Summary
Mitokondrier kan utnytte det elektrokjemiske potensial over sin indre membran (Δ Ψm) binder kalsium (Ca2 +), slik at de kan forme cytosolisk Ca2 + signalering i cellen. Vi beskriver en metode for samtidig måling mitokondrier Ca 2+ opptak og ΔΨ M i levende celler ved hjelp av fluorescerende fargestoffer og konfokal mikroskopi.
Abstract
Bortsett fra sin avgjørende rolle i å generere ATP, mitokondrier også fungere som lokale kalsium (Ca 2+) buffere til tett regulere intracellulær Ca 2+ konsentrasjon. For å gjøre dette, mitokondrier utnytte elektrokjemiske potensial på tvers av deres indre membran (ΔΨ m) for å beslaglegge Ca 2+. Tilstrømningen av Ca2 + inn i mitokondriene stimulerer tre hastighetsbegrensende dehydrogenaser i sitronsyresyklusen, og øker elektronoverføring gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS) komplekser. Denne stimuleringen opprettholder ΔΨ m, som er midlertidig bort så de positive kalsiumioner krysse den mitokondrielle indre membran inn i den mitokondrielle matriks.
Vi beskriver her en metode for samtidig måling mitokondrier Ca 2+ opptak og ΔΨ M i levende celler ved hjelp av konfokal mikroskopi. Ved permeabilizing cellene, mitokondrielle Ca 2+ muligmåles ved hjelp av det fluorescerende Ca 2+ indikator Fluo-4, AM, med måling av ΔΨ m ved bruk av det fluorescerende fargestoff tetramethylrhodamine, metylester, perklorat (TMRM). Fordelen med dette systemet er at det er svært lite spektral overlapping mellom de fluoriserende fargestoffer, slik at nøyaktig måling av mitokondriell Ca 2+ og ΔΨ m samtidig. Ved hjelp av sekvensiell tilsetning av Ca 2 + aliquoter, mitokondrielle Ca 2+ opptak kan overvåkes, og den konsentrasjon ved hvilken Ca2 + induserer mitokondriemembranen permeabilitet overgang og tap av ΔΨ m bestemmes.
Introduction
Mitokondrier spiller en viktig rolle i regulering av intracellulær Ca2 + konsentrasjon ved å virke som lokale Ca 2 + 1 buffere. Ca 2 + kommer inn i mitokondriene via Ca2 + uniporter, en prosess som drives av den elektrokjemisk gradient som eksisterer på tvers av mitokondrie indre membran (ΔΨ m) 2. Inne mitokondrielle matriks, kan Ca 2+ aktivere oksidativ fosforylering ved å stimulere tre hastighetsbegrensende dehydrogenaser i sitronsyresyklusen tre. Denne stimuleringen opprettholder ΔΨ m, som er midlertidig bort så de positive kalsiumioner krysse den mitokondrielle indre membran inn i den mitokondrielle matriks. Dersom Ca2 + konsentrasjonen i mitokondriene blir meget høy, kan mitokondriell permeabilitet overgang initieres, noe som resulterer i spredning av ΔΨ m, den cessation av oksidativ fosforylering og induksjon av celledød signalveier 4.
Den viktige rollen som mitokondriene spiller i den romlige bufring av mobilnettet kalsium gjør nøyaktig overvåking av mitokondriell kalsium kritisk. Det er etablert forskjellige fremgangsmåter for å overvåke mitokondrie kalsium, herunder bruk av rhodamin baserte fargestoffer. En slik fargestoff, Rhod-2, AM, er ganske effektiv på partisjone til mitokondriene for å måle mitokondrielle Ca 2+ nivåer 5, 6. Det må imidlertid bli brukt som noen fargestoff vil samle seg i andre organeller, så som liposomer, eller forbli i cellen cytosol. Ikke desto mindre kan nedstrøms analyser anvendes for å skille disse signaler fra de fra mitokondrier 7.
En annen teknikk for å overvåke mitokondrie kalsium benytter fluorescerende reporter konstruerer 8 opp>. Nytten av disse genetisk kodede sonder er at de kan bli spesifikt rettet mot mitokondriene ved hjelp av endogene N-terminale peptider, for eksempel de N-terminale målretting signal av humant COX subenhet VIII. Dette systemet har blitt anvendt for å generere en mitokondrie-målrettet aequorin sonde som har vist seg å være svært nyttig for undersøkelse av mitokondrielle kalsiumsignalering 9. Den største ulempen med disse genetisk kodede sonder er at de trenger å bli introdusert inn i cellene ved transient ekspresjon (som ikke er mulig for visse celletyper, og kan gi varierende resultater), eller ved å opprette stabile ekspresjonssystemer (som er tidkrevende).
For å omgå problemene skissert ovenfor, har vi utviklet en ny protokoll for å måle mitokondrielle Ca 2+ og ΔΨ m samtidig. Denne protokollen er basert på en tidligere beskrevet metode som legger eksogene kalsium til permeabiliserte cellenes = "xref"> 10. Vår protokollen har tre fordeler fremfor andre metoder: For det første bruker vi Fluo-4, AM og TMRM å overvåke mitokondrielle Ca 2+ og ΔΨ m, to fargestoffer som har svært forskjellige spektrale egenskaper; for det andre, blir cellene permeabilisert slik at Fluo-4 signalet bare å detektere mitokondrie Ca 2+ og ikke Ca 2+ lokalisert til andre organeller eller cellen cytosolen; og for det tredje, bruk av Fluo-4 for å påvise mitokondrie Ca 2+ muliggjør rask og enkel cellefarging, benektende noen celle transfeksjonsteknologier eller transformasjons problemer som finnes ved bruk av genetisk kodet sonder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av celler
- Dyrke cellene på 10 cm cellekulturskåler eller 75 cm2 kolber i kulturmedium [10 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 5% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1 x penicillin / streptomycin (P / S )] ved 37 ° C / 5% CO2.
- Å høste celler, fjerner media ved aspirasjon, vask deretter med 5 ml 1x fosfatbufret saltvann (1x PBS). Fjern 1 x PBS ved aspirasjon, og deretter legge til 1,5 ml 0,25% (vekt / volum) trypsin / 0,25% (w / v) etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2 i 2 min. Trykk tallerken eller kolbe forsiktig for å fjerne celler, deretter resuspender i 5 ml dyrkningsmedier.
- Cellene telles ved å tilsette 12 ul av resuspenderte celler på et hemocytometer.
- Plate celler i retter eller kamret Dekk for confocal bildebehandling.
MERK: Disse vil ha en egnet plast eller glassbunn som er designet for bruk med inverterte mikroskoper. - Plate cellene slik thpå ~ 80% sammenflytning er oppnådd på dagen for avbildning. For eksempel, ca 2 x 10 4 143B osteosarkom celler kan være belagt i en brønn av en 8-brønn kammer lysbilde en dag før bildebehandling.
- Inkuber cellene over natten ved 37 ° C / 5% CO2 for å tillate cellene å feste og gjenopprette.
2. Buffere for TMRM og Fluo-4 Imaging
- Forbered Record Solution (RS) inneholdende 156 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgSO4, 1,25 mM KH 2PO 4, 10 mM D-glukose, 2 mM CaCl2 og 10 mM HEPES pH 7,35. Oppbevar RS i delmengder ved -20 ºC.
- Forbered Intracellulær Medium (IM) inneholdende 6 mM NaCl, 130 mM KCI, 7,8 mM MgCl2, 1 mM KH 2PO 4, 0,4 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM malat, 2 mM glutamat, 2 mM ADP og 20 mM HEPES pH 7,1. 200 mM stamløsninger av malat, glutamat og ADP kan fremstilles separat, delt i porsjoner og lagret ved -20 ° C. disse stocks kan legges til chat like før bruk.
