Summary
Мы представляем протокол для выделения полученных из жировой ткани фрагменты микрососудистой, которые представляют собой перспективные единицы васкуляризации. Они могут быть быстро изолированы, не требуют обработки в лабораторных условиях и, таким образом, могут быть использованы для одностадийного prevascularization в различных областях тканевой инженерии.
Abstract
Функциональная сеть микрососудов имеет ключевое значение для выживания и интеграции инженерных конструкций ткани. Для этой цели были созданы несколько кровеносных сосудов и prevascularization стратегии. Тем не менее, большинство клеток на основе подходов включают в себя трудоемкую пробирке шагов для формирования сети микрососудов. Таким образом, они не пригодны для интраоперационных одношаговыми процедур. Полученных из жировой ткани микрососудистых фрагментов (Ad-MVF) представляют собой перспективные единицы васкуляризации. Они легко могут быть выделены из жировой ткани и обладают функциональной морфологии микрососудов. Кроме того, они быстро собрать в новые микрососудистых сети после имплантации в естественных условиях. Кроме того, объявление-MVF было показано, чтобы вызвать лимфангиогенез. И, наконец, они являются богатым источником мезенхимальных стволовых клеток, которые могут дополнительно способствовать их высокому потенциалу васкуляризации. В предыдущих исследованиях мы показали замечательную vascularizatiпо мощности ад-м.ф. в сконструированных костей и кожи заменителя. В настоящее исследовании мы сообщаем о стандартизированном протоколе для ферментативного выделения ад-м.ф. из мышиной жировой ткани.
Introduction
Тканевая инженерия фокусируется на изготовлении тканей и органов заменителей , которые поддерживают, восстанавливают или усиливают функцию неработоспособных в естественных условиях аналогов 1, 2. Судьба инженерных конструкций ткани в решающей степени зависит от адекватной васкуляризации 3. Микрососудистые сети внутри этих конструкций должны быть организованы иерархически , с артериол, капилляров и венул , чтобы обеспечить эффективное кровоснабжение после сращивания на сосудистую систему получателя 4. Поколение таких сетей является одной из ключевых проблем в тканевой инженерии. Для этого, широкий спектр экспериментальных стратегий васкуляризации было введено за последние два десятилетия 5, 6.
Ангиогенные подходы стимулируют прорастание микрососудов реципиентов в сконструированный TISSЕЭС посредством структурной модификации или физико - химической строительных лесов, таких как включение факторов роста 7. Тем не менее, для васкуляризации больших трехмерных конструкций, зависимого от ангиогенеза стратегия заметно ограничена медленными темпами роста развивающихся микрососудов 8.
В противоположность этому , понятие prevascularization стремится к генерации функциональных микрососудистых сетей в пределах ткани конструкций до их имплантации 9. Обычное prevascularization включает совместное культивирование сосудов , образующие клетки, такие как эндотелиальные клетки, Mural клетки или стволовые клетки 10, в пределах каркасов. После образования микрососудистой сети, то prevascularized конструкция может быть затем имплантирована в тканевые дефекты. Стоит отметить, что этот подход prevascularization трудно применять в клинических условиях, так как она основана на сложной и трудоемкой в пробирке </ EM> процедуры, которые ограничены основными регулирующими барьерами 9. Соответственно, все еще существует необходимость в разработке новых стратегий prevascularization, которые более пригодны для широкого клинического применения.
Такая стратегия prevascularization может быть применение полученных из жировой ткани микрососудистых фрагментов (Ad-MVF). ад-MVF представляют собой мощные васкуляризации единицы , которые могут быть собраны в больших количествах из жировой ткани крыс 11, 12 и 13 мышей. Они состоят из артериол, капилляром и венул сегментов сосудов, которые обладают физиологической морфологии микрососудов с просветом и стабилизирующих периваскулярных клеток 14, 15. Эта уникальная функция позволяет сразу же имплантацию рекламы MVF посеяны подмостей в тканевые дефекты без precultivation. Там, объявление-MVF быстро собрать вфункциональные микрососудистые сети. Кроме того, объявления-MVF представляет собой богатый источник мезенхимальных стволовых клеток 16, которые могут дополнительно способствовать их поразительной регенерационной способности. Соответственно, ад-MVF все шире используются в различных областях тканевой инженерии , 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
Изоляция ад-м.ф. первоначально была создана у крыс 11, 12. Здесь мы опишем протокол, который позволяет стандартизированную изоляцию мышиного ада-м.ф. из придатка жировых. Это может обеспечить более полное представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе функции ад-MVF с помощью трансгенных моделей мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с Национальным институтом здравоохранения руководящих принципов для использования подопытных животных и следовали институциональные рекомендации (Landesamt für Soziales, Gesundheit унд Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- унд Veterinärwesen, Zentralstelle, Саарбрюккен, Германия).
