Se presenta un protocolo para aislar fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo que representan unidades de vascularización prometedores. Se pueden aislar rápidamente, no requieren en el procesamiento vitro y, por tanto, puede ser utilizado para prevascularization de un solo paso en diferentes campos de la ingeniería de tejidos.
Una red microvascular funcional es de importancia fundamental para la supervivencia y la integración de construcciones de tejido de ingeniería. Para este fin, se han establecido varias estrategias angiogénicos y prevascularization. Sin embargo, la mayoría de los enfoques basados en células incluyen pasos que consumen tiempo in vitro para la formación de una red microvascular. Por lo tanto, no son adecuados para los procedimientos de un solo paso intraoperatorias. fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo (AD-MVF) representan unidades de vascularización prometedores. Ellos pueden ser fácilmente aisladas de tejido graso y exhiben una morfología de microvasos funcional. Por otra parte, volver a montar rápidamente en nuevas redes microvasculares después de la implantación in vivo. Además, ad-MVF han demostrado inducir la linfangiogénesis. Por último, son una fuente rica de células madre mesenquimatosas, que pueden contribuir además a su alto potencial de la vascularización. En estudios previos se ha demostrado la notable vascularizatien la capacidad de ad-MVF en sustitutos de hueso y piel de ingeniería. En el presente estudio, se presenta en un protocolo estandarizado para el aislamiento enzimático de ad-MVF de tejido adiposo murino.
La ingeniería de tejidos se centra en la fabricación de tejidos y órganos sustitutos que mantener, restaurar o aumentar la función de inoperable en homólogos in vivo 1, 2. El destino de las construcciones de ingeniería tisular depende fundamentalmente de una vascularización adecuada 3. Redes microvasculares dentro de estas construcciones deben ser organizados jerárquicamente con arteriolas, capilares y vénulas para permitir la perfusión de la sangre eficiente después de inosculation a la vasculatura 4 del destinatario. La generación de este tipo de redes es uno de los desafíos clave en la ingeniería de tejidos. Para este fin, un amplio espectro de estrategias de vascularización experimentales se ha introducido en las últimas dos décadas 5, 6.
enfoques angiogénicos estimulan el crecimiento interno de microvasos los destinatarios de forma TISS ingenieríaues por medio de modificación andamiaje estructural o fisicoquímicas, tales como la incorporación de factores de crecimiento 7. Sin embargo, para la vascularización de las grandes construcciones tridimensionales, las estrategias dependientes de la angiogénesis están marcadamente limitados por bajas tasas de crecimiento de desarrollo de microvasos 8.
Por el contrario, el concepto de prevascularization apunta a la generación de redes microvasculares funcionales dentro del tejido construye antes de su implantación 9. Prevascularization convencional implica el co-cultivo de células formadoras de vasos, tales como células endoteliales, células murales o células madre 10, dentro de andamios. Después de la formación de la red microvascular, las construcciones prevascularizados entonces se pueden implantar en los defectos del tejido. Digno de mención, este enfoque prevascularization es difícil de aplicar en un entorno clínico, ya que se basa en la compleja y lenta in vitro </ em> los procedimientos que se encuentran restringidos por los principales obstáculos regulatorios 9. En consecuencia, todavía hay una necesidad para el desarrollo de nuevas estrategias prevascularization que son más adecuados para una amplia aplicación clínica.
Tal estrategia prevascularization puede ser la aplicación de los fragmentos de microvasculares derivadas de tejido adiposo (ad-MVF). ad-MVF representan unidades de vascularización potentes que pueden ser cosechados en grandes cantidades desde el tejido graso de ratas 11, 12 y 13 ratones. Se componen de arteriolar, capilar, y segmentos de vasos venulares, que exhiben una morfología de microvasos fisiológica con un lumen y la estabilización de células perivasculares 14, 15. Esta característica única permite la implantación inmediata de andamios ad-MVF cabeza de serie en defectos de tejidos sin cultivo previo. Allí, el ad-MVF volver a montar rápidamente ena las redes microvasculares funcionales. Además, ad-MVF representan una fuente rica de células madre mesenquimales 16, que pueden contribuir adicionalmente a su capacidad regenerativa llamativo. En consecuencia, ad-MVF se utilizan cada vez más en diferentes campos de la ingeniería de tejidos 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
El aislamiento de ad-MVF originalmente se ha establecido en ratas 11, 12. En este documento, se describe un protocolo, que permite el aislamiento normalizado de murino ad-MVF de almohadillas de grasa del epidídimo. Esto puede proporcionar más conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la función ad-MVF mediante el uso de modelos de ratones transgénicos.
En este estudio se presenta un protocolo bien establecido para el aislamiento de ad-MVF. La obtención de ad-MVF del tejido adiposo murino es un procedimiento sencillo con unos pocos pasos críticos. Ratones muestran diferentes subcutáneo y los depósitos de grasa intraabdominal. Como se ha descrito anteriormente para las ratas, la fuente de grasa más adecuado para el aislamiento de ad-MVF son las almohadillas de grasa del epidídimo debido a su tamaño, estructura homogénea y una contaminación mínima con los vasos…
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos por la excelente asistencia técnica de Janine Becker, Caroline Bickelmann y Ruth Nickels. Este estudio fue financiado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG – Fundación Alemana de Investigación) – LA 2682 / 7-1.
1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |