Summary
Se presenta un protocolo para aislar fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo que representan unidades de vascularización prometedores. Se pueden aislar rápidamente, no requieren en el procesamiento vitro y, por tanto, puede ser utilizado para prevascularization de un solo paso en diferentes campos de la ingeniería de tejidos.
Abstract
Una red microvascular funcional es de importancia fundamental para la supervivencia y la integración de construcciones de tejido de ingeniería. Para este fin, se han establecido varias estrategias angiogénicos y prevascularization. Sin embargo, la mayoría de los enfoques basados en células incluyen pasos que consumen tiempo in vitro para la formación de una red microvascular. Por lo tanto, no son adecuados para los procedimientos de un solo paso intraoperatorias. fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo (AD-MVF) representan unidades de vascularización prometedores. Ellos pueden ser fácilmente aisladas de tejido graso y exhiben una morfología de microvasos funcional. Por otra parte, volver a montar rápidamente en nuevas redes microvasculares después de la implantación in vivo. Además, ad-MVF han demostrado inducir la linfangiogénesis. Por último, son una fuente rica de células madre mesenquimatosas, que pueden contribuir además a su alto potencial de la vascularización. En estudios previos se ha demostrado la notable vascularizatien la capacidad de ad-MVF en sustitutos de hueso y piel de ingeniería. En el presente estudio, se presenta en un protocolo estandarizado para el aislamiento enzimático de ad-MVF de tejido adiposo murino.
Introduction
La ingeniería de tejidos se centra en la fabricación de tejidos y órganos sustitutos que mantener, restaurar o aumentar la función de inoperable en homólogos in vivo 1, 2. El destino de las construcciones de ingeniería tisular depende fundamentalmente de una vascularización adecuada 3. Redes microvasculares dentro de estas construcciones deben ser organizados jerárquicamente con arteriolas, capilares y vénulas para permitir la perfusión de la sangre eficiente después de inosculation a la vasculatura 4 del destinatario. La generación de este tipo de redes es uno de los desafíos clave en la ingeniería de tejidos. Para este fin, un amplio espectro de estrategias de vascularización experimentales se ha introducido en las últimas dos décadas 5, 6.
enfoques angiogénicos estimulan el crecimiento interno de microvasos los destinatarios de forma TISS ingenieríaues por medio de modificación andamiaje estructural o fisicoquímicas, tales como la incorporación de factores de crecimiento 7. Sin embargo, para la vascularización de las grandes construcciones tridimensionales, las estrategias dependientes de la angiogénesis están marcadamente limitados por bajas tasas de crecimiento de desarrollo de microvasos 8.
Por el contrario, el concepto de prevascularization apunta a la generación de redes microvasculares funcionales dentro del tejido construye antes de su implantación 9. Prevascularization convencional implica el co-cultivo de células formadoras de vasos, tales como células endoteliales, células murales o células madre 10, dentro de andamios. Después de la formación de la red microvascular, las construcciones prevascularizados entonces se pueden implantar en los defectos del tejido. Digno de mención, este enfoque prevascularization es difícil de aplicar en un entorno clínico, ya que se basa en la compleja y lenta in vitro </ em> los procedimientos que se encuentran restringidos por los principales obstáculos regulatorios 9. En consecuencia, todavía hay una necesidad para el desarrollo de nuevas estrategias prevascularization que son más adecuados para una amplia aplicación clínica.
Tal estrategia prevascularization puede ser la aplicación de los fragmentos de microvasculares derivadas de tejido adiposo (ad-MVF). ad-MVF representan unidades de vascularización potentes que pueden ser cosechados en grandes cantidades desde el tejido graso de ratas 11, 12 y 13 ratones. Se componen de arteriolar, capilar, y segmentos de vasos venulares, que exhiben una morfología de microvasos fisiológica con un lumen y la estabilización de células perivasculares 14, 15. Esta característica única permite la implantación inmediata de andamios ad-MVF cabeza de serie en defectos de tejidos sin cultivo previo. Allí, el ad-MVF volver a montar rápidamente ena las redes microvasculares funcionales. Además, ad-MVF representan una fuente rica de células madre mesenquimales 16, que pueden contribuir adicionalmente a su capacidad regenerativa llamativo. En consecuencia, ad-MVF se utilizan cada vez más en diferentes campos de la ingeniería de tejidos 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
El aislamiento de ad-MVF originalmente se ha establecido en ratas 11, 12. En este documento, se describe un protocolo, que permite el aislamiento normalizado de murino ad-MVF de almohadillas de grasa del epidídimo. Esto puede proporcionar más conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la función ad-MVF mediante el uso de modelos de ratones transgénicos.