1. Подготовка Хирургические инструменты
- Хранить готовые к рассечение ножницами, хирургические щипцы, маленькие ножницы подготовка, тонких щипцов и стерильную чашку Петри с модифицированной среде Eagle 15 мл Дульбекко (DMEM, 10% фетальной сыворотки теленка (FCS), 100 ед / мл пенициллина, 0,1 мг / мл стрептомицина ) для уборки придатка жировых отложений.
- Expose хирургических инструментов дезинфицирующего раствора в течение 5 мин. В качестве альтернативы, стерилизовать их (стерилизации паром; 121 & deg; С, 20 мин).
2. Животные и анестезиологии
- Тщательно выбирайте штамм мышей, как указано для исследования и предмет под следствием.
Примечание: В данном исследовании мы использовали мужской дикого типа C57BL / 6 мышей в качестве доноров для сбора придатка жира. Представляет интерес, ад-MVF также могут быть выделены из трансгенных зеленого флуоресцентного белка (GFP) -позитивных животных - доноров (C57BL / 6-TG (CAG-EGFP) , 1Osb / J) 22. Это имеет основное преимущество , что фрагменты можно было легко обнаружить с помощью иммуногистохимического окрашивания GFP после имплантации в GFP-негативного мышей дикого типа 14. - Обезболить животных внутрибрюшинной инъекции ксилазина (15 мг / кг) и кетамина (75 мг / кг). Убедитесь в том, что животные глубоко под наркозом, выполняя носок щепотку без ответа. Глаза смазка не указывается в качестве донора животных умерщвляют после жира уборки.
Примечание: Убедитесь, что обезболивание и хирургическая стерильность находится в согласии с соответствующими руководящими принципами страны и учреждением, где планируются эксперименты.
- Передача животных на операционном столе. Поместите животное в положении лежа на спине под хирургическим стереоскопическим и подтверждает глубокую анестезию с помощью ног крайнего случая.
- Зафиксировать лапы пластыря их к хирургической простыне и дезинфицировать живот с дезинфицирующим раствором.
- Отделить кожи живота свободное от основной мышечный слой с рассечение ножницами.
- Выполните срединную лапаротомию с рассечением ножницами и в боковом направлении разворачиваться закрылки брюшной стенки.
- В двусторонний идентификации семенника, придатков и придаток жировой ткани с помощью тонких щипцов (рисунок 1). Не обижайте кишечные структуры для предотвращения фекального загрязнения жировых подушечек.
- Урожай придатка жировых подушечек с маленькими ножницами подготовки и тонким пинцетом под стереоскопическим. Держите запас прочности несколько мм между придатком и жиромуменьшить риск случайной уборки придатка.
Примечание: Эта процедура также может быть выполнена без стереомикроскопа. Однако, это может также увеличить риск случайной травмы придатка и семенных канатиков. - Передача придатка жировых отложений в чашку Петри, содержащую 15 мл DMEM, предварительно нагревают при температуре 37 ° С для транспортировки в лабораторию клеток.
- Жертвоприношение животных путем разреза брюшной аорты или цервикальной дислокации.
4. Выделение объявления-м.ф.
- Подготовьте три стерильные чашки Петри с 15 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), стерильные 14-мл полипропилен (ПП) трубы, стерильную 50-мл колбу Эрленмейера, стерильные 1,5-мл коническую микроцентрифужных пробирки и стерилизовали тонких ножниц.
- Вымойте жировые отложения трижды в чашки Петри с 15 мл PBS при ламинарном потоке.
- Перенести жир в трубку 14-мл PP. Определить объем заготовленной жировой ткани (в мл) с помощью тон трубка масштаб. Фарш жировой ткани механически с мелкими ножницами, пока не будет получена однородная суспензия ткани.
- Передача измельченной ткани с двумя объемами коллагеназы NB4G (0,5 ед / мл PBS) в колбу на 50 мл-Эрленмейера с помощью 10-мл пипетки измерения. Общий объем становится в три раза объем жировой ткани, измеренной на этапе 4.3. Выполните пищеварение ткани в инкубаторе в течение 10 мин при интенсивном перемешивании с помощью автоматизированной мешалки (размера магнитной мешалки: 25 мм) при 37 ° С и увлажненными атмосферными условиями с 5% CO 2.
