Summary
Mitokondrier kan udnytte den elektrokemiske potentiale over deres indre membran (Δ Ψm) til at sekvestrere calcium (Ca2 +), der giver dem mulighed for at forme cytosoliske Ca2 + signalering i cellen. Vi beskriver en fremgangsmåde til samtidig måling mitokondrier Ca2 + uptake og ΔΨ M i levende celler under anvendelse af fluorescerende farvestoffer og konfokal mikroskopi.
Abstract
Bortset fra deres vigtige rolle i at generere ATP, mitokondrier fungerer også som lokal calcium (Ca2 +) buffere til streng regulering intracellulær Ca2 + -koncentration. For at gøre dette, mitokondrier udnytte elektrokemiske potentiale på tværs af deres indre membran (ΔΨ m) til at udskille Ca2 +. Tilstrømningen af Ca2 + i mitokondrierne stimulerer tre hastighedsbegrænsende dehydrogenaser af citronsyre cyklus, stigende elektronoverførsel gennem den oxidative phosphorylering (OXPHOS) komplekser. Denne stimulering fastholder ΔΨ m, som er midlertidigt spredes som de positive calciumioner krydse den mitokondriske indre membran i den mitokondriske matrix.
Vi beskriver her en metode til samtidig måling mitokondrier Ca 2+ optagelses- og ΔΨ M i levende celler ved hjælp af konfokal mikroskopi. Ved permeabilisering af cellerne, mitokondrie Ca2 + kanmåles ved hjælp af den fluorescerende Ca2 + indikator Fluo-4, AM, med måling af ΔΨ m ved hjælp af fluorescerende farvestof tetramethylrhodamin, methylester, perchlorat (TMRM). Fordelen ved dette system er, at der er meget lidt spektral overlapning mellem de fluorescerende farvestoffer, hvilket tillader nøjagtig måling af mitokondrie Ca2 + og ΔΨ m samtidigt. Brug af den sekventielle tilsætning af Ca2 + alikvoter, mitokondriel Ca2 + optagelse kan overvåges, og den koncentration, hvor Ca2 + inducerer mitokondriel membranpermeabilitet overgang og tabet af ΔΨ m bestemmes.
Introduction
Mitokondrier spiller en vigtig rolle i reguleringen af intracellulære Ca2 + -koncentration ved at fungere som lokale Ca2 + buffere 1. Ca2 + trænger ind i mitokondrierne via Ca2 + uniporter, en proces drevet af den elektrokemiske gradient, der findes i Den mitokondriske indre membran (ΔΨ m) 2. Inde i mitokondrielle matrix, kan Ca2 + aktivere oxidativ phosphorylering ved at stimulere tre hastighedsbegrænsende dehydrogenaser af citronsyre cyklus 3. Denne stimulering fastholder ΔΨ m, som er midlertidigt spredes som de positive calciumioner krydse den mitokondriske indre membran i den mitokondriske matrix. Hvis Ca2 + -koncentration i mitokondrierne bliver meget høj, kan mitokondriel permeabilitetsovergang initieres, hvilket resulterer i spredning af ΔΨ m, den cessation af oxidativ phosphorylering og induktion af celledød signalveje 4.
Den vigtige rolle, mitokondrier spille i den rumlige buffering af cellulær calcium gør nøjagtig overvågning af mitokondrie calcium kritisk. Der er etableret forskellige metoder til at overvåge mitokondrisk calcium, herunder anvendelse af rhodamin- baserede farvestoffer. Et sådant farvestof, Rhod-2, AM, er ganske effektiv til fordeling til mitokondrierne til måling mitochondriske Ca2 + niveau 5, 6. Dog skal man være brugt som nogle farvestof vil akkumulere i andre organeller, såsom liposomer, eller forblive i cellen cytosolen. Ikke desto mindre kan downstream analyser anvendes til at skelne disse signaler fra dem fra mitokondrierne 7.
En anden teknik til at overvåge mitokondrisk calcium anvender fluorescerende reporter-konstruktioner 8 op>. Fordelen ved disse genetisk indkodede prober er, at de specifikt kan målrettes mod mitokondrier ved hjælp endogene N-terminale peptider, f.eks targeting signal af human COX subunit VIII N-terminal. Dette system er blevet anvendt til at generere en mitochondrial-målrettet aequorin probe, som har vist sig særdeles nyttig til undersøgelse af mitokondriel calcium signalering 9. Den største ulempe ved disse genetisk indkodede prober er, at de skal indføres i cellerne ved forbigående ekspression (som ikke er mulig for visse celletyper og kan give variable resultater) eller ved at skabe stabile ekspressionssystemer (som er tidskrævende).
For at omgå de ovenfor beskrevne problemer, har vi udviklet en ny protokol til måling af mitokondrie Ca 2+ og ΔΨ m samtidigt. Denne protokol er baseret på en tidligere beskrevet fremgangsmåde, der tilføjer exogent calcium til permeabiliserede cellers = "xref"> 10. Vores protokol har tre fordele frem for andre metoder: For det første bruger vi Fluo-4, AM og TMRM at overvåge mitokondrie Ca 2+ og ΔΨ m, to farvestoffer, der har meget forskellige spektrale egenskaber; dels cellerne permeabiliseret således at Fluo-4 signal kun detektere mitokondriske Ca2 + og ikke Ca2 + lokaliseret til andre organeller eller cellecytosolen; og for det tredje anvendelse af Fluo-4 til at detektere mitokondrisk Ca2 + muliggør hurtig og enkel celle-farvning, at bevirke nogen celle transfektions- eller transformation problemer, der forekommer, hvis hjælp genetisk indkodede prober.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse Celler
- Grow celler på 10 cm cellekulturskåle eller 75 cm2 kolber i dyrkningsmedier [10 ml Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) suppleret med 5% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1 x penicillin / streptomycin (P / S )] ved 37 ° C / 5% CO2.
- At høste celler, fjerne mediet ved aspiration, vask derefter med 5 ml 1x phosphatpufret saltvand (1x PBS). Fjern 1x PBS ved aspiration, hvorefter der tilsættes 1,5 ml 0,25% (vægt / volumen) trypsin / 0,25% (vægt / volumen) ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2 i 2 min. Tap skål eller kolbe forsigtigt for at fjerne celler, derefter resuspenderes i 5 ml dyrkningsmedium.
- Tæl celler ved tilsætning af 12 pi resuspenderede celler på et hæmocytometer.
- Plate celler i retter eller kamre dækglas til konfokal billeddannelse.
BEMÆRK: Disse vil have en egnet plast eller glas bund, der er designet til brug med omvendte mikroskoper. - Plate celler så thpå ~ opnås 80% konfluens på dagen for billeddannelse. For eksempel ca. 2 x 10 4 143B osteosarkomceller kan udplades i en brønd af en 8-brønds kammer slide én dag før billeddannelse.
- Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C / 5% CO2 for at tillade celler at vedhæfte og komme sig.
2. Buffere til TMRM og Fluo-4 Imaging
- Forbered Record Solution (RS) indeholdende 156 mM NaCl, 3 mM KCI, 2 mM MgSO4, 1,25 mM KH 2 PO 4, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl2 og 10 mM HEPES pH 7,35. Opbevar RS i portioner ved -20 ºC.
- Forbered Intracellulær Medium (IM) indeholdende 6 mM NaCl, 130 mM KCI, 7,8 mM MgCl2, 1 mM KH 2 PO 4, 0,4 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 10 mM HEDTA, 2 mM malat, 2 mM glutamat, 2 mM ADP og 20 mM HEPES pH 7,1. 200 mM stamopløsninger af malat, glutamat og ADP kan fremstilles separat, alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C. Disse stocks kan sættes til IM lige før brug.
- Ca kan opnås 2+ fri Hanks pufrede saltopløsning (HBSS) allerede forberedt fra kommercielle leverandører. Tilføj ethylenglycol-bis (β-aminoethylether) -N, N, N ', N'-tetraeddikesyre (EGTA) til en slutkoncentration på 500 uM.
- Der fremstilles en stamopløsning af 10 mM tetramethylrhodamin, methylester, perchlorat (TMRM) i 100% methanol. Fra denne bestand, gøre en arbejdsgruppe bestand af 2 uM i destilleret H2O
- Forbered en stamopløsning af 10 mM Verapamil i 100% ethanol.
- Der fremstilles en 1 mg / ml (vægt / volumen) stamopløsning af Fluo-4 acetoxymethylester (Fluo-4, AM) i dimethylsulfoxid (DMSO).
BEMÆRK: Fluo-4, AM er en calcium indikator, der udviser forøget fluorescens ved binding Ca2 +. Fluo-4 er en analog af fluo-3, med de to chlorsubstituenter erstattet af fluoratomer. Dette resulterer i forøget fluorescens excitation ved 488 nm og højere fluorescens signalniveauer. DetAM ester gruppe resulterer i en uopladet Fluo-4 molekyle, der kan trænge cellemembraner. Inde i cellen er AM-ester spaltes af ikke-specifikke esteraser, hvilket resulterer i en ladet form af Fluo-4, der er fanget inden i cellen. - Forbered en stamopløsning af 1 mM carbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) i 100% ethanol.
- Der fremstilles en stamopløsning af 25 mg / ml (vægt / volumen) digitonin i destilleret H2O
- Forbered en stamopløsning på 100 uM thapsigargin i DMSO.
- Der fremstilles en stamopløsning af 40 mM calciumchlorid (CaCl2) i destilleret H2O
3. Farvning af celler med TMRM og Fluo-4, AM
- Forbered RS farvningsopløsning med 20 nM TMRM, 5 ug / ml (vægt / volumen) Fluo-4, AM og 0,005% overfladeaktivt middel, såsom Pluronic F-127 i RS.
BEMÆRK: Denne tensid er et ikke-ionisk polyol, der letter opløsningen af Fluo-4, AM. Bemærk: 10 pM Verapamil kan også sættes til inhibit TMRM eksport af plasmamembranen multilægemiddeltransportøren hvis det udtrykkes i celletypen, der analyseres. - Fjern dyrkningsmedier fra celler ved pipette og vaskes med 100 pi 1x PBS.
- Fjern 1x PBS med pipette og inkuberes celler i 250 pi RS farvningsopløsning i 45 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Når Fluo-4, AM kommer ind i cellen, er AM-ester spaltes af cellulære esteraser. Inkubering ved stuetemperatur inhiberer esteraseaktivitet, så Fluo-4, AM at indtaste mitokondrier. - Fjern RS farvningsopløsning med pipette og vaskes celler i 100 pi Ca2 + fri HBSS for at fjerne overskydende Fluo-4, AM og TMRM.
- Forbered IM imaging opløsning med 25 ug / ml (vægt / volumen) digitonin, 200 nM TMRM og 1 uM thapsigargin i IM.
BEMÆRK: Koncentrationen af digitonin skal måske justeres for at sikre, at permeabilisering af den mitokondriske indre membran ikke forekommer. Dette kan bestemmes empirisk ved at vurdere intensitetenaf TMRM signal ved forskellige koncentrationer af digitonin. - Fjern Ca2 + fri HBSS med pipette, og der tilsættes 300 pi IM imaging løsning til cellerne. Efterlad celler ækvilibrere ved stuetemperatur i 10 min. Celler er nu klar til billeddannelse med CaCl2 tilføjelser.
4. Cell Imaging
- Placer skål eller kamre dækglas med celler i IM billeddannelse opløsningen på en omvendt laser scanning konfokal mikroskop.