- Ca2 + fri Hanks bufret saltoppløsning (HBSS) kan oppnås forhånds fremstilt fra kommersielle leverandører. Legg etylenglykol-bis (β-aminoetyl-eter) -N, N, N ', N'-tetraeddiksyre (EGTA) til en sluttkonsentrasjon på 500 uM.
- Fremstille en stamløsning av 10 mM tetramethylrhodamine, metylester, perklorat (TMRM) i 100% metanol. Fra dette lager, lage en fungerende lager av 2 mikrometer i destillert H 2 O.
- Forbered en stamløsning av 10 mM Verapamil i 100% etanol.
- Tilbered en 1 mg / ml (w / v) stamløsning av Fluo-4-acetoksymetyl-ester (Fluo-4 AM) i dimetylsulfoksyd (DMSO).
MERK: Fluo-4, er AM en kalsium-indikator som viser økt fluorescens etter binding Ca 2+. Fluo-4 er en analog av fluo-3, med de to klorsubstituenter erstattet med fluoratomer. Dette resulterer i øket fluorescens-eksitasjon ved 488 nm og fluorescens-høyere signalnivåer. DeAM ester gruppe resulterer i en uladet Fluo-4 molekyl som kan trenge cellemembraner. Inne i cellen, blir AM esteren spaltes ved hjelp av ikke-spesifikke esteraser, hvilket resulterer i en ladet form av Fluo-4 som er fanget inne i cellen. - Forbered en stamløsning av 1 mM karbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) i 100% etanol.
- Fremstille en stamløsning av 25 mg / ml (vekt / volum) digitonin i destillert H2O
- Forbered en stamløsning av 100 mikrometer thapsigargin i DMSO.
- Forbered en stamløsning av 40 mM kalsiumklorid (CaCl 2) i destillert H 2 O.
3. Farging av Celler med TMRM og Fluo-4, AM
- Fremstille RS fargeløsning med 20 nM TMRM, 5 ug / ml (vekt / volum) Fluo-4 AM og 0,005% overflateaktivt middel slik som Pluronic F-127 i RS.
MERK: Dette overflateaktive middel er et ikke-ionisk polyol som forenkler solubiliseringen av Fluo-4 AM. Merk: 10 mm Verapamil kan også legges til inhibit TMRM eksport av plasmamembranen multidrug transporter hvis det er uttrykt i celletype som analyseres. - Fjern kultur media fra celler med pipette og vask med 100 mL 1x PBS.
- Fjern 1 x PBS ved hjelp av pipette og inkuberes cellene i 250 pl RS fargeløsning i 45 minutter ved romtemperatur.
MERK: Når Fluo-4, går AM cellen blir AM ester kløyvde av cellulære esteraser. Inkubasjon ved romtemperatur hemmer esterase aktivitet, slik at Fluo-4, AM å gå inn i mitokondriene. - Fjern RS fargeløsning ved hjelp av pipette og vaske cellene i 100 pl Ca 2 + fri HBSS for å fjerne overskudd av Fluo-4 AM og TMRM.
- Forbered IM tenkelig løsning med 25 mikrogram / ml (w / v) digitonin, 200 nM TMRM og 1fiM thapsigargin i IM.
MERK: Konsentrasjonen av digitonin kan måtte justeres for å sikre at permeabiliseringen av mitokondrielle indre membran forekommer. Dette kan bestemmes empirisk ved å vurdere intensitetenav den TMRM signal ved forskjellige konsentrasjoner av digitonin. - Fjern det Ca2 + fri HBSS ved hjelp av pipette og tilsett 300 ul IM tenkelig løsning til cellene. La cellene komme i likevekt ved romtemperatur i 10 min. Cellene er nå klar for avbildning med CaCl 2 tilføyelser.
4. Cell Imaging
- Sett fatet eller kamret dekkglass med celler i IM tenkelig løsning på en omvendt laserskanning confocal mikroskop.
