Summary
Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.
Abstract
Uma rede microvascular funcional é de importância crucial para a sobrevivência e integração de construções de tecido de engenharia. Para isso, várias estratégias angiogênicos e prevascularization foram estabelecidas. No entanto, a maioria das abordagens com base em células in vitro incluem passos que consomem tempo para a formação de uma rede microvascular. Assim, eles não são adequados para procedimentos de uma etapa intra-operatórios. Adiposos fragmentos microvasculares derivadas de tecido (ad-MVF) representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser facilmente isolados a partir de tecido gordo e exibem uma morfologia de microvasos funcional. Além disso, eles rapidamente remontar em novas redes microvasculares após implantação in vivo. Além disso, ad-MVF foram mostrados para induzir linfangiogênese. Finalmente, eles são uma fonte rica de células-tronco mesenquimais, que pode ainda contribuir para o seu alto potencial de vascularização. Em estudos anteriores que demonstraram a vascularizati notávelna capacidade de ad-MVF em substitutos ósseos e pele de engenharia. No presente estudo, são descritos em um protocolo padronizado para o isolamento enzimático de ad-MVF de tecido adiposo murino.
Introduction
A engenharia de tecidos centra-se na fabricação de tecidos e de órgãos substitutos que manter, aumentar ou restaurar a função de inoperável em homólogos in vivo 1, 2. O destino de construções de engenharia de tecidos depende essencialmente uma vascularização adequada 3. Redes microvasculares dentro dessas construções devem ser hierarquicamente organizado com arteríolas, capilares e vênulas para permitir perfusão sanguínea eficiente após inosculation a vasculatura do destinatário 4. A geração de tais redes é um dos principais desafios em engenharia de tecidos. Para isso, um amplo espectro de estratégias de vascularização experimentais foi introduzido ao longo das últimas duas décadas 5, 6.
abordagens angiogénicos estimular o crescimento de microvasos em receptores tiss engenhariaues por meio de modificação estrutural andaime ou físico-químicas, tais como a incorporação de factores de crescimento 7. No entanto, a vascularização de grandes construes tridimensionais, estratégias dependentes da angiogénese são marcadamente limitados por baixas taxas de crescimento de microvasos a desenvolver 8.
Em contraste, o conceito de prevascularization tem como objectivo para a geração das redes microvasculares funcionais dentro do tecido constrói antes da sua implantação 9. Prevascularization convencional envolve a co-cultura de células formadoras de vasos, tais como células endoteliais, células mural ou células-tronco 10, dentro de andaimes. Após a formação da rede microvascular, as construções prevascularized pode então ser implantado num defeitos de tecidos. Contudo, tal abordagem prevascularization é difícil de aplicar em um ambiente clínico, porque se baseia no complexo e demorado in vitro </ em> procedimentos, que são restritos por grandes obstáculos regulatórios 9. Por conseguinte, existe ainda uma necessidade para o desenvolvimento de novas estratégias prevascularization que são mais adequados para uma aplicação clínica ampla.
Tal estratégia prevascularization pode ser a aplicação de fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo (ad-MVF). ad-MVF representam unidades de vascularização potentes que podem ser colhidas em grandes quantidades a partir do tecido adiposo de ratos 11, 12 e 13 ratinhos. Eles consistem de arteríolas, capilares, e segmentos de vasos venulares, que exibem uma morfologia de microvasos fisiológico com um lúmen e estabilizantes células perivasculares 14, 15. Esta característica única permite a implantação imediata de andaimes ad-MVF-semeado em defeitos de tecido sem pré-cultura. Lá, o ad-MVF remontar rapidamente ema redes microvasculares funcionais. Além disso, ad-MVF representam uma rica fonte de células-tronco mesenquimais 16, que pode ainda contribuir para a sua capacidade de regeneração impressionante. Por conseguinte, ad-MV F são cada vez mais utilizado em diferentes campos da engenharia de tecidos 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
O isolamento de ad-MVF foi estabelecida originalmente em ratos 11, 12. Aqui, nós descrevemos um protocolo, que permite o isolamento padronizado de murino ad-MVF de almofadas de gordura epididimal. Isto pode facilitar uma melhor compreensão sobre os mecanismos moleculares subjacentes à função de ad-MVF usando modelos de ratinhos transgénicos.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde para o uso de animais de laboratório e seguindo as orientações institucionais (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Alemanha).