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Protocol
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud directrices para el uso de animales de experimentación y siguieron las directrices institucionales (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Alemania).
1. Preparación de instrumentos quirúrgicos
- Mantener listas las tijeras de disección, fórceps quirúrgicos, tijeras pequeñas de preparación, unas pinzas finas y una placa de Petri estéril con medio de Eagle modificado de 15 ml Dulbecco (DMEM; 10% de suero de ternera fetal (FCS), 100 U / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina ) para la recolección de las almohadillas de grasa del epidídimo.
- Exponer los instrumentos quirúrgicos a una solución desinfectante durante 5 min. Alternativamente, esterilizarlos (esterilización con vapor; 121 ° C, 20 min).
2. Animales y anestesia
- Elegir con cuidado la cepa de los ratones como se indica para el estudio y la sujeto bajo investigación.
NOTA: En este estudio se utilizó de tipo salvaje C57BL ratones macho / 6 como donantes para la recolección de grasa del epidídimo. De interés, ad-MVF puede ser también aislado de transgénicos proteína verde fluorescente (GFP) -positivos animales donantes (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Esto tiene la gran ventaja de que los fragmentos son fácilmente detectables por tinción inmunohistoquímica de GFP después de la implantación en ratones de tipo salvaje GFP-negativo 14. - Anestesiar a los animales con una inyección intraperitoneal de xilazina (15 mg / kg) y ketamina (75 mg / kg). Asegúrese de que los animales se anestesiaron profundamente mediante la realización de una pizca dedo del pie sin respuesta. lubricante ojo no se indica como los animales donantes se sacrifican después de la cosecha de grasa.
NOTA: Asegúrese de que la analgesia y la esterilidad quirúrgica están de acuerdo con las directrices respectivas del país e institución donde se planifican los experimentos.
- Transferir el animal a un mesa de operaciones. Colocar el animal en posición supina bajo un estereomicroscopio quirúrgico y confirmar anestesia profunda utilizando pizca dedo del pie.
- Inmovilizar las patas con cinta adhesiva a un paño quirúrgico y desinfectar el abdomen con solución desinfectante.
- Separar la piel abdominal libre de la capa muscular subyacente con las tijeras de disección.
- Realizar una laparotomía media con las tijeras de disección y lateralmente desplegar las solapas de la pared abdominal.
- Bilateralmente identificar testículo, epidídimo y la almohadilla de grasa del epidídimo usando las pinzas finas (Figura 1). No hagan daño a las estructuras intestinales para evitar la contaminación fecal de las almohadillas de grasa.
- Cosechar las almohadillas de grasa del epidídimo con las pequeñas tijeras de preparación y las pinzas finas bajo el microscopio estereoscópico. Mantener un margen de seguridad de varios mm entre el epidídimo y la grasa sereducir el riesgo de la cosecha del epidídimo accidental.
NOTA: Este procedimiento también puede realizarse sin un microscopio estereoscópico. Sin embargo, esto puede aumentar aún más el riesgo de lesiones accidentales del epidídimo y cordón espermático. - Transferencia de las almohadillas de grasa del epidídimo en una placa Petri que contiene 15 ml de DMEM pre-calentado a 37 ° C para el transporte al laboratorio de células.
- Sacrificio del animal por incisión de la aorta abdominal o dislocación cervical.
4. Aislamiento de ad-MVF
- Preparar tres placas de Petri estériles con 15 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), tubos estériles de polipropileno de 14 ml (PP), un 50-ml matraz de Erlenmeyer estéril, tubos cónicos de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y tijeras finas esterilizados.
- Lavar las almohadillas de grasa tres veces en placas de Petri con 15 ml de PBS bajo una campana de flujo laminar.
- La transferencia de la grasa en un tubo de 14 ml PP. Determinar el volumen de tejido graso cosechado (en ml) por medio de tél escala tubo. Picar el tejido graso mecánicamente con las tijeras finas hasta que se obtiene una suspensión de tejido homogéneo.
- Transferir el tejido picado con dos volúmenes de colagenasa NB4G (0,5 U / ml PBS) en un matraz de 50 ml Erlenmeyer por medio de 10 ml de medición pipeta. El volumen total se convierte en tres veces el volumen de tejido de grasa medida en la etapa 4.3. Realizar la digestión del tejido en una incubadora durante 10 min bajo agitación vigorosa por medio de un agitador automático (tamaño de la barra de agitación magnética: 25 mm) a 37 ° C y las condiciones atmosféricas humidificado con un 5% de CO2.