- Заметим, небольшую фракцию (10 мкл) переваренной ткани под микроскопом, чтобы судить, может ли быть остановлен пищеварение. Удостовериться в том, что сброженный содержит в основном «свободный» ад-MVF рядом отдельных клеток, что указывает соответствующую точку , чтобы остановить процесс ферментативного расщепления (рисунок 2).
Примечание: Этот шаг требует опыта с процедурой и имеет решающее значение для качестваизолированных ад-MVF. Продолжительные жира результаты пищеварения в виде одной клеточной суспензии без ад-м.ф.. - Нейтрализовать фермент с двумя объемами PBS / 20% FCS. Общий объем становится в три раза объем суспензии клеток сосудов на этапе 4.4. Передача суспензии клеток сосудов обратно в новые полипропиленовые пробирки.
- Инкубируйте суспензии в течение 5 мин при 37 ° C, чтобы отделить ад-MVF от оставшегося жира под действием силы тяжести. Затем осторожно удалить основной жир супернатант с точностью пипеткой 1 мл. Повторите этот цикл несколько раз с точностью пипетки 100 мкл, пока суспензия не кажется, обезжиренный.
- Поместите фильтр на 500 мкм на вершине 50-мл конической центрифужной пробирки. Передача суспензии клеток сосудов с измерительной пипеткой 10 мл из 14-мл полипропиленовых пробирок на мембрану фильтра, чтобы удалить остатки жира сгустки. Передача фильтрованной суспензии в новые пробирки 14 мл ПП в соответствии с количеством индивидуального рекламным-м.ф. изолирует для запланированных экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: в ВИТРO анализы с упором на формировании микрососудистой сети, могут быть полезными для дальнейшей очистки суспензии клеток сосудов для улучшения качества изображения во время микроскопических анализов. Для этого, суспензия может быть дополнительно фильтруют один раз с фильтром 20 мкм, чтобы удалить отдельные клетки из ад-м.ф., собранных на фильтре. - Центрифуга суспензии клеток сосудов (600 XG, 5 мин, при комнатной температуре), чтобы получить осадок, содержащий ад-MVF.
- После центрифугирования, удалить супернатант до 1 мл не осталось. Ресуспендирует осадок с ад-м.ф. в этом 1 мл и переносят суспензию в 1,5-мл конической центрифужной пробирки.
- Центрифуга суспензии ад-MVF в микроцентрифужных трубки (600 XG, 5 мин), чтобы получить осадок.
- Удалить супернатант, чтобы ресуспендируют осадок в требуемом конечном объеме PBS / 20% FCS.
Примечание: Количество объявлений-м.ф. на изолята может быть оценено с помощью микроскопического подсчета. Для этой цели, 1/10 конечной клеточной Vesseл суспензию разбавляют в соотношении 1:10 в PBS и 100 мкл этого раствора переносят в лунку 96-луночного планшета. Весь количество ад-м.ф. демонстрируя сосуд-подобную морфологию затем подсчитывали и экстраполированы на всю изолята. Требуемая концентрация и очистка ад-MVF может быть адаптирована к соответствующему в пробирке или в естественных условиях применения ад-м.ф.. Это может включать вложение ад-м.ф. в коллагеновых гелях для анализа в пробирке формирования микрососудистой сети или высева ад-м.ф. на каркасы для имплантации в естественных условиях в тканевые дефекты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящем исследовании мы провели шесть процедур изоляции ад-MVF с жировой ткани от 7- до 12-месячного мужчины дикого типа C57BL 6 мышей (средний вес тела: 35 ± 1 г) /. На рисунке 1 показана заготовка мышиных придатка жировых с последующей механической и ферментативной изоляцией ад-MVF. Время, необходимое для сбора жира составляло 30 мин, а для изоляции ад-м.ф. составляло 120 мин. В целом, процедура заняла 150 мин.
Мы собрали 1,2 ± 0,1 мл жировой ткани на животное-донора. Это количество жира допускается выделение 42,000 ± 2,000 ад-м.ф. на мл. Средняя длина изолированной ад-м.ф. составляла 42 ± 1 мкм (фигура 2А). Продолжительность ферментативного расщепления была определена с помощью микроскопического управления , как показано на фигуре 2В. ад-MVF экспонируются типичная морфология микрососудов с иерархическими VESсегменты (рис SEL 2C).