1. Preparação de Instrumentos Cirúrgicos
- Manter prontas as tesouras de dissecação, pinças cirúrgicas, uma tesoura pequena de preparação, uma pinça fina e uma placa de Petri estéril com meio de Eagle modificado por 15 ml de Dulbecco (DMEM, 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 U / mL de penicilina, 0,1 mg / mL de estreptomicina ) para a colheita de almofadas de gordura epididimal.
- Expor os instrumentos cirúrgicos para uma solução desinfectante para 5 min. Alternativamente, esterilizá-los (esterilização a vapor; 121 ° C, 20 min).
2. Animais e Anestesia
- Escolher cuidadosamente a estirpe de ratinhos, tal como indicado para o estudo e o assunto sob investigação.
Nota: Neste estudo foi utilizada macho de tipo selvagem ratinhos C57BL / 6 como dadores para a colheita de gordura epididimal. De interesse, ad-MVF pode ser também isolado a partir de transgénicos proteína fluorescente (GFP) animais dadores -positivas verdes (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Isto leva a grande vantagem de que os fragmentos são facilmente detectáveis por coloração imuno-histoquímica de GFP após a implantação em ratinhos de tipo selvagem GFP-negativo 14. - Anestesiar os animais com uma injecção intraperitoneal de xilazina (15 mg / kg) e cetamina (75 mg / kg). Certifique-se de que os animais estão profundamente anestesiados através da realização de uma pitada dedo do pé sem resposta. lubrificante olho não é indicada como os animais dadores são sacrificados após a colheita de gordura.
NOTA: Certifique-se de que a analgesia e esterilidade cirúrgica estão de acordo com as respectivas diretrizes do país e instituição onde estão previstos os experimentos.
- Transferir o animal a uma mesa de operação. Colocar o animal em decúbito dorsal sob uma lupa cirúrgica e confirmar anestesia profunda usando toe pitada.
- Imobilizar as patas gravando-los para um campo cirúrgico e desinfectar o abdome com solução desinfetante.
- Separar a pele abdominal livre da camada muscular subjacente com a tesoura de dissecção.
- Executar uma laparotomia na linha média com as tesouras de dissecação e lateralmente desdobrar as abas da parede abdominal.
- Bilateralmente identificar testículo, epidídimo e a gordura epididimal usando os fórceps finos (Figura 1). Não prejudicar as estruturas intestinais para evitar a contaminação fecal das bolsas de gordura.
- Colher as almofadas de gordura epididimal com as pequenas tesouras de preparação e as pinças finas sob o microscópio estereoscópico. Manter uma margem de segurança de vários mm entre o epidídimo e a gordurareduzir o risco de colheita epididimal acidental.
NOTA: Este procedimento também pode ser realizado sem um microscópio estereoscópico. No entanto, isto pode aumentar ainda mais o risco de lesão acidental do epidídimo e cabos espermático. - Transferir as almofadas de gordura epididimal em uma placa de Petri contendo 15 ml de DMEM pré-aquecida a 37 ° C durante o transporte para o laboratório de células.
- Sacrificar o animal por incisão da aorta abdominal ou luxação cervical.
4. Isolamento de ad-MVF
- Prepare três placas de Petri estéreis com 15 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), estéril de polipropileno de 14 mL tubos (PP), uma de 50 mL estéril, Erlenmeyer estéreis de 1,5 ml cónico de tubos de microcentrífuga e tesouras finas esterilizados.
- Lavam-se as almofadas de gordura três vezes em placas de Petri com 15 mL de PBS sob uma câmara de fluxo laminar.
- Transferir a gordura para um tubo de 14 mL PP. Determinar o volume de tecido adiposo colhido (em ml), por meio de tele escala tubo. Picar o tecido adiposo mecanicamente com as tesouras finas, até uma suspensão de tecido homogénea.
- Transferir o tecido triturado com dois volumes de colagenase NB4G (0,5 U / mL de PBS) em um balão de 50 mL Erlenmeyer por meio de 10 mL de medição pipeta. O volume total torna-se três vezes o volume de tecido adiposo medida no passo 4.3. Realizar a digestão do tecido em um incubador durante 10 min, sob agitação vigorosa por meio de um agitador automatizado (tamanho da barra de agitação magnética: 25 mm) a 37 ° C e as condições atmosféricas húmida com 5% de CO 2.
- Observar uma pequena fracção (10 pL) do tecido digerido sob um microscópio para julgar se a digestão pode ser parada. Verificar que o digerido contém principalmente "livre" ad-MVF lado de células individuais, indicando o ponto apropriado para interromper o processo de digestão enzimática (Figura 2).