- Bruk innstillingen på mikroskop lasere for eksitasjon og emisjon spektra av TMRM og Fluo-4. For eksempel bruke 543 nm He-Ne og 473 nm argon laser linjer for å opphisse TMRM og Fluo-4 hhv. Bruke en lav lasereffekt på ca. 5% for å minimalisere enhver foto skade på cellene.
- Sett mikroskop for å skanne bilder hver 25 sek. Scan celler for 10 min å etablere baseline målinger for TMRM og Fluo-4 signaler.
MERK: Fluo-4-signalet kan være svakt eller umulig å oppdage ved hvile kalsium concentrasjoner. - Tilsett 3 pl 40 mM CaCl2 stamløsning direkte til cellene i 300 pl av IM tenkelig løsning (en 1: 100 fortynning), og bland forsiktig med en pipette. Pause bilde skanning samtidig legge og blanding av CaCl 2 om nødvendig.
MERK: Den endelige gratis Ca 2+ ion konsentrasjonen [Ca 2+] i IM tenkelig løsning kan beregnes ved hjelp av programvare som Maxchelator WEBMAXC UTVIDET ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) eller chelator 11. En detaljert beskrivelse av hvordan man beregner den endelige gratis Ca 2+ ion konsentrasjonen [Ca 2+] er beskrevet i punkt 6 nedenfor. - Fortsett bilde skanning for ca 4 min, og gjenta CaCl 2 filer hver 4 min til ønsket TMRM eller Fluo-4 signaler er nådd, vanligvis rundt 8 til 10 tilsetninger.
- Ved hjelp av en pipette, tilsett en 1: 100 fortynning av 1 mM FCCP (endelig concentration av 10 mm) direkte til cellene til å spre ΔΨ m. Bilde celler for en ytterligere 5 min. Eksperimentet er nå ferdig.
5. Bildeanalyse
- Når bildebehandling er fullført, bestemme intensiteten av Fluo-4 og TMRM signaler ved hjelp av bildeanalyse programvare, for eksempel ImageJ programvare med Bio-formater plugin (download 'bioformats_package.jar' fra http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / og lagre den i "C: Program Files ImageJ plugins-mappen).
- Åpne bildefilen (for eksempel en .oif fil) i ImageJ. Klikk på markeringsverktøy og velg en region av interesse (ROI) som inneholder mitokondrier. Bruk den første TMRM signal å velge ROI.
- Open 'Analyser> Verktøy> ROI Manager ", klikk" Legg til "for å inkludere den valgte ROI for intensitet måling. Flere ROIs kan velges på et enkelt bilde for måling. Gjenta foregående trinnene til alle ROIs har blitt lagt til ROI Manager.
- Klikk på "Mer> Multi Mål ', sørg for at" Mål alle skiver' er valgt, og at "One Row Per Slice 'er valgt, og klikk deretter på" OK "for å få en tabell over gjennomsnittlig fluorescerende intensitet av TMRM og Fluo-4 signaler for hver ROI ved hvert tidspunkt.
- Bruk data fra alle Rois å beregne den gjennomsnittlige intensiteter og standardavvik for TMRM og Fluo-4 signaler.
6. Beregning Final Free Ca 2+ Ion Konsentrasjon [Ca 2+]
- Den frie Ca 2+ ion konsentrasjonen [Ca 2+] i IM tenkelig løsning kan bestemmes ved hjelp av programvare som Maxchelator WEBMAXC UTVIDET ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) eller chelator 11. For eksempel sette variablene i WEBMAXC UTVIDET som følger: Temperatur = 24 ° C, pH = 7.1, ionestyrke = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca 2+ = 0,0004 M og Mg2 + = 0,0078 M. Dette resulterer i et endelig fritt Ca2 + ion-konsentrasjon [Ca2 +] i 62 nM . Legg merke til at disse programmene ikke kan ta hensyn til enhver variabel, slik som reagens renhet, nøyaktighet av målinger og pH-bestemmelse. Den mest nøyaktige metode for bestemmelse av frie Ca 2+ konsentrasjon på er å bruke en kalibrert Ca 2 + selektiv elektrode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har brukt denne protokollen for å undersøke effekten av en MT-ND5 mutasjon på evnen til 143B celle mitokondriene til buffer øker i kalsium 12. I det eksempel som er vist her, ble kontroll-143B-celler lastet med TMRM og Fluo-4 AM før permeabiliseringen med digitonin. Etter 5 min av avbildning, åtte sekvensielle tilsetninger av en 1: 100 fortynning ble 40 mM CaCl2 eksogene laget, med den endelige frie Ca2 + ion-konsentrasjon [Ca2 +] beregnet.
Etter hver CaCl2 tillegg TMRM signal avtar når tilstrømningen av Ca 2 + -ioner i mitokondriene avleder den mitokondrielle membranpotensiale ΔΨ m (figur 1). ΔΨ m gjenvinner så som åndedrett økes for å opprettholde ΔΨ m. Dette skjer fire ganger etter hver CaCl
Den mitokondrielle kalsiumkonsentrasjon (Fluo-4-signal) begynner å øke etter den andre CaCl2 tillegg når den fri [Ca2 +] i mediene når 0,32 uM (figur 2). Hver påfølgende CaCl2 tillegg forårsaket en progressiv økning i mitokondrie kalsium.
Bilder av de samtidige målinger av ΔΨ m (TMRM, rødt signal) og mitokondrielle kalsium (Fluo-4, grønn signal) er vist (figur 3).
Figur 1: Måling av mitokondriell ΔΨ m digitonin permeabilized 143B celler ved hjelp TMRM. 143B celler ble forhåndslastet med Fluo-4, AM og TMRM før permeabilization med digitonin. En 1: 100 fortynning av 40 mM CaCl 2 eksogene ble tilsatt i sekvensielle aliquoter. Den endelige frie [Ca 2+] i media er indisert for hvert tillegg (*). FCCP ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 uM etter omtrent 40 min. ΔΨ m er vist i rødt, representert ved den relative intensitet (RI) av TMRM signal. Dataene er gjennomsnitt ± SD n = 3. Figur er tilpasset med tillatelse fra referanse 12. Klikk her for å se et større versjon av dette tallet.
Figur 2: Måling av mitokondrie kalsium i digitonin permeabilized 143B celler ved hjelp Fluo-4, AM. 143B celler ble forhåndslastet med Fluo-4, AM og TMRM før permeabilization med digitonin. En 1: 100 fortynning av 40 mM CaCl 2 eksogene ble tilsatt i sekvensielle aliquoter. Den endelige frie [Ca 2+] i media er indisert for hvert tillegg (*). FCCP ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 uM etter omtrent 40 min. Mitokondriell kalsium er vist i grønt, representert ved den relative intensitet (RI) av Fluo-4-signal. Dataene er gjennomsnitt ± SD n = 3. Figur er tilpasset med tillatelse fra referanse 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Samtidig måling av mitokondriell kalsium og ΔΨ m digitonin permeabilized 143B celler ved hjelp av Fluo-4, AM og TMRM. 143B celler ble forhåndslastet med Fluo-4, AM og TMRM før permeabilization med digitonin. En 1: 100 fortynning av 40 mM CaCl 2 eksogene ble tilsatt i sekvensielle aliquoter. Den endelige frie [Ca 2+] i media er indisert for hvert tillegg. Representative confocal bilder som viser samtidig farging av ΔΨ m (TMRM, rød) og mitokondrielle kalsium (Fluo-4, grønn). Legg merke til at den Fluo-4-signal er vanskelig å detektere ved den hvilende kalsiumkonsentrasjon på 0,062 uM. Hvite skala barer = 10 mikrometer. Figuren er tilpasset med tillatelse fra referanse 12.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalsium spiller en avgjørende rolle i mange celleprosesser, inkludert muskel sammentrekning, neuronal signalering og celleproliferasjon 13. Økning i celle kalsiumkonsentrasjoner er ofte forbundet med energietterspørsel, med kalsium i stand til å direkte stimulere mitokondrie oksidativ fosforylering å øke ATP generasjon tre. Det er derfor viktig at vi har muligheten til å effektivt overvåke mitokondrie kalsium akkumulering og å kunne sammenligne hvordan denne funksjonen er påvirket av både genetiske faktorer og farmakologiske midler.