- Observar una pequeña fracción (10 l) del tejido digerido bajo un microscopio para juzgar si la digestión se puede detener. Determinar que el digestato contiene principalmente "libre" ad-MVF al lado de las células individuales, lo que indica el punto apropiado para detener el proceso de digestión enzimática (Figura 2).
NOTA: Este paso requiere experiencia con el procedimiento y es fundamental para la calidadde aislado ad-MVF. Prolongada resultados digestión de las grasas en una suspensión de una sola célula sin ad-MVF. - Neutralizar la enzima con dos volúmenes de PBS / 20% de FCS. El volumen total se convierte en tres veces el volumen de la suspensión de células de los vasos en el paso 4.4. Transferir la suspensión celular del vaso de nuevo en nuevos tubos de PP.
- Incubar la suspensión durante 5 min a 37 ° C para separar ad-MVF de grasa restante por la gravedad. A continuación, retire con cuidado el sobrenadante principal de grasa con una pipeta de precisión de 1 ml. Repita este ciclo varias veces con una pipeta de precisión de 100 l hasta que la suspensión parece estar libre de grasa.
- Coloque un filtro de 500 micras en la parte superior de un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Transferir la suspensión celular de vasos con una pipeta de medición de 10 ml a partir de los 14 ml tubos de PP sobre la membrana de filtro para eliminar restante coágulos de grasa. Transferir la suspensión se filtró en nuevos tubos de 14 ml de PP de acuerdo con el número de individuales ad-MVF aísla para los experimentos planificados.
NOTA: Porque en vitro ensayos centrados en la formación de la red microvascular, puede ser beneficioso para purificar adicionalmente la suspensión celular del vaso para mejorar la calidad de imagen durante los análisis microscópicos. Para este propósito, la suspensión puede ser, además, se filtró una vez con un filtro de 20 micras para eliminar las células individuales de la ad-MVF recogidos en el filtro. - Centrifugar la suspensión de células de los vasos (600 xg, 5 min, temperatura ambiente) para obtener un pellet que contiene ad-MVF.
- Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante hasta que 1 se deja mL. Resuspender el precipitado con ad-MVF en este 1 ml y transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga cónica 1,5-mL.
- Centrifugar la suspensión ad-MVF en el tubo de microcentrífuga (600 xg, 5 min) para obtener un pellet.
- Eliminar el sobrenadante para resuspender el sedimento en el volumen final requerido de PBS / 20% de FCS.
NOTA: El número de ad-MVF por aislamiento puede ser evaluada por recuento microscópico. Para este propósito, 1/10 de la célula-vesse definitival suspensión se diluye 1:10 en PBS y 100 l de esta dilución se transfieren a un pocillo de una placa de 96 pocillos. El número entero de ad-MVF que exhibe una morfología recipiente-como se después se contaron y se extrapoló a todo el aislado. La concentración y la purificación ad-MVF requerida se pueden adaptar individualmente a la respectiva aplicación in vitro o in vivo de la ad-MVF en. Esto puede incluir la incorporación de ad-MVF en geles de colágeno para el análisis in vitro de la formación de la red microvascular o la siembra de ad-MVF en andamios para la implantación in vivo en defectos de tejidos.
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Representative Results
En el presente estudio hemos realizado seis procedimientos de aislamiento ad-MVF con el tejido de grasa de 7 a 12 meses de edad, de tipo salvaje macho C57BL / 6 ratones (peso corporal medio: 35 ± 1 g). La Figura 1 ilustra la recolección de las almohadillas de grasa del epidídimo murino con posterior aislamiento mecánica y enzimática ad-MVF. El tiempo requerido para la recolección de grasa fue de 30 min y para el aislamiento de ad-MVF fue de 120 min. En total, el procedimiento se llevó 150 min.
Se cosecharon 1,2 ± 0,1 ml de tejido adiposo por animal donante. Esta cantidad de grasa permitió el aislamiento de 42.000 ± 2.000 ad-MVF por ml. La longitud media de la aislado ad-MVF fue de 42 ± 1 m (Figura 2A). La duración de la digestión enzimática se determinó por medio de un control microscópico como se muestra en la Figura 2B. ad-MVF exhibió una morfología de microvasos típico con Ves jerárquicossegmentos SEL (Figura 2C).