NOTA: Este passo exige experiência com o procedimento e é fundamental para a qualidadede isolado ad-MVF. Prolongada resultados digestão de gordura em uma suspensão de uma única célula, sem ad-MVF. - Neutraliza-se a enzima com dois volumes de PBS / FCS a 20%. O volume total torna-se três vezes o volume da suspensão de células-vaso no passo 4.4. Transferir a suspensão de células-vaso de volta para novos tubos PP.
- Incubar a suspensão durante 5 minutos a 37 ° C para separar ad-MVF de gordura restante por gravidade. Em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante principal gordura com uma pipeta de precisão, 1-mL. Repetir este ciclo várias vezes com uma pipeta de precisão de 100 uL até a suspensão parece ser isento de gordura.
- Colocar um filtro de 500? M por cima de um tubo de centrífuga cónico de 50 ml. Transferir a suspensão de células-embarcação com uma pipeta de medição de 10 ml dos 14 ml tubos PP na membrana de filtro para remover o restante coágulos de gordura. Transferir a suspensão filtrada para novos tubos de 14 mL de PP de acordo com o número de individual ad-MVF isolados para as experiências planeadas.
NOTA: Para em vitrO ensaios de focagem sobre a formação da rede microvascular, pode ser benéfico para purificar ainda mais a suspensão de células-navio para melhorar a qualidade da imagem durante a análises microscópicas. Para este fim, a suspensão pode ser, adicionalmente, uma vez filtrada com um filtro de 20 mícrons para remover as células individuais do ad-MVF recolhidas no filtro. - Centrifugar a suspensão de células-reservatório (600 xg, 5 min, temperatura ambiente) para obter um pelete contendo ad-MVF.
- Após centrifugação, remove-se o sobrenadante até 1 ml é deixado. Ressuspender o sedimento com ad-MVF neste 1 mL e transferir a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml cónico.
- Centrifugar a suspensão ad-MV F no tubo de microcentrífuga (600 xg, 5 min) para obter um pelete.
- Remover o sobrenadante para ressuspender o sedimento no volume final requerido de PBS / FCS a 20%.
NOTA: O número de ad-MVF por isolado pode ser avaliada por contagem microscópica. Para esta finalidade, 1/10 da célula-vesse definitival suspensão foi diluída a 1:10 em PBS e 100 ul desta diluição é transferida para um poço de uma placa de 96 poços. Todo o número de ad-MVF exibindo uma morfologia vaso semelhante é então contado e extrapolado para todo o isolado. A concentração ad-MVF necessário e a purificação pode ser adaptado individualmente ao respectivo in vitro ou in vivo de aplicação do ad-MVF. Isto pode incluir a incorporação de ad-MVF em géis de colagénio para a análise in vitro de formação de rede microvascular ou a semeadura de ad-MVF em andaimes para implantação in vivo em defeitos de tecidos.
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Representative Results
No presente estudo foi realizada seis procedimentos de isolamento ad-MVF com tecido adiposo a partir de 7- ao macho de tipo selvagem de 12 meses de idade C57BL 6 ratinhos / (peso corporal médio: 35 ± 1 g). A Figura 1 ilustra a colheita das almofadas de gordura epididimal de murino com subsequente isolamento mecânico e enzimática ad-MVF. O tempo necessário para a colheita de gordura foi de 30 minutos e para o isolamento de ad MV F foi de 120 min. No total, o processo levou 150 minutos.
Colhemos 1,2 ± 0,1 ml de tecido adiposo por animal dador. Esta quantidade de gordura permitiu o isolamento de 42000 ± 2000 ad-MVF por mL. O comprimento médio do isolado ad-MV F foi de 42 ± 1 um (Figura 2A). A duração da digestão enzimática foi determinada através de um controlo microscópico como se mostra na Figura 2B. ad-MV F exibiram uma morfologia típica de microvasos com ves hierárquicossegmentos sel (Figura 2c).