Kritiske trinnene i protokollen
Denne protokollen beskriver muligheten til å overvåke mitokondrier kalsium-akkumulering og ΔΨ m samtidig med Fluo-4 AM og TMRM. Under fargeprosessen er det viktig å inkubere cellene ved romtemperatur for å optimalisere effektiviteten til Fluo-4 AM ved påvisning av mitokondriellekalsium. Inkubasjon ved romtemperatur reduserer aktiviteten av cytosoliske esteraser, slik at uladet Fluo-4 AM for å krysse de mitokondrielle membraner og angi mitokondrielle matriks. Omvendt, inkubering ved 37 ° C øker esteraseaktivitet i cytosol, å spalte av AM ester til å forlate et ladet Fluo-4 fargestoff som ikke ville være i stand til å krysse den mitokondrielle membraner effektivt.
Når cellefarging har blitt utført, blir cellene neddykket i IM tenkelig løsning. Denne løsningen har en høyere konsentrasjon TMRM forhold til den opprinnelige RS fargeløsning. Nå at cellene permeabilisert, den TMRM ikke lenger likevekt over plasmamembranen. Derfor er TMRM konsentrasjonen oppvokst i IM tenkelig løsning for å oppnå riktig likevekt over mitokondrie indre membran. Det er også viktig på dette stadiet å inkludere thapsigargin i IM tenkelig løsning. Thapsigargin blokkerer endoplasmatiske retikulum (ER) Ca 2+ ATPase, som sikrer at Fluo-4-signalet ikke registrerer ER kalsium.
Modifikasjoner og feilsøking
Noen celletyper kan uttrykke den multimedikamentresistens transportør (også kjent som MDR1 eller P-glykoprotein) på deres plasmamembraner. Dette protein er kjent for å eksportere fluorescerende indikatorer, inkludert AM esterderivater, fra cytosol ut av cellen 14. Dersom transportør er uttrykt, både Fluo-4, AM og TMRM kan eksporteres fra cellen cytosol, noe som resulterer i sub-optimal farging. For å blokkere denne effekten, kan Verapamil tilsettes til RS fargeløsning for å blokkere den multimedikamentresistens transportøren, inhibering Fluo-4 AM og TMRM eksport under fargeprosessen.
Ved permeabilizing cellene som skal analyseres, Fluo-4 AM kan brukes til å detektere mitokondrielle Ca 2+, uten konkurrerende signaler fra andre organeller eller cytosol. Vi benytter rutinemessig det ikke-ioniske detergent digitonin for permeabiliseringen ved en konsentrasjon på 25 ug / ml. Denne konsentrasjon kan måtte justeres for å sikre at oppløseliggjøringen av mitokondrielle membraner ikke forekommer. Dette kan bestemmes empirisk ved å vurdere intensiteten av TMRM signal ved forskjellige konsentrasjoner av digitonin. Hvis konsentrasjonen av digitonin er for høy, vil mitokondriemembranen være delvis oppløst, noe som reduserer TMRM signal.
Begrensninger av teknikken
En av de viktigste fordelene med denne protokollen er at ved å bruke Fluo-4, AM å påvise mitokondrie kalsium, kan TMRM brukes til å samtidig måle ΔΨ m, med ubetydelig spektral overlapp mellom de to fargestoffer. For å sikre spesifisiteten av Fluo-4 for mitokondriell kalsium, blir cellene undersøkt trenger å bli permeabilisert for å eliminere den cytosoliske Fluo-4-signal. Dette permeabiliseringen er en begrensning av denne teknikken. Mens IM tenkelig løsning cloog omgir sams ionestyrken av cellen cytosol, kan det ikke helt replikere alle sine bestanddeler. Dette kan påvirke resultatet hvis bestemte cytosolic komponenter er påkrevd i den eksperimentelle systemet som undersøkes. Videre, ettersom cellene permeabilisert, protokollen kan ikke være egnet for lengre eksperimenter større enn 1 time.