- Brug indstillingen på mikroskop lasere til excitation og emission spektre af TMRM og Fluo-4. Brug for eksempel 543 nm He-Ne og 473 nm argon laserlinjer at ophidse TMRM og Fluo-4. Bruge en lav lasereffekt på cirka 5% for at minimere enhver foto- beskadigelse af cellerne.
- Sæt mikroskop for at scanne billeder hver 25 sek. Scan celler i 10 minutter for at etablere baseline aflæsninger for TMRM og Fluo-4 signaler.
BEMÆRK: Fluo-4 signalet kan være svagt eller målbart på hvile calcium concentrationer. - Tilsæt 3 pi 40 mM CaCl2 stamopløsning direkte til cellerne i 300 pi IM imaging-opløsning (1: 100 fortynding) og blandes forsigtigt med en pipette. Pause scanning billedet samtidig med at tilføje og blande CaCl2 om nødvendigt.
BEMÆRK: Den sidste frie Ca2 + ion koncentration [Ca 2+] i IM imaging løsning kan beregnes ved hjælp af software som Maxchelator WEBMAXC UDVIDET ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) eller chelator 11. En detaljeret beskrivelse af hvordan man beregner det endelige fri Ca2 + ion koncentration [Ca 2+] er beskrevet i afsnit 6 nedenfor. - Fortsæt billede scanning for ca 4 min, derefter gentage CaCl2 tilføjelser hver 4 min, indtil den ønskede TMRM eller Fluo-4 signaler er nået, normalt omkring 8 til 10 tilføjelser.
- Ved hjælp af en pipette, tilføje en 1: 100 fortynding på 1 mM FCCP (endelig concentration af 10 uM) direkte til cellerne til at sprede ΔΨ m. Billedceller i yderligere 5 min. Forsøget er nu færdig.
5. Image Analysis
- Når billeddannelse er færdig, fastlægge intensiteten af Fluo-4 og TMRM signaler ved hjælp af billedanalyse software, for eksempel ImageJ software med Bio-formater plugin (download "bioformats_package.jar 'fra http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / og gemme det i C: Program Files ImageJ plugins 'mappe).
- Åbn imaging fil (for eksempel en .oif fil) i ImageJ. Klik på markeringsværktøjet og vælge et område af interesse (ROI), der indeholder mitokondrier. Brug den indledende TMRM signal at vælge ROI.
- Åbn 'Analyser> Værktøjer> ROI Manager ", klik på' Tilføj 'for at inkludere den valgte ROI for intensitet måling. Flere ROIs kan vælges på et enkelt billede til måling. Gentag forrige trin, indtil alle ROIs er blevet føjet til ROI Manager.
- Klik på "Mere> Multi Measure", skal du sørge for, at "Mål alle skiver« er valgt, og at "One Row Per Slice 'er fravalgt, og klik derefter på' OK 'for at få en tabel over gennemsnitlig fluorescensintensitet af TMRM og Fluo-4 signaler for hver ROI på hvert tidspunkt.
- Brug data fra alle ROI'er at beregne de gennemsnitlige intensiteter og standardafvigelse for TMRM og Fluo-4 signaler.
6. Beregning af Final Gratis Ca 2 + Ion Koncentration [Ca 2+]
- Den frie Ca2 + ion koncentration [Ca 2+] i IM imaging løsning kan bestemmes ved hjælp af software, såsom Maxchelator WEBMAXC UDVIDET ( http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html ) eller chelator 11. For eksempel sætte variablerne i WEBMAXC EXTENDED som følger: Temperatur = 24 ° C, pH = 7.1, ionstyrke = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca2 + = 0,0004 M og Mg2 + = 0,0078 M. Dette resulterer i en endelig frit Ca2 + ionkoncentration [Ca2 +] i 62 nM . Bemærk, at disse programmer ikke kan tage hensyn til hver variabel, såsom reagens renhed, nøjagtighed af målinger og pH beslutsomhed. Den mest nøjagtige metode til bestemmelse af fri Ca2 + -koncentration er at bruge en kalibreret Ca2 + elektrode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har brugt denne protokol til at undersøge virkningerne af en MT-ND5 mutation på evnen af 143B celle mitokondrier til buffer stigninger i calcium 12. I det viste eksempel blev kontrol 143B-celler fyldt med TMRM og Fluo-4, AM før permeabilisering med digitonin. Efter 5 min på billedbehandling, otte sekventielle tilsætninger af en 1: blev 100 fortynding af 40 mM exogene CaCl2 foretaget, med den endelige frie Ca2 + ionkoncentration [Ca2 +] beregnes.