Nós também caracterizou o ad-MVF por meio de citometria de fluxo. Para esta finalidade, ad-MVF foram ainda digeridas em solução de separação celular durante 30 min em células individuais 15. As análises de citometria de fluxo revelou que ad-MVF contém 26 ± 2% de células CD31-positivas endoteliais, 17 ± 2% actina de músculo liso-α (SMA) células perivasculares -positivas, e células de 9 ± 1% positivas para o marcador de células estaminais mesenquimais CD117 (Figura 3A-C). Após sementeira em um substituto de pele dérmica, o qual foi fixada e seccionados imediatamente para análises histológicas, maior ad-MVF estavam localizados principalmente na superfície do implante (Figura 3D). No entanto, os segmentos dos vasos capilares também poderiam ser detectados dentro dos seus poros. a coloração imuno-histoquímica de semeadas ad-MVF revelou configuração adicional de microvasos fisiológico com arteriolar, venulare fragmentos semelhantes a capilares (Figura 3E).
Figura 1: ad-MVF isolamento. A) Após laparotomia na linha média, as almofadas de gordura epididimal (asteriscos) estão identificados. O tecido adiposo é colhida com uma pequena tesoura de preparação e o animal é sacrificado por incisão da aorta abdominal (ponta de seta). B) picagem mecânica das almofadas de gordura com tesouras finas, até a suspensão de tecido parece homogénea. C) Para a digestão enzimática, a colagenase é adicionada à suspensão de tecido. D) A suspensão de células é incubada-vaso e a camada sobrenadante de gordura é descartado. E) Depois da centrifugação, o sedimento contendo ad-MVF é ressuspenso e pode ser utilizado em diferentes aplicações, tais como a análise in vitro de Microvasca formação da rede ular ou a semeadura de ad-MVF em andaimes para implantação in vivo em defeitos de tecidos (F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: características morfológicas de ad-MVF. A) Comprimento de distribuição isolada de fresco ad-MVF. Média ± erro padrão da média (n = 6). B) Imagem microscópica de um esfregaço de suspensão de células-recipiente com grande (seta), (setas duplas de tamanho médio) e pequenas (pontas de seta pretas) ad-MV F, bem como células individuais (pontas de seta brancas). Barra de escala = 110 pm. Maior ampliação revela que exibem ad-MVF uma morfologia de microvasos maduro com segmentos de microvasos hierárquica (C,
Figura 3: Citometria de Fluxo, características histológicas e imuno-histoquímica de ad-MVF. CA) Fluxo de análises de citometria de isolado de fresco ad-MVF ilustrando CD31-positivo das células endoteliais (A), α-SMA positivos célula perivascular (fracções de células estaminais mesenquimais CD117-positivo (C) B) e. controlos de isotipo-idênticas apropriadas foram utilizados para ajustar os níveis de limiar. Média ± erro padrão da média (n = 6). D) e hematoxilina-eosina secção corada de um substituto de pele dérmica semeado. Alguns segmentos de vasos capilares estão localizados no implante &# 39; s poros (setas). microvasos maiores com venular (seta dupla) ou arteriolar (seta) morfologia está localizada na sua superfície. Escala da barra = 40 m. linha quebrada = fronteira implante. E) Caracterização de ad-MV F por meios de detecção imunohistoquímica do marcador celular endotelial CD31 (vermelho) e o marcador de culas perivasculares α-SMA (verde). núcleos de células foram marcadas com um corante fluorescente de ligação ao ADN (azul). ad-MVF (seta) arteriolar são caracterizadas por uma camada de células α-SMA positivos mais espessa quando comparada com venular fragmentos com um lúmen de maiores dimensões (seta dupla). Pontas de seta = ad-MVF capilar. Escala da barra = 25 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo apresentamos um protocolo bem estabelecido para o isolamento de ad-MVF. Obtenção ad-MVF do tecido adiposo murino é um procedimento simples com alguns passos críticos. Os ratinhos exibem diferentes subcutânea e depósitos de gordura intra-abdominais. Como anteriormente descrito para os ratos, a fonte de gordura mais adequado para o isolamento de ad-MV F são as almofadas de gordura epididimal devido ao seu tamanho, estrutura homogénea e contaminação mínima com os vasos sanguíneos maiores 11, 12. Em contraste, os depósitos de gordura subcutânea em ratinhos são muito menores e mais aderentes ao tecido circundante. No entanto, a excisão de bolsas de gordura epididimais suporta o risco de lesão acidental do epidídimo e cabos espermáticas, resultando na contaminação do tecido colhido com espermatozóides. Portanto, a identificação do epidídimo, testículo e cabos espermáticas é de grande importância neste procedimento. Além disso, as bolsas de gordura deve ser rapidly processadas após a colheita para minimizar ex vivo danos nos tecidos. Finalmente, deve-se considerar que existem grandes variações dependentes da idade na vascularização do epidídimo murino bolsas de gordura 23. Na nossa experiência, a utilização de ratinhos dadores do sexo masculino com 6 a 12 meses de idade fornece quantidades suficientes de ad-MVF para in vitro e estudos in vivo. No entanto, também pode ser possível isolar ad-MV F de ratos mais jovens, os quais exibem almofadas de gordura mais pequenas mas altamente vascularizados 24.