Betydningen av teknikken med hensyn på eksisterende / alternative metoder
Ulike fluorescerende fargestoffer har blitt utviklet for å vurdere mitokondrie kalsium 8. Disse fargestoffer er enkel å bruke og kan gi nyttige data i løpet av kort tid. Selv om disse fargestoffer akkumuleres hovedsakelig i mitokondriene, noen kan også akkumuleres i andre organeller, inkludert liposomer, eller forbli i cellen cytosol. Derfor må det utvises forsiktighet for å sikre at disse andre signaler som ikke påvirker den mitokondrielle kalsium signal.
I denne protokollen, mitochondrial Ca 2+ måles i permeabiliserte celler i nærvær av thapsigargin. Fordelen med denne metoden er at de cytosoliske og ER kalsiumsignaler elimineres. Videre gir permeabiliseringen bruk av Fluo-4 AM for å detektere mitokondrielle Ca 2+. Fluo-4, har jeg veldig lite spektral overlapp med TMRM, noe som betyr at mitokondrie Ca 2+ og ΔΨ m kan måle samtidig ved hjelp av disse to fargestoffer.
Mitokondrielle Ca 2+ kan også måles ved hjelp av genetisk kodet fluorescerende reportere 8. Disse journalistene kan være rettet mot mitokondriene, noe som resulterer i konkrete mitokondrielle Ca 2+ signaler. Genetisk kodede probene trenger å bli introdusert inn i cellene som blir studert, som i noen tilfeller kan ta betydelig tid og anstrengelse. Omvendt bruker vår protokoll fargestoffer Fluo-4, AM og TMRM, noe som åpner for rask og enkel cellefarging å måle mitokondrielle Ca
Fremtidige applikasjoner eller retninger etter å mestre denne teknikken
Mitokondrier fungerer som lokale kalsium buffere til å regulere intracellulære kalsiumkonsentrasjoner og energibehovet i cellen. Når denne prosessen er forstyrret, kan overdreven mitokondrie kalsiumopptak indusere mitokondrie permeabilitet overgang, noe som resulterer i sammenbruddet av ΔΨ m og utgivelsen av pro-apoptotiske molekyler som utløser celledød induksjon 4.
Vi presenterer en rask og rett fram protokoll for undersøkelse av mitokondriell kalsium og dets forhold til ΔΨ m og induksjon av mitokondriell permeabilitet overgang. Dette kan brukes til å undersøke hvordan disse mitokondrielle parametrene påvirker patogenese i et bredt spekter av humane sykdommer, inklusive diabetes 15 og aldersrelatertnevrodegenerasjon tilstander som Alzheimers og Parkinsons sykdom 16. Videre kan denne protokollen brukes til å undersøke hvordan mitokondrie kalsium og ΔΨ m påvirkes av genetiske defekter eller miljøgifter, og også hvordan disse påvirker kan moduleres ved behandling eller medikamenter som er rettet mot de mitokondriene. Disse typer fremtidige eksperimenter kan gi viktig ny innsikt i rollen som mitokondrie kalsium spiller i både helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Dr Kirstin Elgass og Dr Sarah Creed fra Monash Micro Imaging for teknisk assistanse, og Wellcome Trust og Medical Research Council i Storbritannia for økonomisk støtte. MMcK er støttet den australske Forskningsrådet Future Fellowship Scheme (FT120100459), William Buckland Foundation, The Australian mitokondrie sykdom Foundation (AMDF), The Hudson Institute of Medical Research og Monash-universitetet. Dette arbeidet ble støttet av den viktorianske regjeringen Operational Infrastruktur støtteordning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