Efter hver CaCl2 Desuden nedsætter TMRM signal som tilstrømningen af Ca2 + -ioner i mitokondrierne spreder den mitokondriske membranpotentiale ΔΨ m (Figur 1). ΔΨ m genvinder derefter som respiration øges for at opretholde ΔΨ m. Dette sker fire gange efter hver CaCl
Mitokondrier calciumkoncentration (Fluo-4 signal) begynder at stige efter den anden CaCl2 tilsætning når den frie [Ca2 +] i medierne når 0,32 uM (figur 2). Hver efterfølgende CaCl2 Desuden forårsagede en progressiv stigning i mitokondrie calcium.
Billeder af samtidige målinger af ΔΨ m (TMRM, rødt signal) og mitokondrie calcium (Fluo-4, grøn SIGudg) er vist (figur 3).
Figur 1: Måling af mitokondrie ΔΨ m i digitonin permeabiliserede 143B celler ved hjælp TMRM. 143B-celler blev præinstalleret med Fluo-4, AM og TMRM før permeabilisering med digitonin. En 1: 100 fortynding af 40 mM exogene CaCl2 blev tilsat i sekventielle alikvoter. Den endelige free [Ca2 +] i medierne er indiceret til hver tilsætning (*). FCCP blev tilsat til en slutkoncentration på 10 uM efter ca. 40 min. ΔΨ m er vist med rødt, repræsenteret ved den relative intensitet (RI) i TMRM signal. Dataene er gennemsnit ± SD n = 3. Figur er tilpasset med tilladelse fra henvisning 12. Klik her for at se et større version af dette tal.
Figur 2: Måling af mitokondrie calcium i digitonin permeabiliserede 143B celler under anvendelse Fluo-4, AM. 143B-celler blev præinstalleret med Fluo-4, AM og TMRM før permeabilisering med digitonin. En 1: 100 fortynding af 40 mM exogene CaCl2 blev tilsat i sekventielle alikvoter. Den endelige free [Ca2 +] i medierne er indiceret til hver tilsætning (*). FCCP blev tilsat til en slutkoncentration på 10 uM efter ca. 40 min. Mitokondrie calcium er vist i grøn, repræsenteret ved den relative intensitet (RI) i Fluo-4 signal. Dataene er gennemsnit ± SD n = 3. Figur er tilpasset med tilladelse fra henvisning 12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Samtidig måling af mitokondrie calcium og ΔΨ m i digitonin permeabiliserede 143B-celler under anvendelse af Fluo-4, AM og TMRM. 143B-celler blev præinstalleret med Fluo-4, AM og TMRM før permeabilisering med digitonin. En 1: 100 fortynding af 40 mM exogene CaCl2 blev tilsat i sekventielle alikvoter. Den endelige free [Ca2 +] i medierne er indiceret til hver tilsætning. Repræsentative konfokale billeder, der viser den samtidige farvning af ΔΨ m (TMRM, rød) og mitokondrie calcium (Fluo-4, grøn). Bemærk, at Fluo-4 signal er svært at opdage på hvilende calcium koncentration på 0,062 uM. Hvide skala barer = 10 um. Figur er tilpasset med tilladelse fra henvisning 12.Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Calcium spiller en kritisk rolle i mange celleprocesser, herunder muskelkontraktion, neuronal signalering og celleproliferation 13. Stigninger i celle calciumkoncentrationer er ofte forbundet med energiefterspørgslen, med calcium i stand til direkte at stimulere mitokondriel oxidativ phosphorylering at hæve ATP generation 3. Det er derfor vigtigt, at vi har evnen til effektivt at overvåge mitokondrie calcium ophobning og at være i stand til at sammenligne, hvordan denne funktion påvirkes af både genetiske faktorer og farmakologiske agenter.
Kritiske trin i protokollen
Denne protokol beskriver muligheden for at overvåge mitokondrier calcium ophobning og ΔΨ m samtidig med Fluo-4, AM og TMRM. Under farvningen processen er det kritisk at inkubere cellerne ved stuetemperatur for at optimere effektiviteten af Fluo-4, AM i detektering mitokondriecalcium. Inkubation ved stuetemperatur nedsætter aktiviteten af cytosoliske esteraser, så det uladede Fluo-4, AM at passere de mitochondriske membraner og indtast mitokondrielle matrix. Omvendt inkubation ved 37 ° C forøger esteraseaktivitet i cytosolen, fraspaltning af AM ester at efterlade en ladet Fluo-4 farvestof, der ikke ville kunne passere de mitokondriske membraner effektivt.
Når cellefarvning er udført cellerne nedsænket i IM imaging opløsning. Denne løsning har en højere TMRM koncentration end den oprindelige RS farveopløsning. Nu hvor cellerne permeabiliseres, den TMRM ikke længere equilibrates over plasmamembranen. Derfor er koncentrationen TMRM rejst i IM imaging løsning til at opnå den korrekte ækvilibrering over mitokondriske indre membran. Det er også kritisk på dette stadium at omfatte thapsigargin i IM imaging løsning. Thapsigargin blokerer det endoplasmatiske reticulum (ER) Ca 2+ ATPase, der sikrer, at den Fluo-4 signalet ikke detektere ER calcium.
Ændringer og fejlfinding
Nogle celletyper kan udtrykke multiresistens transporter (også kendt som MDR1 eller P-glycoprotein) på deres plasmamembraner. Dette protein er kendt for at eksportere fluorescerende indikatorer, herunder AM esterderivater, fra cytosolen ud af cellen 14. Hvis transportøren er udtrykt, både Fluo-4, AM og TMRM kan eksporteres fra cellen cytosolen, hvilket resulterer i suboptimal farvning. Hvis du vil blokere denne effekt, kan Verapamil føjes til RS farvning løsning til at blokere multiresistens transporteren, hæmme Fluo-4, AM og TMRM eksport under farvningen processen.
Ved permeabilisering af cellerne, der skal analyseres, Fluo-4, AM kan anvendes til påvisning af mitochondrial Ca2 +, med ingen konkurrerende signaler fra andre organeller eller cytosolen. Vi anvender rutinemæssigt den nonioniske detergent digitonin til permeabilisering ved en koncentration på 25 ug / ml. Denne koncentration kan være nødvendigt at justere for at sikre, at solubilisering af de mitochondriske membraner forekommer ikke. Dette kan bestemmes empirisk ved at vurdere intensiteten af TMRM signal ved forskellige koncentrationer af digitonin. Hvis koncentrationen af digitonin er for høj, vil den mitokondriske membran være delvist opløseliggjort, hvilket reducerer TMRM signal.
Begrænsninger af teknikken
En af de vigtigste fordele ved denne protokol er, at ved hjælp af Fluo-4, AM at opdage mitokondrie calcium, kan TMRM anvendes til samtidigt at måle ΔΨ m, med ubetydelig spektral overlapning mellem de to farvestoffer. At sikre specificiteten af Fluo-4 for mitokondrie calcium, idet cellerne undersøgt nødvendigt at permeabiliseres for at eliminere den cytosoliske Fluo-4 signal. Denne permeabilisering er en begrænsning af denne teknik. Mens IM imaging løsning closely matcher ionstyrke cellecytosolen, kan det ikke fuldstændigt replikere alle dens bestanddele. Dette kan påvirke resultaterne, hvis specifikke cytosoliske komponenter er nødvendige i den eksperimentelle system, der undersøges. Som cellerne permeabiliseret, protokollen må ikke være egnet til længere eksperimenter større end 1 time.