A digestão enzimática das bolsas de gordura do epidídimo colhidas crucialmente determina a qualidade final do isolado ad-MVF. Muito curta exposição a colagenase leva à separação incompleta de ad-MVF dos adipócitos circundantes. Por outro lado, a digestão prolongado resulta na destruição de ad-MVF para uma suspensão de células individuais, a fracção vascular chamado estroma (SVF). O SVF é uma população de células heterogénea contendo mcélulas esenchymal estaminais, células endoteliais, pericitos, macrófagos e muitos outros tipos de células com potencial de regeneração através parácrinos e diferenciação mecanismos 25. O uso de ad-MVF apresenta vantagens consideráveis quando comparadas com as abordagens baseadas em SVF. A morfologia de microvasos totalmente funcional de ad-MVF permite a sua implantação imediata para experiências in vivo, sem demorado e complexo de cultivo in vitro. Além disso, o isolamento do SVF geralmente requer a digestão do tecido com colagenase até 90 min 26. Em contraste, a degradação do tecido não deve exceder os 10 minutos para o isolamento de ad MVF. Isto apoia a ideia de aplicações intra-operatórias de uma etapa de ad-MVF 9. Para este fim, ad-MVF pode ser automaticamente isolado lipoaspirates autólogos e transferido de volta para um defeito do tecido do paciente sem sair da sala de cirurgia. Esta é uma goa realistal, considerando o facto do isolamento automatizado de SVF de lipoaspirates já é um procedimento clinicamente estabelecido em cirurgia plástica 27, 28, 29.
Recentemente, temos demonstrado um forte efeito de ad-MVF na vascularização in vivo do osso 14 e da pele 15 suplentes. De interesse, descobrimos que é benéfico não para remover as células individuais do ad-MVF isolar, porque eles podem proporcionar um ambiente mais fisiológico que contribui para a alta capacidade de vascularização do ad-MVF 13. Portanto, apenas utilizado um filtro de 500? M durante o isolamento de ad-MVF para a remoção de coágulos não digerido de gordura maiores. Além disso, descobrimos que linfangiogênese ad-MVF induzir em pele implantado substitui 15. Assim, ad-MVF também podem ser promissores blocos de construção para lymphatic a engenharia de tecidos e terapia de linfedema.
Para a tradução bem sucedida destes resultados experimentais para a prática clínica, o próximo passo lógico é para esclarecer se tecido adiposo humano é igualmente adequado para o isolamento de ad-MVF como gordura roedor. Neste contexto, uma questão crítica é a quantidade de gordura necessário para isolar grandes quantidades de ad-MVF. O protocolo aqui descrito resultou em aproximadamente 40.000 ad-MVF por tecido adiposo mL. Por conseguinte, 3 mL tecido adiposo seria necessário para prevascularize de 1 cm2 de pele dérmica substituto 15. Assim, esta abordagem pode não ser viável para o tratamento de feridas maiores ou doentes gravemente doentes, devido a uma quantidade limitada de tecido de gordura disponível para isolamento ad-MVF.
Ao lado de um amplo espectro de potencial em aplicações in vivo em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, ad-MV F também são adequados para modelar in vitro de proc angiogénicocessos. Por exemplo, rato ad-MVF foram cultivadas em três dimensões hidrogéis de colágeno para estudar a formação de novas redes microvasculares 30. Abordagens semelhantes foram usadas para avaliar técnicas de imagem sofisticado para a visualização de crescimento neovessel 13 ou remodelação da matriz intersticial 31 durante a angiogénese.
Tomados em conjunto, estes resultados indicam que ad-MVF não são apenas prometendo vascularização e unidades linfangiogênicas para futuras estratégias terapêuticas, mas também para a pesquisa básica no campo da angiogênese e fisiologia vascular.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Somos gratos pela excelente assistência técnica de Janine Becker, Caroline Bickelmann e Ruth Nickels. Este estudo foi financiado por uma concessão do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Fundação Alemã de Pesquisa) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
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