Мы дополнительно характеризовали ад-MVF с помощью проточной цитометрии. С этой целью рекламы MVF дополнительно переваривается в откреплении клеток раствора в течение 30 мин в 15 отдельные клетки. Проточной цитометрии анализ показал, что ад-MVF содержит 26 ± 2% CD31-положительных эндотелиальные клетки, 17 ± 2% альфа-актин гладких мышц (SMA) -положительные периваскулярные клетки и 9 ± 1% клеток положительных для стволовых клеток мезенхимального маркера CD117 (Фигура 3А-С). После посева на замену кожная сыпь, которая была фиксированной и секционного немедленно для гистологических анализов, больше рекламы MVF в основном локализованы на поверхности имплантата (рисунок 3D). Тем не менее, капиллярные сегменты сосудов, также могут быть обнаружены в пределах своих пор. Иммуногистохимическое окрашивание посеяна ад-м.ф. дополнительно показали физиологическую конфигурацию микрососудов с артериол, венули капиллярные-подобных фрагментов (рис 3E).
Рисунок 1: рекл-MVF изоляции. A) После срединной лапаротомии эпидидимальном жира колодки (звездочки) идентифицируются. Жировая ткань собирают с маленькими ножницами подготовки и животное забивали путем разрезом брюшной аорты (стрелка). В) Механические мясорубки из жировой ткани с тонкими ножницами до суспензии ткани выглядит гомогенной. C) Для ферментативного расщепления, коллагеназы добавляют к суспензии ткани. D) Суспензию клеток сосудов инкубируют и супернатант жировой слой отбрасывают. Е) После центрифугирования осадок , содержащие ад-MVF ресуспендируют и могут использоваться для различных применений, таких как анализ в пробирке microvascформирование улар сети или высев ад-м.ф. на каркасы для имплантации в естественных условиях в тканевые дефекты (F). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Морфологические характеристики ад-м.ф.. А) Распределение Длина свежевыделенных ад-м.ф.. Среднее ± стандартная ошибка среднего (п = 6). Б) Микроскопическое изображение клеток сосудов подвески мазка с большим (стрелка), средние (двойные стрелки) и малые (черные стрелки) ад-MVF, а также отдельные клетки (белые стрелки). Шкала бар = 110 мкм. Более высокое увеличение показывает , что ад-MVF выставка зрелых микрососудов морфология с сегментами иерархических микрососудов (C,
Рисунок 3: Поток Cytometric, гистологическая и иммуногистохимическая Характеристика ад-м.ф.. АС) поток цитометрия анализа свежевыделенной ад-м.ф. , иллюстрирующий CD31-позитивные клетки эндотелия (А), α-SMA-позитивные клетки периваскулярные (B) и CD117-положительные мезенхимальные стволовые клетки (С) фракциями. Соответствующие изотипу идентичные элементы управления были использованы для корректировки пороговых уровней. Среднее ± стандартная ошибка среднего (п = 6). D) гематоксилин и эозин окрашенного участок с затравкой заменителя дермальных кож. Несколько сегментов капилляра расположены в имплантат &# 39, S поры (стрелка). Большие микрососуды с венул (двойная стрелка) или артериол (стрелка) морфологии локализованы на его поверхности. Шкала бар = 40 мкм. Пунктирная линия = имплант границы. Е) Характеристика ад-м.ф. с помощью иммуногистохимического обнаружения эндотелиальных клеток маркеров CD31 (красного) и периваскулярного клеточного маркера a-SMA (зеленый). Ядра клеток окрашивали с ДНК-связывающим флуоресцентным красителем (синим). Артериол ад-MVF (стрелка) характеризуется более толстой α-SMA-положительным слоем клеток по сравнению с венулярными фрагментами с большим просветом (двойная стрелкой). Наконечники = капиллярная ад-MVF. Шкала бар = 25 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании мы представляем устоявшийся протокол для выделения ад-м.ф.. Получение ад-MVF из мышиной жировой ткани является простой процедурой с нескольких важных шагов. Мыши проявляют различные подкожные и внутрибрюшные жировые отложения. Как было описано выше для крыс, наиболее подходящий источник жира для изоляции ад-м.ф. являются придатка жира колодки из - за их размеров, однородной структуры и минимального загрязнения с крупными кровеносными сосудами 11, 12. В противоположность этому, подкожные жировые отложения у мышей значительно меньше и прилипает к окружающей ткани. Тем не менее, удаление придатка жировым несет риск случайного повреждения придатка и семенных канатиков, что приводит к загрязнению заготовленной ткани с спермой. Таким образом, идентификация придатка, семенника и семенных канатиков имеет большое значение в этой процедуре. Кроме того, жировые отложения должны быть rapidlу обработано после сбора урожая , чтобы минимизировать экс вива повреждения тканей. Наконец, следует учитывать , что существует значительные возрастные различия в васкуляризации мышиного придатка жирового 23. По нашему опыту, использование 6- до 12-месячных мышей - доноров мужского пола обеспечивает достаточное количество объявлений-м.ф. для в пробирке и в естественных условиях исследования. Тем не менее, он также может быть возможным , чтобы изолировать ад-MVF от молодых мышей, которые демонстрируют меньшие , но насыщена сосудами жира колодки 24.