Tenemos, además, caracteriza la ad-MVF por medio de citometría de flujo. Para este propósito, ad-MVF se digirió adicionalmente en solución desprendimiento de células durante 30 min en células individuales 15. Los análisis de citometría de flujo reveló que ad-MVF contiene 26 ± 2% de células CD31-positivas endoteliales, 17 ± 2% α-actina de músculo liso (SMA) células perivasculares positivas, y 9 ± 1% de células positivas para el marcador de células madre mesenquimales CD117 (Figura 3A-C). Después de sembrar en un sustituto de la piel dérmica, que se fijó y se seccionó de inmediato para los análisis histológicos, más grande ad-MVF se localiza principalmente en la superficie del implante (Figura 3D). Sin embargo, los segmentos de los vasos capilares también podrían ser detectados dentro de sus poros. La tinción inmunohistoquímica de sembrado ad-MVF reveló una configuración adicional de microvasos fisiológica con arteriolar, venulary fragmentos similares a capilares (Figura 3E).
Figura 1: ad-MVF aislamiento. A) Después de la laparotomía de la línea media, se identifican las almohadillas de grasa del epidídimo (asteriscos). El tejido adiposo se cosecha con una pequeña tijera de preparación y el animal se sacrificó por incisión de la aorta abdominal (punta de flecha). B) picado mecánico de las almohadillas de grasa con tijeras finas hasta que la suspensión de tejido aparece homogénea. C) Para la digestión enzimática, se añade colagenasa a la suspensión de tejido. D) Se incuba la suspensión de células de los vasos y la capa grasa sobrenadante se desecha. E) Después de la centrifugación, el sedimento que contiene ad-MVF se resuspende y se puede utilizar para diferentes aplicaciones, tales como el análisis in vitro de Microvascformación de la red ular o la siembra de ad-MVF en andamios para la implantación in vivo en defectos de tejido (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Características morfológicas de ad-MVF. A) Distribución de la longitud de recién aisladas ad-MVF. Media ± error estándar de la media (n = 6). B) Imagen microscópica de un frotis de suspensión de células de los vasos con grande (flecha), (flechas dobles de tamaño mediano) y pequeñas (puntas de flecha negras) ad-MVF, así como células individuales (puntas de flecha blanca). Barra de escala = 110 m. Mayor aumento revela que ad-MVF exhiben una morfología de microvasos madura con segmentos de microvasos jerárquica (C,
Figura 3: citometría de flujo, histológico y características inmunohistoquímicas de ad-MVF. AC) Flujo de análisis de citometría de recién aisladas ad-MVF ilustra CD31-positivo de las células endoteliales (A),-SMA-positivo α celular perivascular (B) y las fracciones CD117-positivo de células madre mesenquimales (C). controles apropiados isotipo idéntico se utilizaron para ajustar los niveles de umbral. Media ± error estándar de la media (n = 6). D) con hematoxilina y eosina sección manchados de un sustituto de la piel dérmica cabeza de serie. Unos segmentos de vasos capilares se encuentran en el implante y# 39; s poros (puntas de flecha). microvasos más grandes con venular (doble flecha) o la morfología arteriolar (flecha) se localizan en su superficie. Barra de escala = 40 m. línea discontinua = frontera implante. E) Caracterización de ad-MVF por medio de la detección inmunohistoquímica de la marcador de células endoteliales CD31 (rojo) y el marcador de células perivasculares α-SMA (verde). Los núcleos celulares se tiñeron con un colorante fluorescente de unión a ADN (azul). Arteriolar ad-MVF (flecha) se caracterizan por una capa de células α-SMA-positivas más grueso en comparación con venular fragmentos con un lumen de mayor tamaño (doble flecha). Puntas de flecha = capilar ad-MVF. Barra de escala = 25 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio se presenta un protocolo bien establecido para el aislamiento de ad-MVF. La obtención de ad-MVF del tejido adiposo murino es un procedimiento sencillo con unos pocos pasos críticos. Ratones muestran diferentes subcutáneo y los depósitos de grasa intraabdominal. Como se ha descrito anteriormente para las ratas, la fuente de grasa más adecuado para el aislamiento de ad-MVF son las almohadillas de grasa del epidídimo debido a su tamaño, estructura homogénea y una contaminación mínima con los vasos sanguíneos más grandes 11, 12. Por el contrario, los depósitos de grasa subcutáneos en ratones son mucho más pequeños y más adherente al tejido circundante. Sin embargo, la escisión de las almohadillas de grasa del epidídimo asume el riesgo de lesión accidental del epidídimo y cordones espermáticos, resultando en la contaminación del tejido recogido con espermatozoides. Por lo tanto, la identificación de epidídimo, testículos y cordones espermáticos es de gran importancia en este procedimiento. Por otra parte, las almohadillas de grasa deben ser rapidly procesa después de la cosecha para minimizar el daño tisular ex vivo. Por último, se debe considerar que existen grandes variaciones dependientes de la edad en la vascularización de las almohadillas de grasa del epidídimo murino 23. En nuestra experiencia, el uso de ratones donantes machos de 6 a 12 meses de edad proporciona cantidades suficientes de ad-MVF para in vitro y en estudios in vivo. Sin embargo, también puede ser posible aislar ad-MVF de ratones más jóvenes, que exhiben almohadillas de grasa más pequeñas pero altamente vascularizados 24.