Betydningen af teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder
Forskellige fluorescerende farvestoffer er blevet udviklet til at vurdere mitokondrie calcium 8. Disse farvestoffer er enkle at bruge og kan give nyttige data i løbet af kort tid. Mens disse farvestoffer ophobes overvejende mitokondrier, kan nogle også ophobes i andre organeller, herunder liposomer, eller forblive i cellen cytosolen. Derfor skal man være omhyggelig for at sikre, at disse andre signaler ikke påvirker mitokondrisk calcium signal.
I denne protokol, mitochondrIAL Ca2 + måles i permeabiliserede celler i nærvær af thapsigargin. Fordelen ved denne metode er, at cytosoliske og ER calciumsignaler elimineres. Endvidere permeabilisering tillader brug af Fluo-4, AM for at detektere mitochondrial Ca2 +. Fluo-4, AM har meget lidt spektral overlapning med TMRM, hvilket betyder, at mitokondriel Ca2 + og ΔΨ m kan måle samtidigt ved anvendelse af disse to farvestoffer.
Mitochondrial Ca2 + kan også måles under anvendelse af genetisk indkodede fluorescerende reportere 8. Disse reportere kan målrettes til mitokondrierne, hvilket resulterer i specifikke mitokondrie Ca2 + signaler. Genetisk indkodede prober skal indføres i cellerne, der undersøges, som i nogle tilfælde kan tage megen tid og energi. Omvendt vores protokol anvender farvestofferne Fluo-4, AM og TMRM, der giver mulighed for hurtig og enkel celle-farvning til måling mitochondrial Ca
Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering denne teknik
Mitokondrier fungerer som lokale calcium buffere til at regulere intracellulære calciumkoncentrationer og energibehov cellen. Når denne er afbrudt, kan overdreven mitokondrie calciumoptagelse inducerer mitokondriel permeabilitetsovergang, hvilket resulterer i sammenbrud ΔΨ m og frigivelse af pro-apoptotiske molekyler der udløser celledød induktion 4.
Vi præsenterer en hurtig og ligetil protokol til undersøgelse af mitokondrie calcium og dens forhold til ΔΨ m og induktion af mitokondrie permeabilitet overgang. Dette kan anvendes til at undersøge, hvordan disse mitochondriale parametre påvirke patogenesen i en lang række humane sygdomme, herunder diabetes 15 og aldersrelateretneurodegeneration sygdomme som Alzheimers og Parkinsons sygdom 16. Endvidere kan denne protokol bruges til at undersøge, hvordan mitokondrie calcium og ΔΨ m påvirkes af genetiske defekter eller miljømæssige toksiner, og også hvordan disse påvirker kan moduleres af terapier eller lægemidler, der rammer mitokondrier. Disse typer af fremtidige eksperimenter kan give vigtige nye indsigter i den rolle, som mitokondrie calcium spiller i både menneskers sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Kirstin Elgass og Dr. Sarah Creed fra Monash Micro Imaging til teknisk bistand, og Wellcome Trust og Medical Research Council UK for økonomisk støtte. MMcK understøttes den australske Forskningsråd Future Fellowship Scheme (FT120100459), William Buckland Foundation, The Australian mitokondrie Disease Foundation (AMDF), The Hudson Institute of Medical Research og Monash University. Dette arbejde blev støttet af den victorianske regering Support operationelle infrastruktur Scheme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 | |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 | |
| 0.25% Trypsin/0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 | |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 | |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 | |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 | |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP | |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 | |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 | |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