Ферментативное переваривание убираемого придатка жировых принципиально определяет конечное качество изолированной ад-м.ф.. Слишком короткая экспозиция к коллагеназе приводит к неполному разделению ад-м.ф. от окружающих адипоцитов. С другой стороны, длительные результаты пищеварения в разрушении ад-м.ф. к суспензии отдельных клеток, так называемый стромальных сосудистая фракция (СФДВ). СФДВ представляет собой гетерогенные клеточную популяцию, содержащие мesenchymal стволовых клеток, эндотелиальные клетки, перициты, макрофаги и многие другие типов клеток с регенеративным потенциалом через паракринные и дифференцировку механизмов 25. Использование ад-м.ф. имеет значительные преимущества по сравнению с подходами SVF основы. Полностью функциональная морфология микрососудов ад-м.ф. позволяет их сразу же имплантацию для экспериментов в естественных условиях без больших затрат времени и комплекса в пробирке культивирования. Кроме того, изоляция SVF обычно требует переваривания ткани с коллагеназой до 90 мин 26. В противоположность этому, деградация ткани не должна превышать 10 мин для выделения ад-м.ф.. Это поддерживает идею интраоперационных одношаговыми применений ад-м.ф. 9. Для этого объявления-MVF может быть автоматически выделен из аутологичных lipoaspirates и переносили обратно в ткани дефекта пациента, не выходя из операционного зала. Это реалистичный гоал , учитывая тот факт , что автоматизированное выделение SVF из lipoaspirates уже является клинически установленная процедура в пластической хирургии 27, 28, 29.
Недавно мы продемонстрировали сильное влияние ад-м.ф. на васкуляризации в естественных условиях костной ткани 14 и кожи 15 заменителей. Интересно, что мы обнаружили , что это выгодно , чтобы не удалить отдельные клетки из ад-м.ф. изолировать, потому что они могут обеспечить более физиологическую среду , которая способствует высокой васкуляризации мощности ад-м.ф. 13. Таким образом, мы использовали только фильтр 500 мкм в процессе выделения ад-м.ф. для удаления более крупных не-переваривается жировых сгустков. Кроме того, мы обнаружили , что ад-MVF индуцирует лимфангиогенез в имплантированной коже заменяет 15. Следовательно, ад-MVF также может быть перспективным строительные блоки для lymphatтканевая инженерия микросхемы и лимфедема терапия.
Для успешного перевода этих экспериментальных результатов в клиническую практику, следующий логический шаг является выяснение того, в равной степени подходит для изоляции ад-м.ф. как грызун жира из жировой ткани человека. В связи с этим важным вопросом является количество жира, необходимое для выделения большого количества объявлений-м.ф.. Описанный здесь протокол привело к приблизительно 40000 ад-MVF на мл жировой ткани. Соответственно, 3 мл жировой ткани будет необходима prevascularize 1 см 2 кожи заменителя дермальных 15. Следовательно, этот подход не может быть возможным для лечения больших ран или серьезно больных пациентами из-за ограниченный объем доступной жировой ткани для рекламы MVF изоляции.
Помимо широкого спектра потенциала в естественных условиях применения в тканевой инженерии и регенеративной медицине, рекламы MVF также подходит для моделирования в пробирке ангиогенного ргосаEsses. Например, крысы ад-MVF культивировали в трехмерный коллагеновых гидрогелях изучить образование новых капиллярных сетей 30. Аналогичные подходы были использованы для оценки сложных методов визуализации для визуализации роста neovessel 13 или интерстициальной матрица ремоделирования во время ангиогенеза 31.
Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что ад-MVF не только перспективные васкуляризации и lymphangiogenic единиц для будущих терапевтических стратегий, но и для фундаментальных исследований в области ангиогенеза и сосудистой физиологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны за отличную техническую помощь Джанин Беккера, Кэролайн Бикельманн и Рут Никелс. Это исследование финансировалось за счет гранта Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Немецкий фонд исследований) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