La digestión enzimática de las almohadillas de grasa del epidídimo cosechadas determina decisivamente la calidad final del aislado ad-MVF. Demasiado breve exposición a la colagenasa conduce a la separación incompleta de ad-MVF de los adipocitos de los alrededores. Por otra parte, los resultados de digestión prolongados en la destrucción de ad-MVF a una suspensión de células, la fracción vascular denominado estroma (SVF). El SVF es un heterogéneo m población de células que contienecélulas esenchymal madre, células endoteliales, pericitos, macrófagos y muchos otros tipos de células con potencial de regeneración a través de mecanismos paracrinos y diferenciación 25. El uso de ad-MVF presenta ventajas considerables en comparación con los enfoques basados en SVF. La morfología de los microvasos totalmente funcional de ad-MVF permite su implantación inmediata para los experimentos in vivo sin que consume tiempo y complejo en cultivo in vitro. Por otra parte, el aislamiento del SVF por lo general requiere la digestión del tejido con colagenasa hasta 90 min 26. En contraste, la degradación del tejido no debe exceder de 10 min para el aislamiento de ad-MVF. Esto apoya la idea de intraoperatorios aplicaciones de un solo paso de ad-MVF 9. Para este propósito, ad-MVF se puede aislar de forma automática desde lipoaspirates autólogas y se transfiere de nuevo en un defecto de tejido del paciente sin salir de la sala de operaciones. Este es un realista Goal considerando el hecho de que el aislamiento automatizado de SVF de lipoaspirates ya es un procedimiento clínicamente establecida en la cirugía plástica 27, 28, 29.
Recientemente, hemos demostrado un fuerte efecto de ad-MVF en la vascularización in vivo del hueso 14 y la piel 15 sustitutos. De interés, hemos encontrado que es beneficioso no para eliminar las células individuales de la ad-MVF aislar, ya que pueden proporcionar un entorno más fisiológico que contribuye a la alta capacidad de vascularización de ad-MVF 13. Por lo tanto, que sólo se utiliza un filtro de 500 micras durante el aislamiento de ad-MVF para la eliminación de coágulos no digeridos de grasa más grandes. Por otra parte, se encontró que ad-MVF inducir linfangiogénesis en la piel implantado sustituye 15. Por lo tanto, ad-MVF también puede ser prometedor bloques de construcción para lymphatla ingeniería de tejidos ic y la terapia de linfedema.
Para la traducción con éxito de estos hallazgos experimentales en la práctica clínica, el siguiente paso lógico es para aclarar si el tejido adiposo humano es igualmente adecuado para el aislamiento de ad-MVF como grasa de roedores. En este contexto, un tema crítico es la cantidad de grasa necesaria para aislar grandes cantidades de ad-MVF. El presente documento describe el protocolo dio lugar a aproximadamente 40.000 ad-MVF por tejido graso mL. Por consiguiente, sería necesario 3 ml tejido graso a prevascularize 1 cm 2 de dérmica sustituto de la piel 15. Por lo tanto, este enfoque puede no ser factible para el tratamiento de las heridas más grandes o pacientes gravemente enfermos debido a una cantidad limitada de tejido de grasa disponible para el aislamiento ad-MVF.
Además de un amplio espectro de potencial en aplicaciones in vivo en ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, ad-MVF también son adecuados para el modelado in vitro de proc angiogénicoeses. Por ejemplo, rata ad-MVF han sido cultivadas en hidrogeles de colágeno tridimensionales para estudiar la formación de nuevas redes microvasculares 30. Enfoques similares se han utilizado para evaluar sofisticadas técnicas de imagen para la visualización de crecimiento de neovasos 13 o remodelación de la matriz intersticial durante la angiogénesis 31.
Tomados en conjunto, estos hallazgos indican que ad-MVF no sólo son prometedores vascularización y unidades lymphangiogenic para futuras estrategias terapéuticas, sino también para la investigación básica en el campo de la angiogénesis y la fisiología vascular.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos por la excelente asistencia técnica de Janine Becker, Caroline Bickelmann y Ruth Nickels. Este estudio fue financiado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Fundación Alemana de Investigación) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
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