitokondriella membranpotential ΔΨ m (Figur 1). ΔΨ m återhämtar sedan som andning ökas för att bibehålla ΔΨ m. Detta sker fyra gånger efter varje CaCl
Den mitokondriella kalciumkoncentrationen (Fluo-4 signal) börjar öka efter den andra CaCl2 Dessutom när den fria [Ca2 +] i media når 0,32 pM (Figur 2). Varje efterföljande CaCl2 Dessutom orsakade en progressiv ökning av mitokondriell kalcium.
Bilder av samtidiga mätningar av ΔΨ m (TMRM, röd signal) och mitokondrie kalcium (Fluo-4, grön signal) visas (Figur 3).
Figur 1: Mätning av mitokondriell ΔΨ m digitonin permeabiliserade 143B-celler med hjälp av TMRM. 143B-celler förladdad med Fluo-4 AM och TMRM före permeabilisering med digitonin. En 1: 100 spädning av 40 mM exogena CaCl2 tillsattes i sekventiella alikvoter. Den slutliga fri [Ca 2 +] i media är indicerat för varje tillsats (*). FCCP tillsattes till en slutlig koncentration av 10 | iM efter ca 40 min. ΔΨ m visas i rött, som representeras av den relativa intensiteten (RI) i TMRM signalen. Data är medelvärde ± SD n = 3. Figur anpassas med tillstånd från 12 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mätning av mitokondriell kalcium i digitonin permeabiliserade 143B-celler med hjälp av Fluo-4 AM. 143B-celler förladdad med Fluo-4 AM och TMRM före permeabilisering med digitonin. En 1: 100 spädning av 40 mM exogena CaCl2 tillsattes i sekventiella alikvoter. Den slutliga fri [Ca 2 +] i media är indicerat för varje tillsats (*). FCCP tillsattes till en slutlig koncentration av 10 | iM efter ca 40 min. Mitochondrial kalcium visas i grönt, som representeras av den relativa intensiteten (RI) i Fluo-4-signalen. Data är medelvärde ± SD n = 3. Figur anpassas med tillstånd från 12 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Samtidig mätning av mitokondriell kalcium och ΔΨ m digitonin permeabiliserade 143B-celler med hjälp av Fluo-4 AM och TMRM. 143B-celler förladdad med Fluo-4 AM och TMRM före permeabilisering med digitonin. En 1: 100 spädning av 40 mM exogena CaCl2 tillsattes i sekventiella alikvoter. Den slutliga fri [Ca2 +] i media är indicerat för varje tillsats. Representativa konfokala bilder visar samtidig färgning av ΔΨ m (TMRM, röd) och mitokondrie kalcium (Fluo-4, grön). Observera att Fluo-4-signalen är svår att upptäcka vid vilande kalciumkoncentrationen av 0,062 M. Vit skala bar = 10 mikrometer. Figur anpassas med tillstånd från 12 referens.Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalcium spelar en avgörande roll i många cellprocesser, inklusive muskelsammandragning, neuronal signalering och celltillväxt 13. Ökningar i cellkalcium är ofta förknippade med energiefterfrågan, med kalcium kan direkt stimulera mitokondriell oxidativ fosforylering att höja ATP generation tre. Det är därför viktigt att vi har förmågan att effektivt övervaka mitokondrie kalcium anhopning och för att kunna jämföra hur denna funktion påverkas av både genetiska faktorer och farmakologiska medel.
Kritiska steg i protokollet
Detta protokoll beskriver förmågan att övervaka mitokondrier kalcium anhopning och ΔΨ m samtidigt med Fluo-4 AM och TMRM. Under färgningsprocessen är det kritiskt att inkubera cellerna vid rumstemperatur för att optimera effektiviteten av Fluo-4, AM vid detektering mitokondriellkalcium. Inkubation vid rumstemperatur minskar aktiviteten av cytosoliska esteraser, vilket gör att oladdade Fluo-4 AM att korsa mitokondriella membran och in i mitokondriematrisen. Omvänt, inkubation vid 37 ° C ökar esterasaktivitet i cytosolen, avspjälkning av AM ester att lämna en laddad Fluo-4 färgämne som inte skulle kunna passera mitokondriemembranen effektivt.
När cellfärgning har utförts cellerna ned i IM avbildning lösning. Denna lösning har en högre TMRM koncentration jämfört med den ursprungliga RS färglösningen. Nu att cellerna permeabiliserades, den TMRM inte längre i jämvikt över plasmamembranet. Därför TMRM koncentration upp i IM imaging lösning för att uppnå rätt jämvikt över mitokondrie inre membranet. Det är också viktigt att i detta skede omfatta tapsigargin i IM avbildning lösning. Tapsigargin blockerar endoplasmatiska nätverket (ER) Ca 2+ ATPas, se till att Fluo-4-signalen inte upptäcka ER kalcium.
Ändringar och felsökning
Vissa celltyper kan uttrycka multiresistens transportören (även känd som MDR1 eller P-glykoprotein) på deras plasmamembran. Detta protein är känt för att exportera fluorescerande indikatorer, inklusive AM esterderivat, från cytosolen ut ur cellen 14. Om transportören uttrycks både Fluo-4 AM och TMRM får exporteras från cellen cytosolen, vilket resulterar i suboptimal färgning. Att blockera denna effekt kan Verapamil läggas till RS färglösningen att blockera multiresistens transportören, vilket hämmar Fluo-4 AM och TMRM export under färgningsprocessen.
Genom permeabilisering av cellerna som skall analyseras, Fluo-4, AM kan användas för att detektera mitokondriell Ca2 +, med inga konkurrerande signaler från andra organeller eller cytosolen. Vi använder rutinmässigt den icke-joniska detergent digitonin för permeabilization vid en koncentration av 25 mikrogram / ml. Denna koncentration kan behöva justeras för att säkerställa att solubilisering av de mitokondriska membranen inte förekommer. Detta kan bestämmas empiriskt genom att utvärdera intensiteten av TMRM signalen vid olika koncentrationer av digitonin. Om koncentrationen av digitonin är för hög, kommer mitokondriemembranet vara delvis lösligt, vilket minskar TMRM signalen.
Begränsningar av tekniken
En av de främsta fördelarna med detta protokoll är att genom att använda Fluo-4, AM för att detektera mitokondrie kalcium, kan TMRM användas för att samtidigt mäta ΔΨ m, med försumbar spektral överlappning mellan de två färgämnena. För att säkerställa specificiteten av Fluo-4 för mitokondriell kalcium, varvid cellerna undersöks behov av att permeabiliserades att eliminera cytosoliska Fluo-4-signalen. Denna permeabilization är en begränsning av denna teknik. Medan IM avbildning lösning CLOsely matchar jonstyrkan hos cellcytosolen, kan den inte helt replikera alla dess beståndsdelar. Detta kan påverka resultatet om specifika cytosoliska komponenter erfordras i experimentella system som undersöks. Dessutom, eftersom cellerna permeabiliserades, protokollet kan inte vara lämplig för längre experiment större än en timme.
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Olika fluorescerande färgämnen har utvecklats för att bedöma mitokondrie kalcium 8. Dessa färgämnen är enkla att använda och kan ge användbara data i en kort tid. Även om dessa färgämnen ackumuleras huvudsakligen i mitokondrierna, kan en del också ackumuleras i andra organeller, inklusive liposomer, eller stanna kvar i cellen cytosolen. Därför måste försiktighet iakttas för att säkerställa att dessa andra signaler inte påverkar mitokondriella kalcium signalen.
I detta protokoll mitochondrial Ca 2 + mäts i permeabiliserade celler i närvaro av tapsigargin. Fördelen med denna metod är att de cytosoliska och ER kalcium signaler elimineras. Dessutom tillåter permeabilization användningen av Fluo-4 AM att upptäcka mitokondriella Ca2 +. Fluo-4, har AM väldigt lite spektral överlappning med TMRM, vilket innebär att mitokondriell Ca2 + och ΔΨ m kan mäta samtidigt med hjälp av dessa två färger.
Mitokondriell Ca2 + kan också mätas med användning av genetiskt kodade fluorescerande reportrar 8. Dessa reportrar kan riktas till mitokondrierna, vilket resulterar i specifika mitokondriella Ca 2 + -signaler. Genetiskt kodade prober måste införas i cellerna som studeras, vilket i vissa fall kan ta avsevärd tid och ansträngning. Omvänt, använder våra protokoll färgämnena Fluo-4, AM och TMRM, vilket möjliggör snabb och enkel cellfärgning för att mäta mitokondrie Ca
Framtida tillämpningar eller riktningar efter att behärska denna teknik
Mitokondrier fungerar som lokala kalcium buffertar för att reglera intracellulära kalciumkoncentrationer och kraven i cellens energi. När denna process avbryts, kan överdriven mitokondrie kalciumupptag inducerar mitokondriell permeabilitet övergång, vilket resulterar i kollaps av ΔΨ m och frisättning av pro-apoptotiska molekyler som utlöser celldöd induktion 4.
Vi presenterar en snabb och okomplicerad protokoll för undersökning av mitokondriell kalcium och dess relation till ΔΨ m och induktion av mitokondriell permeabilitet övergång. Detta kan användas för att undersöka hur dessa mitokondriella parametrar påverkar patogenesen i ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar, inklusive diabetes 15 och åldersrelateradneurodegeneration tillstånd såsom Alzheimers och Parkinsons sjukdom 16. Dessutom kan detta protokoll användas för att undersöka hur mitokondrie kalcium och ΔΨ m påverkas av genetiska defekter eller miljögifter, samt hur dessa påverkar kan moduleras genom behandlingar eller läkemedel som riktar mitokondrier. Dessa typer av framtida experiment kan ge viktiga nya insikter i den roll som mitokondriell kalcium spelar i både människors hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Kirstin Elgass och Dr Sarah Creed från Monash Micro Imaging för tekniskt stöd, och Wellcome Trust och Medical Research Council UK för ekonomiskt stöd. MMcK stöds Australian Research Council Future Fellowship Scheme (FT120100459), William Buckland Foundation, The Australian mitokondriesjukdomar Foundation (AMDF), Hudson Institute of Medical Research och Monash University. Detta arbete stöddes av den viktorianska regeringen Operational Infrastruktur Support Scheme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
